Name: real-time x-ray imaging of lung fluid volumes in neonatal mouse lung
Uploaded: 2016-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung at JoVE.com

This work is supported by a grant awarded to MNH by Children's Healthcare of Atlanta, the APS 2014 Short-Term Research Education Program to Increase Diversity in Health-Related Research (STRIDE) fellowship awarded to PT, and the University of Notre Dame Integrated Imaging Facility.

Alle experimentellen Techniken müssen in Einklang mit den institutionellen Pflege und Verwendung Ausschuss Richtlinien durchgeführt werden. 1. Röntgen Imaging Acquisition <ol><li> Software - Übersicht (siehe Abbildung 1 für eine Übersicht über die Software - Einstellungen). <ol><li> Wählen Sie die Aufnahmetaste direkt unter der Registerkarte Datei. </li><li> Im Einstellungen Dropdown-Menü wählen Sie aktuelle Sitzung. </li><li> Wählen Sie Standard - Exposure in Dropdown-Feld unter Belichtungszeit befindet. </li><li> Stellen Sie die Belichtungszeit auf 2,00 min und Nr Exposures zu 1. Stellen Sie die X - Binning und Y Binning auf 2 Pixel. Siehe Abbildung 1. </li><li> Endgültige Accumulation Wählen Sie aus dem Exportoptionen im Dropdown-Menü. </li><li> In den Beleuchtungseinstellungen, select Röntgen von der Beleuchtungsquelle im Dropdown-Menü. Der Standard KVP wird bei 35 gesetzt. </li><li> Wählen Sie Automatische Auswahl in der Apply - Referenzdatei im Dropdown-Menü die entsprechende Röntgenreferenzdatei anzuwenden. (Siehe Abschnitt 2). </li><li> Im Set Kamera Um die Einstellungen, stellen Sie die f-stop auf 2,51. </li><li> Stellen Sie die FOV (Field of View) zu 125,64 für PN10 Mäuse. </li><li> Stellen Sie die Focal Plane bis 13 und in der Drop-Down - Menü neben dem Focal Plane Schieberegler, wählen Sie X-Ray. </li><li> Für Röntgenstrahlen, stellen Sie den Anregungsfilter und den Emissionsfilter auf 0 in der Drop-Down - Menü. </li><li> Speichern der aktuellen Sitzung von New Klick auf die oben neben Einstellungen. Geben Sie den Namen für die neue Einstellungen abrufen Datei, zB &quot;Jove Einmalige Exposition Ereignis für ein Protokoll zu machen.&quot; Siehe Abbildung 2. </li></ol&gt; </li><li> Erstellen eines X-ray Imaging Protocol <ol><li> Klicken Sie auf das Erstellen / Bearbeiten Protokolle Schaltfläche auf der rechten Seite des geöffneten Fensters. </li><li> Als neues Protokoll Pop-up - Fenster erscheint, klicken Sie auf die Schaltfläche Neu in der oberen rechten Ecke </li><li> Geben Sie den Namen ein , das Protokoll unter speichern wird, zum Beispiel &quot;Jove Demo - Protokoll&quot;, und klicken Sie auf OK. (Siehe Abbildung 3). </li><li> Auf der Unterseite des Protokolls Pop-up - Fenster in Protokollschritte, stellen Sie sicher , dass Schritt 1 im roten Text markiert ist, erfassen Neue Bilder ausgewählt wird, und nichts tun ist in der Vor Bildaufnahme im Dropdown - Menü ausgewählt. </li><li> Im Aufnahmeeinstellung, wählen Sie die vor kurzem generierte einmalige Exposition Ereignis aus Schritt 1.1.12. </li><li> Wählen Sie Wait (s) aus dem nach der Bildaufnahme Dropdown-Menü. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche Bearbeiten, type 180 in das Pop-up - Fenster, und klicken Sie auf OK eine 3 min Wartezeit nach jedem 2 min Erwerb hinzuzufügen. </li><li> Duplizieren Schritt 1 von rechts , um den Schritt 1 Tab klicken und Duplizieren Schritt auswählen. Erstellen 23 Duplikate für eine 2 Stunden Beobachtungszeitraum. (Siehe Abbildung 4). </li><li> Im letzten Schritt (Schritt 24), die After - Image ändern Capture - Einstellung nichts zu tun von Wait (sec). </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern und beenden Sie den