Questa pubblicazione è stata sostenuta dalla Carolina del Sud Clinical &amp; Translational Research (SCTR) Institute, con una casa accademico presso la Medical University of South Carolina, NIH / NCATS Concessione Numero UL1 TR000062. Ulteriore supporto è stato fornito da premio di merito VA BX002327-01 a DRM. DJH è stato sostenuto da NIH / NCATS Concessione Numero TL1 TR000061 e dal NIH di Grant Numero T32 GM008716. SEA è stato sostenuto da NIH di Grant Numero T32 HL07260.

Tutte le procedure qui elencati sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso la Medical University of South Carolina. Gli esperimenti qui descritti sono acute, esperimenti non di sopravvivenza. Come tale, non c&#39;è uso di unguento occhio e una suite operatoria sterile non è necessaria. L&#39;eutanasia si ottiene dissanguamento durante la raccolta del cuore. Preparazione 1. sperimentale <ol><li> Impostare sia una pressione costante o costante flusso Langendorff Perfusion Apparatus 4. </li><li> Preparare 4 L di Krebs modificato Henseleit Buffer (in mM: 112 NaCl, KCl 5, 1.2 MgSO4, 1 K 2 HPO 4, 1.25 CaCl 2, 25 NaHCO3, 11 D-glucosio, 0.2 acido ottanoico, pH = 7,4). <ol><li> Fai 10x azionari buffer. <ol><li> Sciogliere NaCl, KCl, MgSO 4, e K 2 HPO 4 a 3 litri di acqua ultrapura. </li><li> Sciogliere CaCl 2 in 500 ml di acqua ultrapura with 40 ml di 1 N HCl. </li><li> Aggiungere lentamente CaCl 2 soluzione al buffer realizzato in 1.2.1.1. Aggiungere acqua ultrapura abbastanza per un totale di 4 L. Consenti a mescolare per 1 ora prima di filtrare attraverso un filtro di 0,8 micron. Conservare a 4 ° C. </li><li> Sciogliere NaHCO 3 a 4 litri di acqua ultrapura. Lasciare a mescolare per 1 ora prima di filtrare attraverso a 0.8 micron filtro. Conservare a 4 ° C </li></ol></li><li> Unire 400 ml 10x tampone Krebs Henseleit con 400 ml 10x NaHCO 3 buffer. Aggiungere acqua ultrapura abbastanza per un totale di 4 L. Sciogliere glucosio e acido ottanoico mescolando. Filtrare 0,8 micron filtro. </li></ol></li><li> Sistema di Preparazione per il cuore. <ol><li> Aggiungere 2 L di tampone filtrata in una bottiglia 4 L 38 disposto sopra il rubinetto attaccato alla cannula aortica. Ciò fornirà una pressione di perfusione di 70-80 mmHg al cuore, che è la pressione di perfusione raccomandata 4. </li><li> Inserire gas dispersione gorgogliatore nel buffer nella bottiglia. </li><li> Eseguire il buffer attraverso il sistema, avendo cura di eliminare eventuali bolle dall&#39;interno del tubo. </li><li> Accendere gas (95% O 2/5% CO 2) almeno 30 minuti prima cuore è da collocare sul sistema. Utilizzare una sonda flusso di gas e analizzatore di gas del sangue per verificare la saturazione di ossigeno. </li></ol></li><li> Preparare scorte chirurgiche e pallone. <ol><li> Per la raccolta di cuore, preparare un paio di forbici chirurgiche 6,75 &quot;, un paio di forbici 4.5&quot;, due paia di hemostats, due set di pinze CaraMalto, due siringhe con 27 aghi G, 2 pezzi di 0-misuratore sutura di seta (su 15 cm di lunghezza), una cannula spinato 1/16 di pollice, e una cannula tracheale. </li><li> Per assemblare cannula tracheale, incollare un breve pezzo di tubo del diametro di plastica 1/16 di pollice a un connettore a Y. </li><li> Per assemblare apparato palloncino: inserire un ago sonda gastrica per un pezzo di tubo 1/16 di pollice, quindi collegare il tubo di alloggiamento trasduttore di pressione. Una piccola siringa collegata all&#39;altro lato della tr pressioneansducer alloggiamento consentirà l&#39;inflazione e la deflazione del palloncino. <ol><li> Tagliare un quadrato di plastica dell&#39;involucro e luogo punta di un ago sonda gastrica al centro. Avvolgere l&#39;involucro di plastica intorno all&#39;ago sonda gastrica. </li><li> Riempire palloncino con soluzione salina e legare con due punti di sutura. Gonfiare palloncino per assicurarsi che non ci siano perdite. Il volume di soluzione salina all&#39;interno del palloncino gonfiato dovrebbe essere circa 200 ml, ma può variare a seconda delle dimensioni del ratto. </li><li> In alternativa, utilizzare un lettino dito lattice al posto della pellicola trasparente. Posizionare gavage ago all&#39;interno dito culla, riempire con soluzione salina e legare. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Raccolta cuore <ol><li> Trattenere un ratto Sprague Dawley utilizzando un decapicone o altro sistema di vincolo manuale. Pesare topo. </li><li> Somministrare ketamina / miscela xylazina (0,85 mg / kg di ketamina e 0,15 mg / kg xilazina) tramite iniezione intraperitoneale per anestetizzare ratto. Questa dose di anestetico fornirà anestesia sufficienti per20-40 min, ma la procedura dovrebbe essere completata il più rapidamente possibile dopo anestesia è confermato. </li><li> Verificare il corretto livello di anestesia da test punta pizzico reflex. </li><li> Tracheotomia <ol><li> Rimuovere pelle da metà zampa a base di mascella, utilizzando hemostats per elevare Pelt e forbici per fare incisione. Mantenere la trippa elevata per separarlo dal muscolo sottostante, permettendo di tagliare lungo la trippa e rimuoverlo. </li><li> Utilizzando hemostats, sollevare il tessuto ghiandolare e fare una incisione orizzontale a fascia inferiore al tessuto ghiandolare. Utilizzare hemostats per diffondere incisione aperta, facendo attenzione a non intaccare le vene giugulari. </li><li> Utilizzando hemostats, pizzico muscolo sovrastanti la trachea, e con le forbici fare una incisione trasversale nel muscolo appena sotto la punta delle hemostats. Utilizzando hemostats, si sviluppa il tessuto oltre a rivelare trachea. </li><li> Inserire con cautela hemostats sotto la trachea, la compensazione fascia mentre procedendo delicatamente avanzamento e riavvolgimento emostatici. </li><li>Una volta hemostats sono collocati con successo dietro la trachea, un pizzico 0-0 sutura di seta con hemostats e hemisect la trachea con un piccolo paio di forbici affilate. </li><li> Inserire cannula tracheale nella trachea hemisected, tirare di sutura dietro la trachea, e legare la sutura intorno alla trachea cannulato, ancorando la sutura alla Y-inguine della cannula con un nodo chirurghi. </li><li> Utilizzando un ago 27 G, iniettare 1.000 U / kg di eparina nella vena giugulare e consentire a circolare per 30 sec. </li></ol></li><li> Toracotomia <ol><li> Rimuovere pelle da metà addome per regione medio-zampe anteriori da pizzicare con hemostats e il taglio con le forbici. </li><li> Fare un ¾ di pollice trasversale un&#39;incisione nella parete muscolare addominale, appena sotto il diaframma. </li><li> Effettuare una incisione verticale sul muro della parete toracica e addominale, taglio lungo lo sterno. </li><li> Tagliare il diaframma posteriore bilateralmente, poi diffuso gabbia toracica per rivelare il cuore, morsetto gabbia toracica con hemostats per assicurare rimane diffusione. </li&gt; <li> Utilizzando hemostats, rimuovere delicatamente il timo, esponendo l&#39;aorta ascendente. </li><li> Tease hemostats attraverso cappio aortica, avanzamento e riavvolgimento hemostats e delicatamente diffusione fascia per consentire punta di hemostats attraverso. </li><li> Utilizzare hemostats per tirare 0-0 sutura di seta dietro dell&#39;aorta ascendente, cravatta di sutura in una mezza piazza nodo allentato. </li><li> Girare rubinetto per avviare il flusso di tampone di perfusione, hemisect aorta e inserire la cannula nel lume aortico immediatamente. Rapidamente cinch un nodo mezzo quadrato e completare il nodo, stringendo a fondo. </li><li> Usare le forbici per sezionare cuore lontano dai grandi vasi, togliere il cuore dal petto e allegare alla colonna di perfusione. </li><li> Troncare tessuto polmonare in eccesso e permette cuore equilibrare su colonna per circa 15 minuti prima dell&#39;inserimento del palloncino. Utilizzare una portata normale di tampone attraverso il cuore di 10-20 ml / min. </li></ol></li></ol> 