Name: real-time x-ray imaging of lung fluid volumes in neonatal mouse lung
Uploaded: 2016-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung at JoVE.com

This work is supported by a grant awarded to MNH by Children's Healthcare of Atlanta, the APS 2014 Short-Term Research Education Program to Increase Diversity in Health-Related Research (STRIDE) fellowship awarded to PT, and the University of Notre Dame Integrated Imaging Facility.

Todas as técnicas experimentais devem ser conduzidos de acordo com as diretrizes de Cuidados Institucional e Comitê Use. 1. raios-X Aquisição de Imagem <ol><li> Visão geral do software (veja a Figura 1 para uma visão geral dos parâmetros de software). <ol><li> Selecione o botão de captura diretamente abaixo da guia Arquivo. </li><li> No menu drop-down Configurações, selecione sessão atual. </li><li> Selecione exposição padrão na caixa drop-down localizado sob tempo de exposição. </li><li> Definir o tempo de exposição a 2,00 min, e No. Exposições a 1. Defina o X e Y Binning Binning a 2 pixels. Veja a Figura 1. </li><li> Selecione Acumulação final a partir do menu drop-down Opções de exportação. </li><li> Nas configurações de iluminação, select X-Ray a partir do menu drop-down Illumination Fonte. O padrão KVP é fixado em 35. </li><li> Selecione Autoselect no menu drop-down Aplicar Referência do Arquivo para aplicar o arquivo de referência de raio X correspondente. (Ver secção 2). </li><li> Na câmara definida para configurações, defina o f-stop para 2,51. </li><li> Defina o FOV (campo de visão) para 125,64 para ratos PN10. </li><li> Definir o plano focal a 13, e no menu drop-down ao lado do controle deslizante de plano focal, selecione X-Ray. </li><li> Para raios-X, definir o filtro de excitação eo filtro de emissão a 0 no menu drop-down. </li><li> Salve sessão atual, clicando em Novo no topo ao lado de Configurações. Digite nome para New Adquirir arquivo de configurações, por exemplo, &quot;Jove único evento de exposição para fazer um protocolo.&quot; Ver Figura 2. </li></ol&gt; </li><li> A criação de um protocolo de imagem de raios-X <ol><li> Clique no botão Criar / Editar protocolos no lado direito da janela aberta. </li><li> Como a janela pop-up novo protocolo aparecer, clique no botão Novo no canto superior direito </li><li> Digite o nome que o protocolo vai economizar sob, por exemplo &quot;Jove Demonstração Protocolo&quot; e clique em OK. (Ver Figura 3). </li><li> Na parte inferior da janela pop-up do Protocolo no Protocolo Passos, garantir que Passo 1 é destaque em texto vermelho, captar novas imagens é selecionada, e não fazer nada é selecionado na Antes de Captura de Imagem no menu suspenso. </li><li> Em Captura Ambiente, selecione o evento exposição única recentemente gerado a partir do Passo 1.1.12. </li><li> Selecione Wait (seg) a partir do menu drop-down após a captura da imagem. </li><li> Clique no botão Editar, type 180 na caixa de pop-up e clique em OK para adicionar um tempo de espera 3 min depois de cada aquisição 2 min. </li><li> Duplicar Passo 1, clicando o botão direito no separador Passo 1 e selecionando Passo Duplicate. Criar 23 duplicatas para um período de observação de 2 horas. (Ver Figura 4). </li><li> Na etapa final (Passo 24), altere o Depois de definir não fazer nada de Wait (seg) Captura de imagem. </li><li> Clique no botão Salvar e sair do Editor do protocolo. </li></ol></li></ol> 2. Iluminação Arquivos de referência Nota: Aplicar arquivos de referência iluminação de raios-X para uma imagem de raios-X, a fim de corrigir automaticamente as variações de detector uniformidade das imagens de raios-X obtidos ao longo experimento. Os procedimentos descritos abaixo são específicos para a Bruker Em Imaging Systems animais in vivo; outros sistemas de imagem in vivo podeser usado. <ol><li> Gerar um arquivo de referência iluminação, abrindo o software de imagem molecular e clicando no botão Capturar. </li><li> Usando o menu pop-up, estabelecer as definições de captura de raios-X em Illumination Fonte (ver configurações sugeridas na seção 1 acima) e selecione Referência de iluminação no tipo de exposição. Isto pode ser encontrado sob as exposições padrão caixa suspensa. (Ver Figura 5). </li><li> Remover todas as