Protokolleditor. </li></ol></li></ol> 2. Beleuchtung Referenzdateien Hinweis: X-ray Beleuchtung Referenzdateien auf ein Röntgenbild, um automatisch zu korrigieren, um Schwankungen in der Detektor Gleichförmigkeit der Röntgenbilder im gesamten Experiment erhalten Nehmen. Die unten beschriebenen Verfahren sind spezifisch für die Bruker in vivo Tier Imaging Systems; andere in vivo - Bildgebungssysteme könnenverwendet werden. <ol><li> Generieren Sie eine Beleuchtungsreferenzdatei durch die molekulare Imaging - Software zu öffnen , und klicken Sie auf die Schaltfläche Capture. </li><li> Mit dem Pop-up - Menü, stellen die Röntgenaufnahmeeinstellungen in , Lichtquelle (siehe vorgeschlagenen Einstellungen in Abschnitt 1 oben) und wählen Sie dann Illumination Referenz in der Belichtungstyp. Dies kann gefunden werden unter den Standard-Exposures Dropdown-Feld. (Siehe Abbildung 5). </li><li> Entfernen Sie alle Proben aus dem Bild entfernt. Stellen Sie die X- und Y-Binning bis 4 x 4 Binning. Siehe Tabelle 1: Beleuchtung Referenzdatei Belichtungszeiten die genaue Belichtungszeit zu bestimmen. </li><li> Drücken Sie Expose. </li><li> Tragen Sie die Referenzdatei durch die Auswahl von Auto Wählen Sie aus der Drop - Down - Menü unter Referenz - Datei. (Siehe Abbildung 6). Die Beleuchtung Referenzdatei wird nun automatisch an alle X-ray im angewendet werdenAlter mit den gleichen Kameraeinstellungen erfasst. Schritte 2,1-2,4 wird nicht wiederholt werden müssen, wenn dieselbe Kameraeinstellungen in nachfolgenden Experimenten verwendet werden. Hinweis: Eine Beleuchtungsreferenzdatei kann nach der Bildaufnahme angewendet werden, oder wenn eine Fehlermeldung auftritt, nachdem die automatische Auswahl von Referenzdateien. Bewerben Beleuchtung Referenzdateien nach der Bildaufnahme die folgende Reihe von Befehlen in der Navigationsleiste der molekularen Bildgebung Software: Bild&gt; Bild Math&gt; Typ: Aufgabe&gt; berechnen: Beleuchtung Korrektur. Wählen Sie das Eingangsbild (X), die Sie möchten die Beleuchtung Referenzdatei (Y) zu beantragen. Benennen Sie die korrigierte Datei (Z). (Siehe Abbildung 7). </li></ol> 3. Tierbehandlung <ol><li> Der Erwerb Tiere <ol><li> Erwerben Sie schwanger Dämme von kommerziellen Züchtern oder züchten weibliche Mäuse im Haus bei 12 Wochen alt (oder älter) in Einklang mit den institutionellen Richtlinies. </li><li> Haus neugeborenen Mäusen mit laktierenden Müttern bis zum Tag nach der Geburt (PN) 10. </li></ol></li><li> Tier Anesthesia (PN 10) <ol><li> Bereiten Sie eine Ketamin / Xylazin Cocktail PN 10 Mäuse für längere betäubend bis 40 min Dauer von bis zu betäuben. Hinzufügen 500 ul Ketamin (100 mg / ml) auf 75 &amp; mgr; l Xylazin (100 mg / ml). Verdünnte 1:10 in einer 0,9% igen Kochsalzlösung mit einer Ketamin (100 mg / kg) / Xylazin (10 mg / kg) Anästhetikum-Cocktail zu machen. </li><li> Wiegen Sie die neugeborenen Mäusen. </li><li> Verwendung einer 3/10 Spritze mit einer 31 G 5/16 Zoll (8 mm) Nadel verabreichen 10 ul / g Körpergewicht der Anästhesie mit einer intraperitonealen Injektion. </li><li> Halten Sie Tiere trocken und isoliert, um übermäßigen Verlust von Körperwärme zu verhindern. </li></ol></li></ol> 4. Trachea Instillationen <ol><li> Vorbereiten eines intratracheal Kochsalzlösung bestehend aus 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 und 10 mM HEPES; pH = 7,4. Die Osmolalität dieser Lösung sollte319 mosmol / kg H 2 O. </li><li> Berg narkotisierten Tiere Bauchseite nach oben auf eine geneigte chirurgische Board mit chirurgischen Band. Ensurethat der Tiere Köpfe sind an der Spitze der Schräge. </li><li> Führen Sie eine Zehe Prise, um sicherzustellen, dass die Tiere