3. Langendorff perfusione e ischemia riperfusione <ol><li> Posizionamento di LV pressure balloon <ol><li> Sgonfiare pallone durante il rotolamento a forma di cono e girare rubinetto per assicurare pallone rimane sgonfio. </li><li> Excise lasciato atrio con un piccolo paio di forbici per esporre l&#39;accesso alla valvola mitrale. </li><li> Inserire palloncino attraverso atrio sinistro e la valvola mitrale in ventricolo sinistro. </li><li> Avviare il software di controllo della pressione (LabChart Pro). </li><li> Gonfiare pallone aprendo rubinetto e delicatamente crescente quantità di soluzione salina in mongolfiera fino diastolica lettura da micromanometro supera zero. </li><li> Per controllare la risposta lunghezza-tensione, gonfiare palloncino lentamente ad una pressione diastolica di 75 mmHg, sgonfiare lentamente, ripetere una volta. </li><li> Impostare la pressione diastolica di 10 mmHg modulando la quantità di soluzione salina nel pallone. Girare rubinetto per sigillare palloncino a questo livello di inflazione, e di mantenere il sistema di pressione chiuso tra LV palloncino e trasduttore di pressione. </li><li> Lower cuore in riscaldato da camera e coperchio della camera con la plastica. </li></ol></li><li> Annuncioministero della Ischemia riperfusione <ol><li> Inserire il fondo della camera riscaldata e lasciare da camera di riempire con tampone Effused. </li><li> Quando il buffer è sommerso cuore, girare rubinetto per arrestare il flusso di tampone nel cuore, inducendo ischemia globale. Ischemia tempo può variare a seconda degli obiettivi dell&#39;esperimento. </li><li> Dopo 30 min di ischemia, girate rubinetto per ripristinare il flusso di tampone in cuore, iniziando riperfusione. </li><li> Consentire riperfusione del cuore per 1 ora prima di terminare l&#39;esperimento. Utilizzare tempi riperfusione variabili, a seconda degli obiettivi dell&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Cessazione Esperimento e raccolta di tessuto <ol><li> Utilizzando babordo di rubinetto, somministrare 10 ml di tampone fosfato salino a 4 ° C nel cuore ad una velocità di 10 ml / min per arrestare cuore. </li><li> Rimuovere cuore dalla colonna perfusione, tagliare via rimanente tessuto atriale. </li><li> Mettere il cuore in acciaio inox per affettare matrice di tessuto, coprire con Parafilm, e posto a -80 ° C per 8 minuti, o fino a quando il cuore ha una consistenza marshmallow-like. </li><li> Rimuovere blocco dal congelatore e inserire lamette in affettare matrice per tagliare cuore in 2 fette mm. Blocchi tessuto possono essere acquistati anche con i formati fetta altri di 2 mm. </li><li> Rimuovere fette uno alla volta e rilasciare in azoto liquido a lampeggiare congelare per studi biochimici. Conservare la fetta terzo ventricolo dall&#39;apice per infarto colorazione. </li><li> Rimuovere il tessuto da azoto liquido e conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso in esperimenti biochimici. </li></ol></li><li> Infarto colorazione <ol><li> Incubare la terza porzione ventricolare in 10 ml di 1% w / v di cloruro trifeniltetrazolio (TTC) a 37 ° C per 15 min. Nota: L&#39;incubazione in TTC può essere eseguita per 15 o 30 minuti con nessun cambiamento nell&#39;efficacia 15. </li><li> Trasferire fetta tessuto dalla TTC al 10% formalina tamponata e lasciar incubare a temperatura ambiente per una notte. Per ottenere risultati ottimali, sentirets devono essere tolti di formalina e ripreso entro 24 ore 4. </li><li> Fotografia macchiato fetta e l&#39;utilizzo di software come ImageJ per stimare le dimensioni dell&#39;infarto secondo il protocollo del produttore. Fotografare il più presto possibile dopo la fissazione, il colorante sbiadiscono nel tempo. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Isolato Il cuore perfuso di ratto può essere utilizzato con successo per studiare l&#39;effetto di un intervento farmacologico in precondizionamento cardiaco in ischemia riperfusione 9. Tuttavia, ci sono alcuni passaggi essenziali alla procedura che deve essere standardizzato per garantire risultati riproducibili. Il mantenimento di una temperatura di 37,4 ° C all&#39;interno del sistema è critico, in quanto anche lieve ipotermia e ipertermia può causare precondizionamento cardiaco 10,11. Il tempo complessivo che intercorre tra l&#39;iniezione di anestetico alla escissione del cuore deve essere mantenuto al minimo, come l&#39;esposizione prolungata a ketamina può interferire con il precondizionamento cardiaco 12. Cannulazione tempestivo dell&#39;aorta in situ è essenziale per prevenire lo sviluppo di ipossia all&#39;interno del cuore o il dissanguamento dell&#39;animale prima escissione cardiaca. In generale, il tempo dalla prima incisione per la rimozione del cuore non dovrebbe superare 6-8 min essere. I ba ventricolare sinistralloon deve essere verificata la tenuta prima di ogni esperimento, e se necessario sostituirlo. Il sistema deve essere meticolosamente mantenuto, compreso il lavaggio l&#39;intero apparato con acqua distillata dopo ogni corsa e sostituendo tubing logoro se necessario per impedire la perdita o la contaminazione dell&#39;interno del tubo. Il cuore isolato può essere modificato per qualsiasi numero di nuovi usi, compreso imaging di fluorescenza 13, spettroscopia NMR 7, e la mappatura ottico 14 tra molti altri. Il sistema può anche essere modificato per perfusione cuori di diversi animali, tra cui topi. Questa modifica è particolarmente utile in quanto consente di esperimenti utilizzando topi transgenici. Per modificare il sistema di cuori del mouse, più piccolo cannule e una colonna di perfusione più piccolo deve essere utilizzato, oltre ad altre modifiche. Descrizioni dettagliate di come utilizzare il metodo Langendorff per i cuori del mouse sono stati pubblicati altrove 16,17. Altre modifiche diquesto protocollo comprendono la somministrazione di vari farmaci in diversi momenti. Quando indagare la capacità di una sostanza provochi precondizionamento farmacologico o post-condizionamento, è essenziale somministrare il farmaco in momenti diversi in relazione al danno da ischemia riperfusione. Il farmaco può essere somministrato all&#39;animale prima che il cuore è asportato, o miscelato nel buffer sia prima che il cuore è posto sulla colonna o durante la fase ischemica in modo che il farmaco è presente su di riperfusione. In alternativa, un lato-porta può essere utilizzata per somministrare un bolo di farmaco in nessun momento durante il protocollo. Inoltre, il protocollo può essere modificato per cambiare la durata di ischemia, riperfusione, o entrambi. Questo permette l&#39;analisi dei dati funzionali e biochimiche in più punti di tempo e può essere utilizzato per monitorare l&#39;andamento temporale della effetto acuto di un farmaco. Se il periodo di riperfusione è alterato, è importante notare che almeno 60 minuti di riperfusione sono necessario per TTC colorazione a delineare efficacemente nell&#39;area infartuale 15. La limitazione principale del modello cuore isolato in termini di danno da ischemia riperfusione è che non tiene conto di molti dei fattori sistemici che sono presenti in un quadro di ischemia riperfusione in vivo. Questa eliminazione di influenza sistemica deve essere contabilizzato nell&#39;analisi dei dati generati utilizzando il modello Langendorff, ma non esclude la capacità del modello di rispondere alle nuove domande circa la risposta dei miociti, fibroblasti e cellule endoteliali di ischemia e successiva riperfusione. Il modello di cuore isolato permette la manipolazione completa di molte delle variabili che influenzano ischemia riperfusione oltre a analisi in tempo reale degli effetti funzionali sul cuore su intervalli di tempo brevi. I dati generati utilizzando il sistema cuore isolato è prezioso per comprendere il precondizionamento farmacologico o post-condizionamento delcuore in risposta a vari interventi farmaceutiche.