amostras a partir da estação de imagem. Defina o binning X e Y para 4 x 4 binning. Consulte a Tabela 1: tempos de exposição arquivo de referência de iluminação para determinar o tempo de exposição precisa. </li><li> Imprensa Exposé. </li><li> Aplicar o arquivo de referência selecionando-se Auto Select a partir do menu drop-down em Aplicar arquivo de referência. (Ver Figura 6). O arquivo de referência iluminação vai agora ser automaticamente aplicada a todos os im de raios-Xidades capturadas com as mesmas configurações da câmera. Passos 2,1-2,4 não precisará ser repetido se mesmas configurações da câmera são utilizados em experimentos posteriores. Nota: Um arquivo de referência iluminação pode ser aplicado após a aquisição da imagem, ou se uma mensagem de erro ocorre após a auto-seleção dos arquivos de referência. Aplicar iluminação referência arquivos de captura pós-imagem usando o seguinte série de comandos no painel de navegação do software de imagem molecular: Imagem&gt; Math Imagem&gt; Tipo: Task&gt; Calcule: Correcção de iluminação. Selecione a imagem de entrada (X) que você gostaria de aplicar o arquivo de referência de iluminação (Y) para. Renomeie o arquivo corrigido (Z). (Veja a Figura 7). </li></ol> Manuseamento 3. animal <ol><li> aquisição de animais <ol><li> Comprar vacas prenhes de criadores comerciais ou raça ratos fêmeas em casa às 12 semanas de idade (ou mais) de acordo com a diretriz institucionals. </li><li> camundongos recém-nascido casa com as mães que amamentam até dia pós-natal (PN) 10. </li></ol></li><li> Anestesia Animal (PN 10) <ol><li> Prepare um coquetel ketamina / xilazina para anestesiar PN 10 ratos para efeitos anestésicos prolongados com a duração de 40 min. Adicionar 500 mL de cetamina (100 mg / mL) a 75 mL de xilazina (100 mg / ml). Diluir a 1:10 em solução salina a 0,9% para tornar uma mistura de cetamina (100 mg / kg) / Xilazina (10 mg / kg) cocktail anestésico. </li><li> Pese os ratos recém-nascidos. </li><li> Usando uma seringa com uma agulha 3/10 31 L 5/16 polegadas (8 mm), administrar 10 uL / ​​g de peso corporal de anestesia com uma injecção intraperitoneal. </li><li> Manter os animais seco e isolados para evitar a perda excessiva de calor do corpo. </li></ol></li></ol> 4. traqueal instilações <ol><li> Prepara-se uma solução salina intratraqueal constituído por NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl2 1 mM e HEPES 10 mM; pH = 7,4. A osmolalidade desta solução deve ser319 mOsmol / kg de H 2 O. </li><li> Mount anestesiados animais lado ventral para cima sobre uma placa cirúrgica inclinado usando fita cirúrgica. Ensurethat as cabeças dos animais são colocados no topo da inclinação. </li><li> Realizar uma pitada dedo do pé para garantir que os animais são anestesiados e pronto para a cirurgia. Desinfectar todas as áreas, instrumentos e região torácica cirúrgica do animal. </li><li> Fazer uma pequena incisão (3 mm) no aspecto ventral ântero-medial do pescoço (região da garganta) o uso de um bisturi cirúrgico, tamanho 11. Pressione lado o platisma e anterior músculos traqueais usando uma pinça embotadas, a fim de visualizar e acessar a traqueia. </li><li> Incutir 3 mL / g de peso (aproximadamente 10 - 30 uL de volume final) de solução salina através da traqueia exposta usando uma agulha 31 G de 5/16 polegadas (8 mm). A incisão menor é deixada em aberto durante o exame dos animais e geralmente cura-se bem. Consultar com divisão local de Recursos Animais para determinar se a incisão pode também ser deixada em aberto. Caso contrário, pode suturasé necessário. </li></ol> 5. Imagem animal <ol><li> Posicione os filhotes ventrally em um bottom-clara, bandeja removível, imagem animal. O centro dos animais de modo que o feixe de raios-X serão directamente sobre a área torácica. </li><li> Para grupos de animais com números ímpares, colocar o primeiro pup directamente no meio do tabuleiro, e em coortes de números pares colocar o primeiro pup apenas à esquerda do centro de modo que quando os outros animais são colocados no tabuleiro todos os animais estão centradas. </li><li> Devolva a bandeja de imagem para o gabinete de imagem de raios-X e fechar a porta do armário. </li><li> Ligue a unidade de controle térmico animal para manter