für die Chirurgie narkotisierten und bereit sind. Desinfizieren Sie alle chirurgischen Bereiche, Instrumente und Thoraxbereich des Tieres. </li><li> Machen Sie einen kleinen (3 mm) Einschnitt in der anterior-medialen ventralen Seite des Halses (Halsbereich) mit einem chirurgischen Skalpell, Größe 11. beiseite schieben die platysma und vorderen trachealen Muskeln mit stumpfer Zange, um die Luftröhre zu visualisieren und zu öffnen. </li><li> Instill 3 &amp; mgr; l / g Gewicht (ungefähr 10 bis 30 &amp; mgr; l Endvolumen) Kochsalzlösung über die Luftröhre freigelegt unter Verwendung einer 31 G 5/16 Zoll (8 mm) Nadel. Die kleine Schnitt wird während Tierbildgebung offen gelassen und in der Regel heilt sich selbst gut. Beraten Sie sich mit lokalen Abteilung für Tier Ressource zu bestimmen, ob der Schnitt ebenfalls offen gelassen werden kann. Andernfalls Nähte könnenerforderlich. </li></ol> 5. Tier Imaging <ol><li> Positionieren Sie die Welpen ventral auf einem klaren Boden, abnehmbar, Tierbildgebung Fach. Center, um die Tiere, so dass der Röntgenstrahl direkt über den Brustbereich sein wird. </li><li> Für ungerade nummerierten Tier Kohorten, legen Sie den ersten Welpen direkt in der Mitte der Schale, und gerade numerierten Kohorten die erste Welpe gerade links von der Mitte platzieren, so dass, wenn die anderen Tiere auf dem Tablett alle Tiere platziert sind zentriert sind. </li><li> Bringen Sie die Imaging-Tablett auf den Röntgenbild Schrank und schließen Sie die Schranktür. </li><li> Schalten Sie das Tier thermische Steuereinheit die narkotisierten Tiere Körpertemperatur zu halten. Verwenden, um die hohe Einstellung eine Kammertemperatur von ungefähr 35 zu erreichen - 37 ° C. Schalten Sie Tiernarkosegerät (verdampfte Isofluran über Sauerstoff geliefert) Tiere zu gewährleisten, werden betäubt und im gesamten Dauer von 2 Stunden Bildgebungsverfahren immobilisiert. </li><li> Ausführen von X-ray Imaging-Protokoll<ol><li> Klicken Sie auf Sammeln , und wählen Sie das entsprechende Protokoll, zB &quot;Jove Demo - Protokoll&quot; aus dem Protokoll im Dropdown-Menü. (Siehe Abbildung 8). </li><li> Klicken Sie auf das ausgewählte Protokoll - Taste auf der molekularen Imaging - Software ausführen. Hinweis: Ein Pop-up-Fenster wird der Status der Bildaufnahme zu verfolgen, wenn das Protokoll das Fenster vollständig verschwinden. Die Röntgendosis niedrig ist, &lt;als 0,3 mRem oder etwa 10 mal kleiner als eine dentale Röntgen. Wie bei anderen Verfahren, X-Ray, gibt es kein Reststrahlung. </li><li> Wenn die 2 Stunden Erwerb Sitzung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Tiere aus dem Imaging-Fach und bringt sie in ihren Käfig. Überwachen Tiere zur vollständigen Wiederherstellung, bevor Racks zurück. </li></ol></li></ol> 6. Datenanalyse Hinweis: Molecular Imaging-Software ermöglicht die Quantifizierung und die Übersetzung von Xray Pixelintensität in Rate von Lungenflüssigkeit Clearance. Die folgenden Schritte beschreiben benötigt die Verfahren von Röntgenbildern zu normalisieren und Intensitäten in definierten Regionen von Interesse (ROI) zu quantifizieren. <ol><li> Entwerfen Sie einen ROI - Vorlage Hinweis: Ein Bereich von Interesse Vorlage muss während der 2 Stunden Studie spezifisch für den aufgenommenen Röntgenbilder erstellt werden und sollte verwendet werden, um Röntgenintensitäten unter experimentellen Gruppen zu vergleichen. Da kleine Mengen von Salz Herausforderungen typischerweise in der linken oberen Lappen der Lunge anreichern 4-6, sollte der ROI (s) auf diesem Teil der Lunge konzentrieren. <ol><li> Öffnen Sie die erste und die letzte Röntgenbild in der 2 Stunden gesetzt. Wählen Sie