Delucidazione degli eventi di riferimento la risposta cardiaca sia ischemia e riperfusione sono essenziali per migliorare il trattamento di infarto 1 e cardiache procedure chirurgiche che richiedono miocardio clampaggio aortico 2. Mentre i modelli in vivo di ischemia riperfusione consentono analisi endpoint molto utili, essi non sono efficaci per studiare gli effetti funzionali di ischemia riperfusione acutamente in tempo reale. Inoltre, in modelli di ischemia riperfusione vivo producono generalmente significativa variabilità nelle dimensioni dell&#39;infarto e consegna diretta di farmaco al cuore al momento della riperfusione è impegnativo. L&#39;utilizzo di un sistema Langendorff cuore isolato per studiare il danno da ischemia riperfusione permette valutazione funzionale in tempo reale di trattamenti farmacologici, superficie uniforme tessuto infartuato e consegna istantanea di farmaco direttamente al miocardio. Prima descritto by Oscar Langendorff nel 1895 3, il cuore Langendorff isolato è un modello affidabile per lo studio di ischemia riperfusione, essendo stato utilizzato nella ricerca ischemia riperfusione per gli ultimi 40 anni di 4,5. Qui, alcune modifiche sono fatte per ottimizzare il cuore isolato per l&#39;analisi funzionale. In situ incannulamento dell&#39;aorta mentre il cuore batte assicura che il cuore non sperimenta precondizionamento ischemico, tali da modificare i risultati di studi ischemia riperfusione 6. Per facilitare ciò, viene eseguita una tracheotomia, consentendo la ventilazione e garantire la stabilità fisiologica del ratto durante l&#39;intervento chirurgico. Il cuore è poi collegato a un camicia d&#39;acqua colonna tortile vetro attraverso il quale tampone Krebs Henseleit avviene tramite perfusione retrograda direttamente nell&#39;aorta. Un palloncino soluzione salina viene inserita nel ventricolo sinistro e collegato ad un trasduttore di pressione, che consente la misurazione in tempo reale delle pressioni dall&#39;interno un ventricolod calcolo dei molteplici parametri funzionali. Al termine dell&#39;esperimento, cuore viene lavata con soluzione salina fredda per arrestare la contrazione e flash congelati in azoto liquido per consentire l&#39;analisi valle dei livelli di DNA, RNA e proteine. Così modificato, cuore perfuso Langendorff serve come un sistema efficace per il monitoraggio diretto degli effetti fisiologici degli interventi farmacologici in qualsiasi momento acutamente durante il danno da ischemia riperfusione.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>203726</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20765-A7</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Octanoic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2875</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-triphenyltetrazolium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Medical Pressure Transducer</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Peristaltic Pump</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07521-40</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Easy Load Pump Head</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Heated circulating water bath</td><td>Lauda</td><td>M3</td><td></td></tr><tr><td>Tubing Flow Module</td><td>Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>Modular Research Console</td><td>Transonic</td><td>T402</td><td></td></tr><tr><td>Inline flow sensor</td><td>Transonic</td><td>ME2PXN</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab Data Acquisition Device</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>LabChart data acquisition software</td><td>AD Instruments</td><td>MLU60/8</td><td></td></tr></tbody></table>

induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff-perfused rat hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

L&#39;apparato ventricolo sinistro balloon permette il monitoraggio in tempo reale della pressione sviluppata dalle amministrazioni ventricolo sinistro (figura 1). Come descritto in precedenza 7, questa traccia di pressione può essere utilizzata per calcolare molti dei parametri della funzione ventricolare. Questi calcoli possono essere effettuati in fase iniziale nonché la fase di riperfusione, mediati su tracce multiple all&#39;interno di ciascun gruppo, e confrontati per determinare se l&#39;intervento farmacologico provocato precondizionamento cardiaco, come abbiamo fatto in precedenza 9. Una tale parametro è la pressione sviluppata, calcolata come differenza tra la pressione sistolica e la pressione telediastolica. La pressione sviluppata in normali cuori di ratto perfusi può variare da 70 a 130 mmHg (Figura 1A). Dopo un insulto ischemico, la pressione sviluppata viene ridotta e le eleva pressione diastolica estremità (Figura 1B). Quando i topi sonosomministrato un agente precondizionamento noto come la classe I e IIb HDAC inibitore SAHA (vorinostat) 18 prima ablazione del cuore, la riduzione della pressione sviluppata e l&#39;elevazione della fine della pressione diastolica associata con ischemia riperfusione sono attenuate (Figura 1C). Altre misure della funzione ventricolare sinistra, come ad esempio il tasso di generazione di pressione (dP / dt max), il tasso di relax pressione (-dP / dt max), e il prodotto di pressione tasso (RPP) sono disponibili o calcolate dal direttamente uscita software (Figura 2). La fase ischemica può essere monitorato in tempo reale, con l&#39;apparente cessazione di generazione di pressione in pochi minuti di insorgenza di ischemia. Contrazione ischemica può essere monitorato misurando il tempo di comparsa di contrazione e il tempo al picco di contrazione. Trifeniltetrazolio cloruro (TTC) è comunemente usato per distinguere tra un metabolicamentective e tessuti inattive, e viene qui utilizzato per infarto colorazione. Una volta assorbito nel tessuto TTC è diminuito di enzimi metabolici, ruotando il rosso tessuto attivo. Tessuto Inattivo non riduce TTC, e come tale si macchia bianca 8. Langendorff perfusi cuori di ratto, che non sono stati sottoposti al danno ischemico non presentano aree bianche (non mostrate), mentre i cuori sottoposti a ischemia riperfusione mostrano aree sostanziali tinto bianco, indicando tessuto infartuato (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52908/52908fig1.jpg" /> Figura 1: tracce di pressione rappresentativi dal ventricolo sinistro palloncino pressione registrata dal pallone LV sulla contrazione ventricolare.. Hearts non sottoposti a ischemia (A) sperimentano una perdita minore di capacità contrattile nel corso del tempo. Hearts sottoposti a ischemia (B) mostrano immedperdita iate di generazione di pressione, seguito da contrazione tonica. Su riperfusione, questi cuori sperimentano elevata EDP e diminuiti sviluppati pressione. Cuori precondizionati con SAHA e sottoposti a ischemia (C) mostrano un&#39;attenuazione del danno da ischemia riperfusione. N = 1 per gruppo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52908/52908fig2.jpg" /> Figura 2: Calcolato parametri della funzione ventricolare valutari generazione di pressione (A), il tasso di relax pressione (B), la pressione sviluppata (C), e pressione prodotto tasso (D) sono alcuni parametri della funzione ventricolare che possono essere calcolati dal. software di monitoraggio della pressione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52908/52908fig3.jpg" /> Figura 3: colorazione TTC per zona infartuata. </strong&gt; Esempio ventricolare sezione dopo danno da ischemia riperfusione. La linea tratteggiata delinea ventricolo sinistro (LV) da ventricolo destro (RV). Infarto focale è indicato da un&#39;area bianca, mentre il tessuto vitale è indicato dal colore rosso-colorazione.