a temperatura corporal dos animais anestesiados. Utilizar a configuração alta para alcançar uma temperatura da câmara de aproximadamente 35-37 ° C. Ligar a unidade de anestesia dos animais (isoflurano vaporizado entregue através de oxigénio) para garantir os animais são anestesiados e imobilizados durante todo a duração do procedimento de imagiologia 2 h. </li><li> protocolo de imagiologia execução de raios-X<ol><li> Clique em Captura e selecione o protocolo apropriado, por exemplo, &quot;Jove Demonstração protocolo,&quot; a partir do menu drop-down protocolo. (Ver Figura 8). </li><li> Clique no botão Executar protocolo selecionado no software de imagem molecular. Nota: Uma janela pop-up aparece para acompanhar o status da aquisição da imagem, quando o protocolo for concluída a janela desaparecerá. A dose de raios-X é baixa, &lt;a 0,3 mrem ou cerca de 10 vezes menos do que um raio-X odontológico. Tal como acontece com outros procedimentos de Raios-X, não há radiação residual. </li><li> Quando a sessão de aquisição de 2 horas está completa, remover os animais da bandeja de imagem e devolvê-los à sua gaiola. Monitorar animais para recuperação completa antes de voltar para racks. </li></ol></li></ol> Análise 6. Os dados Nota: software de imagem molecular permite a quantificação e a tradução de Xray intensidade de pixel em taxa de eliminação do fluido pulmonar. Os passos abaixo descrevem os procedimentos necessários para normalizar imagens de raios-X e quantificar intensidades nas regiões definidas de interesse (ROI). <ol><li> Projetar um modelo de ROI Nota: Uma região de interesse do modelo específico devem ser criados para as imagens de raios-X capturados durante o estudo de 2 horas, e deve ser utilizado de modo a comparar as intensidades de raios X entre os grupos experimentais. Uma vez que pequenos volumes de desafios salinos normalmente se acumulam no lobo superior do pulmão esquerdo 4-6, o ROI (s) deve concentrar-se nesta porção de pulmão. <ol><li> Abra a imagem primeiro e último raio-x no conjunto de 2 horas. Selecione a janela da primeira imagem de raios-x. </li><li> Na barra de ferramentas de navegação, selecione Manual-ROIs&gt; New ROI Set. </li><li> Clique ROI Ellipse e criar um ROI que cobre adequadamente esquerdo do mouse lung.An ROI não está definido até o vermelho, delineado ROI é dragged para uma posição diferente. A ROI definida será apresentada em azul com um número. </li><li> Se vários filhotes são gravadas, clique no vermelho, ROI delineado e arraste para os pulmões esquerdo dos outros ratos para criar mais ROIs individual no mesmo conjunto. Arraste o vermelho, ROI delineado para uma área com um fundo claro para criar um ROI de fundo. <ol><li> Selecione Seleção Ponteiro para posicionar as ROIs de mentir sobre pulmão esquerdo de cada rato, diretamente sob a segunda costela. </li></ol></li><li> Na barra de ferramentas superior, clique em Visor de imagens. </li><li> Verifique Overlay no diálogo Visor de imagens para sobrepor a última imagem de raios-x, mantendo os locais conjunto de ROI. Se necessário, selecione Seleção ponteiro na barra de ferramentas de navegação para ajustar as posições do ROIs e garantir uma cobertura adequada de pulmão em ambas as imagens. </li><li> Na caixa de diálogo ROI Manual, selecione Modelo&gt; Salvar em Modelo. nome tEle modelo e clique em OK. </li><li> Feche as duas imagens. Selecione Não quando for solicitado para salvar as alterações. </li><li> Aplicar o modelo de ROI para cada imagem de raios-X capturado para analisar apuramento fluido através da abertura de todas as imagens tomadas durante o estudo. Comece selecionando um arquivo aberto e clique ROIs manuais&gt; Modelo. </li><li> Selecione o modelo de ROI previamente criado a partir do menu drop-down e clique em Aplicar a todos os documentos abertos. </li></ol></li><li> Exportação numérica ROI dados de imagens para uma folha de cálculo <ol><li> No canto superior esquerdo, clique em File&gt; Export Data&gt; ROI. </li><li> Verifique Conforme exibido e Auto Open in Excel na caixa de diálogo pop-up. </li><li> Selecione Exportar todos os documentos abertos. </li><li> Nomeie o arquivo e clique em Salvar. </li><li> software de imagem molecular perto. </li></ol></li></ol&gt;

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Este artigo é parte de uma edição especial on Imaging Multimodal pré-clínica, patrocinado pela Bruker Biospin.

Utilizando imagiologia de raios X, imagens claras de pulmões neonatais podem ser analisados ​​para os volumes de fluidos pulmonares. Nós 7,3,11, e outros 10, têm utilizado com sucesso imagens de raios-X para determinar as mudanças dinâmicas em volume de líquido pulmonar em modelos animais livremente respiração anestesiados, e esta técnica é uma grande promessa para avançar o estudo da lesão pulmonar neonatal. Uma grande vantagem em utilizar a nossa abordagem para avaliar o volume de fluido do pulmão (em oposição aos raios-x Constrast fase 10 por exemplo) é que até cinco filhotes de rato PN10 pode ser simultaneamente estudado utilizando um sistema de imagem que é lugar comum em instalações de pesquisa e núcleos . Incutir um volume adequado de fluido pulmonar, para não se afogar ou colapsar o pulmão, é fundamental para o sucesso da implementação deste protocolo e pode precisar de ser experimentalmente explorado antes de protocolos de imagem de raios-X pode ser aplicada. A sensibilidade deste ensaio permite a detecção de muito pequena volumes de solução salina instilado através de detecção de raios-X. Nós temos sido capazes de discernir diferenças de opacidade de raios-X dos pulmões neonatais instilados com 10 volumes ul de solução salina. A diferença de opacidades de raios-X são ainda mais pronunciados quando inibidores do canal de sódio são introduzidos no espaço aéreo alveolar porque os desafios salinas não pode ser absorvido e os pulmões continuam a secretar fluido para dentro do espaço aéreo. No caso em que um volume inapropriadamente elevado de solução salina é introduzido, colocação dos animais na câmara de imagem com oxigénio que flui para dentro da câmara através das portas de anestesia pode facilitar a respiração nos pulmões inundadas. Os nossos resultados usando imagens de raios-X são comparáveis ​​às folgas líquido alveolar medida usando abordagens mais convencionais, como o pulmão relações de peso molhado-to-seca e azul de Evan para a determinação da concentração de proteína 4. Nós agora demonstrar que esta abordagem pode ser aplicada para o cachorro neonatal mouse. Este im de raios-Xtécnica de envelhecimento para determinar os volumes de fluidos de pulmão pode ser facilmente combinado com as modalidades de imagiologia adicionais. Por exemplo, marcadores fluorescentes ou sondas bioluminescentes podem ser, simultaneamente, instilou-se os alvéolos e avaliada. (Detecção de sondas fluorescentes e luminescentes tem sido descrito 8, e está fora do escopo deste relatório). A capacidade para co-registar o volume de fluido do pulmão (utilizando imagiologia de raios-X) juntamente com a capacidade de detectar biomarcadores fluorescentes é uma das várias vantagens da utilização deste ensaio dinâmico e o sistema comercial para a medição de recarga de fluido pulmonar. Outros benefícios de utilizar esta abordagem para a determinação de apuramento e volume de líquido do pulmão em relação inclui a capacidade de realizar estudos longitudinais (diminuindo assim o número de animais necessários para alcançar observações estatisticamente significativas), bem como a capacidade para detectar pequenas mudanças no volume do fluido pulmonar em respirar livremente , anestesiados, filhotes de rato neonatal. Uma limitação do uso de umna abordagem imagiologia in vivo, no entanto, é que a anestesia pode alterar a distribuição de gás e fluxo de sangue nos pulmões. Desemparelhamentos na ventilação e perfusão (V / Q) e manobras têm sido mostrados para aumentar sob anestesia em voluntários adultos saudáveis, 12, reduzindo assim a oxigenação do corpo. Este efeito adverso, no entanto, pode ser compensado pelo aumento da concentração de oxigénio inspirado. Do ponto de vista técnico, a variabilidade entre sistemas de imagem em energia fluxo de raios-X pode exigir otimização de cada sistema antes de realizar estudos de imagem. Por exemplo, num sistema com uma fonte de raios-X com mais fluxo e / ou um detector com eficiência quântica superior, uma maior f / parar e inferior estado binning pode proporcionar uma melhor qualidade de imagem quando se avalia pequena alteração na impedância de raios-X.

No nascimento, o pulmão recém-nascido deve passar de um fluido que segrega a um órgão reabsorver fluido para estabelecer ventilação e oxigenação adequada do corpo. Os mecanismos que facilitem (ou dificulta) depuração eficaz de fluido no pulmão no momento do nascimento permanecem obscuros. Modelando a taxa de eliminação do fluido alveolar em ratinhos C57BL / 6 crias recém-nascidas de rato irá conduzir a uma melhor compreensão dos factores de regulação que podem aumentar ou atenuar a velocidade de absorção de fluido. Pode também ser aplicado a outros modelos neonatais de lesão pulmonar aguda ou infecção, e poderia conduzir a novas estratégias terapêuticas para os recém-nascidos com dificuldades respiratórias. Uma vez que os pulmões de recém-nascidos são minúscula em comparação com os pulmões adultos, medidas convencionais de eliminação do fluido alveolar, que dependem de lavagem ou gravimétrica medições podem não ser adequados para um estudo minucioso eliminação do fluido pulmonar em modelos pulmonares neonatais. Neste protocolo, demonstramos um ensaio que permitea determinação exata da taxas de eliminação de fluidos alveolares em filhotes pós-natais dia 10 C57BL / 6 ratos usando uma pequena imager animal. Um dos principais benefícios do uso de uma abordagem fluoroscopia é que os animais são gravadas in vivo. Eles estão respirando livremente e pode recuperar a partir deste ensaio minimamente invasiva para a observação futura e estudo. O objetivo geral deste método é modelar edema pulmonar no pulmão recém-nascido, e avaliar a taxa de eliminação do fluido alveolar no pulmão neonatal. Esta técnica foi desenvolvida, em parte, como uma estratégia de redução para diminuir o número de animais necessários, ainda maximizar a produção experimental. Esta técnica também permite a detecção superior do volume de fluidos pulmonares utilizando imagiologia de raios-X e requer proficiência na contenção de base animal e de manuseamento 1; pequenas cirurgias animais e traqueal instilação 2, um pequeno gerador de imagens animal, e software básico de análise de imagem. Os investigadores que desejam avaliar volumes de fluido pulmonar in vivo (BRE livrementeathing anestesiados modelos animais) podem encontrar este procedimento adequado para a sua aplicação. Por último, este protocolo poderá aumentar outros modelos existentes de lesão pulmonar neonatal utilizado no estudo mecanicista de displasia broncopulmonar, incluindo lesões induzidas por hiperoxia pulmonar, ventilação mecânica, e os modelos de inflamação pulmonar 3.