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Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Induzione e valutazione di ischemia-riperfusione Injury in Langendorff-perfusi Hearts Rat

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

induction-assessment-ischemia-reperfusion-injury-langendorff-perfused

Universidad San Sebastian

Research

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Medicine

22.8K Views.  Medical University of South Carolina. The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

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Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

Infarto acuto del miocardio in topi

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Ricerca

Medicina

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Biologia

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via recanalization of the coronary artery is the most effective strategy for reducing the size of ischemic myocardium. The coronary microvasculature cannot be visualized and imaged&#160;in vivo, but there are several invasive and noninvasive techniques that can be used to assess parameters which depend directly on coronary microvascular function. The endothelial function after ischemia reperfusion can be assessed also at the level of the coronary circulation via the coronary flow reserve (CFR).&#160;In this study, peak velocity of left anterior descending (LAD) coronary arteries was measured in rats in vivo via Transthoracic Doppler Echocardiography during resting and stress challenge (induced by Dobutamine). A normal heart can increase its coronary blood flow up to four times above the resting values during stress induction. Following ischemia reperfusion, we found a significantly diminished CFR, which can be used as a marker of coronary microvascular dysfunction. CFR has opened a window on the importance of microvascular dysfunction and has been shown to predict cardiovascular risk independent of whether the severe obstructive disease is present.

Coronary flow reserve (CFR), is defined as the ratio of maximal coronary blood flow to the resting coronary blood flow. We present a protocol for evaluating CFR in rats via ultrasound, which offers the opportunity to predict cardiovascular risk factors in the absence of obstructive coronary disease.

Valutazione della riserva del flusso coronario dopo la miaocardia Ischemia Reperfusione nei ratti

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

Migliorare la ricerca sulle CVD con la perfusione di Langendorff modificata

Modified Langendorff Perfusion for Extended Perfusion Times of Rodent Cardiac Grafts

Despite important advancements in the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases (CVDs), the field is in urgent need of increased research and scientific advancement. As a result, innovation, improvement and/or repurposing of the available research toolset can provide improved testbeds for research advancement. Langendorff perfusion is an extremely valuable research technique for the field of CVD research that can be modified to accommodate a wide array of experimental needs. This tailoring can be achieved by personalizing a large number of perfusion parameters, including perfusion pressure, flow, perfusate, temperature, etc. This protocol demonstrates the versatility of Langendorff perfusion and the feasibility of achieving longer perfusion times (4 h) without graft function loss by utilizing lower perfusion pressures (30-35 mmHg). Achieving extended perfusion times without graft damage and/or function loss caused by the technique itself has the potential to eliminate confounding elements from experimental results. In effect, in scientific circumstances where longer perfusion times are relevant to the experimental needs (i.e., drug treatments, immunological response analysis, gene editing, graft preservation, etc.), lower perfusion pressures can be key for scientific success.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca cardiovascolare - Tecniche di perfusione di Langendorff su misura per migliorare i risultati sperimentali

This article demonstrates the feasibility of achieving longer perfusion times (4 h) of murine cardiac grafts without function loss by employing lower (30-35 mmHg) than physiological (60-80 mmHg) perfusion pressures during Langendorff.

Perfusione di Langendorff modificata per tempi di perfusione prolungati di innesti cardiaci di roditori

Despite important advancements in the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases (CVDs), the field is in urgent need of increased research and ...