<table><tbody><tr><td>Preclinical Imaging System (In- Vivo MS FX PRO)</td><td>Bruker; Billerica, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Ketaset; Fort Dodge Animal Health, IA</td><td>26637-411-01</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Laboratories; Shenandoah, IA</td><td>4821</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (with Calcium and Magnesium)&amp;nbsp;</td><td>Lonza; Walkersville, MD</td><td>17-513F</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Amresco; Solon, OH</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>Potassuim chloride</td><td>Fisher Scientific; Fair Lawn, NJ</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich; St. Loius, MO</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich; St. Loius, MO</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>0.3 ml insulin syringe with 31 G x 5/16&quot; (8 mm) needle</td><td>BD Insulin Syringe; Franklin Lakes, NJ</td><td>328438</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time x-ray imaging of lung fluid volumes in neonatal mouse lung

No nascimento, o pulmão sofre uma profunda interruptor fenotípica da secreção de absorção, o que permite a adaptação a respirar independentemente. Promover e sustentar este fenótipo é criticamente importante em troca de crescimento e gás alveolar normal ao longo da vida. Vários estudos in vitro têm caracterizado o papel das proteínas reguladoras chave, moléculas de sinalização, e hormonas esteróides que pode influenciar a taxa de eliminação do fluido pulmonar. No entanto, em exames in vivo devem ser realizadas para avaliar se estes factores reguladores desempenham papéis fisiológicos importantes na regulação perinatal de absorção de líquido do pulmão. Como tal, a utilização de imagiologia de raios X em tempo real para determinar depuração perinatal fluido pulmonar ou edema pulmonar, representa um avanço tecnológico no campo. Aqui, vamos explicar e ilustrar uma abordagem para avaliar a taxa de eliminação do fluido pulmonar alveolar e inundações alveolar em camundongos C57BL / 6 no dia pós-natal 10 usção de imagem de raios-X e análise. A implementação bem sucedida deste protocolo exige a prévia aprovação dos comitês institucionais de cuidados de animais e utilização (IACUC), um sistema de imagem de raios-X in vivo animal pequeno, e software de imagem molecular compatível.

Os painéis da esquerda nas figuras 9 - 10 são de PN 10 pulmões de rato fotografada na linha de base (pré-instilado). Estas imagens mostram instilação bem sucedida de desafios solução salina no lóbulo esquerdo dos pulmões neonatais. Na Figura 9, o pulmão do rato foi traquealmente instilados com a solução salina acima definido (ver secção 2.1). Os painéis de média e direito da Figura 9 são imagens de raios-X do mesmo rato obtido 5 minutos e 2 horas após a instilação; este animal tinha clareado com sucesso o desafio salina. Especificamente, a intensidade dos raios-X deste ROI animais aumentou de 187,67 a 515. Assim, existe uma correlação inversa entre a densidade de pixels e o volume de fluido do pulmão; isto é, quanto maior for o valor relativo, a menos fluido existe nos pulmões. Pode ser útil para compreender que mais energia de raios-X é absorvida (portanto, um valor reportado maior) quando há attenuati menos fluidong do raio-X. Na Figura 10, o pulmão do rato PN 10 foi instilado traquealmente com um composto contendo glutationa oxidada (reconstituído em solução salina descrito em 2.1), que inibiu a eliminação do fluido alveolar do desafio salina por bloqueio da actividade do canal de sódio epitelial; o valor numérico de ROI deste animal vai diminuir a partir do pré-incutir e arquivos fotografada incutiu-post de raios-X, indicativos de aumento da opacidade de raios-X. Especificamente, a intensidade líquida do animal, aproximadamente, 5 minutos após a instilação foi - 64, e reduziu-se para - 182. Novamente, nota a relação inversa entre a intensidade do pixel ROI e quantidade de fluido nos pulmões; aumento de fluido no lobo superior do pulmão esquerdo atenua a absorção de raios-X. Avaliando intensidade líquida do ROI permite a avaliação quantitativa de mudanças na taxa de eliminação do fluido pulmonar, embora o software de aquisição também permite que os investigadores para expressaros dados em termos de g / cm3, se desejado. Além disso, os pesquisadores podem usar cada animal como seu próprio controle e normalizar todas as intensidades de raios-X para um ponto de tempo inicial (Io), tais como t = 5 min e relatar alterações líquidas nas opacidade de raios-X (ou seja, uma medida da mudança em volumes de fluido pulmonar). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig1.jpg" /> Figura 1. Definições de exposição. Esta tela mostra as configurações de exposição apropriados utilizados neste protocolo. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig2.jpg" /> Figura 2. Configurações de Arquivos. Esta captura de tela ilustra um passo fundamental na geração de uma definição de arquivo que será usadoem um protocolo. Uma janela pop-up (como mostrado) irá solicitar um novo nome para o arquivo de configurações de aquisição. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig3.jpg" /> Figura 3. Protocolo de imagem. Esta captura de tela ilustra um passo chave para determinar se um novo protocolo de imagem foi criado com sucesso. Uma janela pop-up (como mostrado) aparecerá e um novo nome protocolo será solicitado para o protocolo gerado. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig4.jpg" /> Figura 4. ProtPassos OCOL. Esta tela mostra um atalho para duplicar um arquivo de configurações de aquisição, inserir uma nova etapa, ou para apagar um passo dentro de um protocolo de imagem. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig5.jpg" /> Figura 5. iluminação de referência. Esta tela exibe o comando de referência de iluminação e as configurações apropriadas no software de imagem animal apropriado para a criação de um arquivo de referência iluminação. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig6.jpg" /> Figura 6. Auto Select </strong&gt;. Esta tela exibe a função Seleção automática e configurações apropriadas no software de imagem animal apropriado para aplicar um arquivo de referência iluminação. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig7.jpg" /> Figura 7. Correção de Iluminação. Esta tela ilustra a aplicação adequada de um arquivo de referência iluminação gerada após imagiologia animal. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig8.jpg" /> Figura 8. Executar protocolo. Esta telailustra como executar um protocolo selecionado. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig9.jpg" /> Figura imagens 9. raios-X de pulmões apuradas imagem Representante da PN 10 pulmões antes de receber um desafio salina. (Pré-incutir; painel esquerdo); 5 min pós-instilação (painel do meio), e 2 horas após o desafio salina tinha cancelado a partir do pulmão de outra maneira saudável (painel direito). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig9large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig10.jpg" /> Figura 10. raios-X Imagens dos pulmões inundados. Represenimagem sentante da PN 10 pulmões antes de receber um desafio de solução salina (pré-incutir; painel esquerdo) contendo dissulfeto de glutationa, que inibe o transporte de soluto paracelular; 5 min pós-instilação de glutationa oxidada (painel do meio), e 2 horas depois de inibir o transporte paracelular que leva à inundação alveolar (painel da direita). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig10large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Nenhum filtro = </td><td> exposição de 10 seg </td></tr><tr><td> 0,1 milímetros = </td><td> exposição de 15 seg </td></tr><tr><td> 0,2 milímetros = </td><td> exposição de 20 seg </td></tr><tr><td> 0,4 milímetros = </td><td> exposição de 30 seg </td></tr><tr><td> 0,8 milímetros = </td><td> exposição de 30 seg </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> O tamanho do filtro de raios X se correlaciona com um tempo de exposição específico para Crcomer um arquivo de referência iluminação. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Iluminação arquivo de referência. Este arquivo informa os tempos de exposição apropriados para a geração de arquivos de referência de iluminação baseado em filtros de raios-X utilizados em exames de imagem.

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Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

Imagens de raios-X em tempo real de pulmão volumes de fluido em Neonatal mouse Lung

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

real-time-x-ray-imaging-of-lung-fluid-volumes-in-neonatal-mouse-lung

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

8.6K visualizações.  Emory University. We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology. 

Vídeo: Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung is the most difficult to assess using intravital optical imaging due to its enclosed position within the body, delicate nature and vital role in sustaining proper physiology. While clinical modalities (positron emission tomography (PET), magnetic resonance imaging (MRI) and computed tomography (CT)) are capable of providing noninvasive images of this tissue, they lack the resolution necessary to visualize the earliest seeding events, with a single pixel consisting of nearly a thousand cells. Current models of metastatic lung seeding postulate that events just after a tumor cell&#39;s arrival are deterministic for survival and subsequent growth. This means that real-time intravital imaging tools with single cell resolution 2 are required in order to define the phenotypes of the seeding cells and test these models. While high resolution optical imaging of the lung has been performed using various ex vivo preparations, these experiments are typically single time-point assays and are susceptible to artifacts and possible erroneous conclusions due to the dramatically altered environment (temperature, profusion, cytokines, etc.) resulting from removal from the chest cavity and circulatory system 3. Recent work has shown that time-lapse intravital optical imaging of the intact lung is possible using a vacuum stabilized imaging window 2,4,5 however, typical imaging times have been limited to approximately 6 hr. Here we describe a protocol for performing long-term intravital time-lapse imaging of the lung utilizing such a window over a period of 12 hr. The time-lapse image sequences obtained using this method enable visualization and quantitation of cell-cell interactions, membrane dynamics and vascular perfusion in the lung. We further describe an image processing technique that gives an unprecedentedly clear view of the lung microvasculature.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Pesquisa do câncer