Bioingegneria

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, including ischemia-reperfusion injury (IRI) of extrahepatic organs. This model requires numerous experiments and devices. The duration of anhepatic phase is closely related to the time to develop IRI after transplantation. In this experiment, we used hemodynamic changes to induce extrahepatic organ damage in rats and determined the maximum tolerance time. The time until the most severe organ injury varied for different organs. This method can easily be replicated and can also be used to study IRI of the extrahepatic organs after liver transplantation.

This paper provides a detailed description of how to build an animal model of the anhepatic phase (liver ischemia) in rats to facilitate basic research into ischemia-reperfusion injury after liver transplantation.

Lesione da ischemia-riperfusione dell'organo simulando cambiamenti emodinamici nel modello di trapianto di fegato di ratto

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

Induction of Myocardial Infarction and Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of heart reflow and induce secondary myocardial injury. A simple and reproducible model of myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury is a good tool for researchers. Here, a customizable method to create a myocardial infarction (MI) model and MIRI by precision ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD) through micromanipulation is described. Accurate and reproducible ligature positioning of the LAD helps obtain consistent results for heart injury. ST-segment changes can help to identify model accuracy. The serum level of cardiac troponin T (cTnT) is used to assess the myocardial injury, cardiac ultrasound is employed to evaluate the myocardial systolic function, and Evans-Blue/triphenyl tetrazolium chloride staining is used to measure infarct size. In general, this protocol reduces procedure duration, ensures controllable infarct size, and improves mouse survival.

Here we describe a simple and reproducible method that can induce myocardial infarction or myocardial ischemia-reperfusion injury in mice by precision ligation of the left anterior descending coronary artery through micromanipulation.

Induzione di infarto miocardico e danno da ischemia-riperfusione miocardica nei topi

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of ...

Improved Rodent Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury

Myocardial ischemia and reperfusion injury (MIRI), induced by coronary heart disease (CHD), causes damage to the cardiomyocytes. Furthermore, evidence suggests that thrombolytic therapy or primary percutaneous coronary intervention (PPCI) does not prevent reperfusion injury. There is still no ideal animal model for MIRI. This study aims to improve the MIRI model in rats to make surgery easier and more feasible. A unique method for establishing MIRI is developed by using a soft tube during a key step of the ischemic period. To explore this method, thirty rats were randomly divided into three groups: sham group (n = 10); experimental model group (n = 10); and existing model group (n = 10). Findings of triphenyltetrazolium chloride staining, electrocardiography, and percent survival are compared to determine the accuracies and survival rates of the operations. Based on the study results, it has been concluded that the improved surgery method is associated with a higher survival rate, elevated ST-T segment, and larger infarct size, which is expected to mimic the pathology of MIRI better.

Myocardial ischemia-reperfusion model of rat heart is improved by using a self-made retractor, polyvinyl chloride tube, and a unique knotting method. Electrocardiogram, triphenyltetrazolium chloride and histological staining, and percent survival analysis results showed that the improved model group has higher success and survival rates than the already existing model group.

Modello di roditore migliorato di ischemia miocardica e danno da riperfusione

Myocardial ischemia and reperfusion injury (MIRI), induced by coronary heart disease (CHD), causes damage to the cardiomyocytes. Furthermore, evidence ...

Induzione e valutazione di ischemia-riperfusione Injury in Langendorff-perfusi Hearts Rat

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Infarto acuto del miocardio in topi

Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat

Valutazione della riserva del flusso coronario dopo la miaocardia Ischemia Reperfusione nei ratti

Perfusione di Langendorff modificata per tempi di perfusione prolungati di innesti cardiaci di roditori

Perfusione di Langendorff modificata per tempi di perfusione prolungati di innesti cardiaci di roditori

Perfusione di Langendorff modificata per tempi di perfusione prolungati di innesti cardiaci di roditori

Lesione da ischemia-riperfusione dell'organo simulando cambiamenti emodinamici nel modello di trapianto di fegato di ratto

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Induzione di infarto miocardico e danno da ischemia-riperfusione miocardica nei topi

Modello di roditore migliorato di ischemia miocardica e danno da riperfusione