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic alterations in oncogenes such as the KRAS oncogene, which constitutes ~25% of lung cancer cases. The difficulty in therapeutically targeting KRAS-driven lung cancer partly stems from having poor models that can mimic the progression of the disease in the lab. We describe a method that permits the relative quantification of primary KRAS lung tumors in a Cre-inducible LSL-KRAS G12D mouse model via ultrasound imaging. This method relies on brightness (B)-mode acquisition of the lung parenchyma. Tumors that are initially formed in this model are visualized as B-lines and can be quantified by counting the number of B-lines present in the acquired images. These would represent the relative tumor number formed on the surface of the mouse lung. As the formed tumors develop with time, they are perceived as deep clefts within the lung parenchyma. Since the circumference of the formed tumor is well-defined, calculating the relative tumor volume is achieved by measuring the length and width of the tumor and applying them in the formula used for tumor caliper measurements. Ultrasound imaging is a non-invasive, fast and user-friendly technique that is often used for tumor quantifications in mice. Although artifacts may appear when obtaining ultrasound images, it has been shown that this imaging technique is more advantageous for tumor quantifications in mice compared to other imaging techniques such as computed tomography (CT) imaging and bioluminescence imaging (BLI). Researchers can investigate novel therapeutic targets using this technique by comparing lung tumor initiation and progression between different groups of mice.

This protocol describes the steps taken to induce KRAS lung tumors in mice as well as the quantification of formed tumors by ultrasound imaging. Small tumors are visualized in early timepoints as B-lines. At later timepoints, relative tumor volume measurements are achieved by the measurement tool in the ultrasound software.

Detecção de Progressão do Tumor Pulmonar em Camundongos por ultrassom

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

A seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse Pneumonia aguda Modelo Usando bactérias bioluminescentes

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Imunologia e Infecção

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Fundição Vascular de Pulmões de Camundongos Adultos e Precoces para Imagem Micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Biologia do Desenvolvimento

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which causes significant deterioration in lung function and subsequent death from respiratory failure.
The pathogenesis of IPF in experimental animal models has been induced by bleomycin administration. In this study, we investigate an IPF-like mouse model induced by a double intratracheal bleomycin instillation. Standard histological assessments used for studying lung fibrosis are invasive terminal procedures. The goal of this work is to monitor lung fibrosis through noninvasive imaging techniques such as Fluorescent Molecular Tomography (FMT) and Micro-CT. These two technologies validated with histology findings could represent a revolutionary functional approach for real time non-invasive monitoring of IPF disease severity and progression. The fusion of different approaches represents a step further for understanding the IPF disease, where the molecular events occurring in a pathological condition can be observed with FMT and the subsequent anatomical changes can be monitored by Micro-CT.

We describe a non-invasive multimodal imaging approach based on Micro-CT and fluorescence molecular tomography for longitudinal assessment of the mouse lung fibrosis model induced by double intratracheal instillation of bleomycin.

Um Multimodal abordagem de imagem baseado em Micro-CT e fluorescência Molecular tomografia para avaliação Longitudinal de fibrose pulmonar induzida por bleomicina em ratos

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a protocol for studying the pathogenesis of E. coli O1:K1:H7, a serotype responsible for high mortality rates in neonates. Our method utilizes intravital imaging of neonatal pups at different time points during the progression of infection. This imaging, paralleled by measurement of bacteria in the blood, inflammatory profiling, and tissue histopathology, signifies a rigorous approach to understanding infection dynamics during sepsis. In the current report, we model two infectious inoculums for comparison of bacterial burdens and severity of disease. We find that subscapular infection leads to disseminated infection by 10 h post-infection. By 24 h, infection of luminescent E. coli was abundant in the blood, lungs, and other peripheral tissues. Expression of inflammatory cytokines in the lungs is significant at 24 h, and this is followed by cellular infiltration and evidence of tissue damage that increases with infectious dose. Intravital imaging does have some limitations. This includes a luminescent signal threshold and some complications that can arise with neonates during anesthesia. Despite some limitations, we find that our infection model offers an insight for understanding longitudinal infection dynamics during neonatal murine sepsis, that has not been thoroughly examined to date. We expect this model can also be adapted to study other critical bacterial infections during early life.

Infection of neonatal mice with bioluminescent E. coli O1:K1:H7 results in a septic infection with significant pulmonary inflammation and lung pathology. Here, we describe procedures to model and further study neonatal sepsis using longitudinal intravital imaging in parallel with enumeration of systemic bacterial burdens, inflammatory profiling, and lung histopathology.

Um modelo de imagem neonatal de sepse bacteriana gram-negativa

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung injury (ALI)/acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other respiratory pathologies in vivo is difficult due to the limited accessibility and inherent motion artifacts of the lungs. Nonetheless, various approaches have been developed to overcome these challenges. This protocol describes a method for intravital fluorescence microscopy to study real-time leukocyte-endothelial interactions in the pulmonary microcirculation in an experimental model of ALI. An in vivo lung imaging system and 3-D printed intravital microscopy platform are used to secure the anesthetized mouse and stabilize the lung while minimizing confounding lung injury. Following preparation, widefield fluorescence microscopy is used to study leukocyte adhesion, leukocyte rolling, and capillary function. While the protocol presented here focuses on imaging in an acute model of inflammatory lung disease, it may also be adapted to study other pathological and physiological processes in the lung.

Intravital fluorescence microscopy can be utilized to study leukocyte-endothelial interactions and capillary perfusion in real-time. This protocol describes methods to image and quantify these parameters in the pulmonary microcirculation using a vacuum-stabilized lung imaging system.

Microscopia de Fluorescência De Largura Intravital de Microcirculação Pulmonar em Lesão Pulmonar Aguda Experimental Usando um Sistema de Imagem Estabilizada a Vácuo

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Hyperpolarized 129Xe Lung MRI and Spectroscopy in Mechanically Ventilated Mice

Hyperpolarized (HP) xenon-129 (129Xe) is an inhaled magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent with unique spectral and physical properties that can be exploited to quantify pulmonary physiology, including ventilation, restricted diffusion (alveolar-airspace size), and gas exchange. In humans, it has been used to evaluate disease severity and progression in a variety of pulmonary disorders and is approved for clinical use in the United States and United Kingdom. Beyond its clinical applications, the ability of 129Xe MRI to noninvasively assess pulmonary pathophysiology and provide spatially resolved information is valuable for preclinical research. Among animal models, mice are the most widely used due to the accessibility of genetically modified disease models. Here, 129Xe MRI is promising as a minimally invasive, radiation-free, and sensitive technique to longitudinally monitor lung disease progression and therapy response (e.g., in drug discovery). This technique can extend to preclinical applications by incorporating an MRI-triggered, free-breathing apparatus or mechanical ventilator to deliver gas. Here, we describe the steps and provide checklists to ensure robust data collection and analysis, including creating a thermally polarized xenon gas phantom for quality control, optimizing polarization, animal handling (sedation, intubation, ventilation, and care for mice), and protocols for ventilation, restricted diffusion, and gas exchange data. While preclinical 129Xe MRI can be applied in various animal models (e.g., rats, pigs, sheep), this protocol focuses on mice due to the challenges posed by their small anatomy, which are balanced by their affordability and the availability of many disease models.

Hyperpolarized xenon MRI can quantify regional lung microstructure (air-space dimensions) and physiology (ventilation and gas exchange) in translational research and clinical care. Although challenging, it can provide comparable pulmonary insights in preclinical studies. This protocol describes the infrastructure and procedures needed to perform routine xenon lung MRI in mice.

Hyperpolarized (HP) xenon-129 (129Xe) is an inhaled magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent with unique spectral and physical properties that can ...

Bioengenharia

<meta charset="utf8"></head><body>Preservando a localização de esporos fúngicos em pulmões para análise de microscopia fluorescente

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and bronchioles, branch until terminating in the alveolar airspace where gas exchange occurs. Infections originating in the bronchioles or alveoli elicit distinct host responses and disease manifestations. Therefore, understanding precisely where spores naturally localize in the lungs, particularly soon after infection, expands opportunities for investigation of host-pathogen interactions. Herein, we detail an in-situ analysis of lungs from mice infected with Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&#916; arthroconidia. Conventional methods for histological preservation involve liquid inflation of the airways with a fixative solution, which displaces the natural location of aspirated fungal particles, pushing spores from proximal bronchioles to terminal airspaces.
Conversely, this method of air-inflation with blood vasculature perfusion-fixation preserves the physiologic position of fungal spores within the bronchioles. Moreover, we describe a simple approach to cryopreserving, embedding, and imaging lung specimens. We also share high-throughput computational techniques via the open-source QuPath program to analyze the spatial distribution of fungal spores within the lung. The method presented here is simple and quick, requires minimal equipment to perform, and can be easily adapted for use with many respiratory fungal infection models.

<meta charset="utf8"></head><body>Método eficiente para imagens de pulmões murinos que preserva a dinâmica espacial de esporos de fungos nas vias aéreas

We present a method for a fungal pathogenesis model that preserves the natural positioning of fungal spores in the lung airways for analysis via fluorescent microscopy.

Método eficiente para imagens de pulmões murinos que preserva a dinâmica espacial de esporos de fungos nas vias aéreas

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and ...

Imagens de raios-X em tempo real de pulmão volumes de fluido em Neonatal mouse Lung

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De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

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Fundição Vascular de Pulmões de Camundongos Adultos e Precoces para Imagem Micro-CT

Um Multimodal abordagem de imagem baseado em Micro-CT e fluorescência Molecular tomografia para avaliação Longitudinal de fibrose pulmonar induzida por bleomicina em ratos

Um modelo de imagem neonatal de sepse bacteriana gram-negativa

Microscopia de Fluorescência De Largura Intravital de Microcirculação Pulmonar em Lesão Pulmonar Aguda Experimental Usando um Sistema de Imagem Estabilizada a Vácuo

Hyperpolarized ¹²⁹Xe Lung MRI and Spectroscopy in Mechanically Ventilated Mice

Método eficiente para imagens de pulmões murinos que preserva a dinâmica espacial de esporos de fungos nas vias aéreas

Método eficiente para imagens de pulmões murinos que preserva a dinâmica espacial de esporos de fungos nas vias aéreas