das Fenster des ersten Röntgenbildes. </li><li> In der Navigationsleiste, wählen Sie Manuell-ROIs&gt; New ROI Set. </li><li> Klicken Sie auf ROI Ellipse und einen ROI erstellen , die angemessen auf der linken lung.An ROI Maus deckt nicht , bis die rote definiert, skizzierte ROI ist dragged in eine andere Position. Eine definierte ROI wird in blau mit einer Reihe skizziert werden. </li><li> Wenn mehrere Welpen abgebildet sind, klicken Sie auf den roten, skizzierte ROI und ziehen, um die linke Lunge der anderen Mäuse zu individuelleren ROIs im gleichen Satz erstellen. Ziehen Sie den roten, skizzierte ROI zu einem Bereich mit einem klaren Hintergrund einen Hintergrund ROI zu erstellen. <ol><li> Pointer Auswahl Wählen Sie die ROIs auf Position über jeder Maus der linken Lunge zu liegen, befindet sich direkt unter der zweiten Rippe. </li></ol></li><li> In der oberen Symbolleiste auf Bildanzeige. </li><li> Überprüfen Sie Overlay in der Bildanzeige - Dialog die letzte Röntgenbild zu überlagern , während die eingestellten ROI Standorte beibehalten wird . Wählen Sie bei Bedarf Pointer Auswahl in der Navigationsleiste , die Positionen der ROIs anzupassen und in beiden Bildern eine ausreichende Lungen Abdeckung zu gewährleisten. </li><li> Im manuellen ROI Dialog wählen Sie Template&gt; Speichern auf Vorlage. Name ter-Vorlage und klicken Sie auf OK. </li><li> Schließen Sie beide Bilder. Wählen Sie Nein , wenn Sie dazu aufgefordert Änderungen zu speichern. </li><li> Tragen Sie die ROI-Vorlage jedes Röntgenbild erfasst Fluid-Clearance zu analysieren, indem alle Bilder Öffnen während der Studie genommen. Beginnen Sie mit einer offenen Datei auswählen und klicken Sie auf Manuell ROIs&gt; Vorlage. </li><li> Wählen Sie die zuvor erstellte ROI-Vorlage aus dem Dropdown-Menü aus und klicken Sie auf alle geöffneten Dokumente anwenden. </li></ol></li><li> Export Numerische ROI Daten der Bilder in ein Tabellenkalkulations <ol><li> In der linken oberen Ecke klicken Sie auf Datei&gt; Exportieren von Daten&gt; ROI. </li><li> Überprüfen Sie wie angezeigt und Auto Open in Excel in dem Pop-up - Dialog. </li><li> Wählen Sie Export alle geöffneten Dokumente. </li><li> Benennen Sie die Datei und klicken Sie auf Speichern. </li><li> Schließen molekularen Imaging-Software. </li></ol></li></ol&gt;

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Dieser Artikel ist Teil einer Sonderausgabe über Multimodal Pre-Clinical Imaging, gesponsert von Bruker Biospin.

Mit Hilfe der Röntgenbildgebung, können klare Bilder der Neugeborenen-Lungen für Lungenflüssigkeitsvolumen analysiert werden. Wir 7,3,11 und andere 10 haben erfolgreich Röntgenbildgebung zu bestimmen , dynamische Veränderungen der Lungenflüssigkeitsvolumen in frei atmende narkotisiert Tiermodellen, und diese Technik ist sehr vielversprechend voran die Untersuchung der Neugeborenen Lungenverletzung verwendet. Ein großer Vorteil unseres Ansatzes im Umgang mit Lungenflüssigkeitsvolumen zu bewerten (im Gegensatz zu Röntgen Phase constrast 10 zum Beispiel) ist , dass bis zu fünf PN10 Maus Welpen können gleichzeitig ein Abbildungssystem untersucht werden , verwenden , das ist üblich , in Forschungseinrichtungen und Kerne . eine entsprechende Lungenflüssigkeitsvolumen einflößen, um nicht in die Lunge ertrinken oder kollabieren, ist entscheidend für die erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls und müssen experimentell vor Protokolle Röntgenbildgebung untersucht werden können angewendet werden. Die Empfindlichkeit dieses Assay ermöglicht die Detektion von sehr kleinen Volumes von eingeflößt Salz über Röntgendetektion. Wir konnten Unterschiede in der Röntgenopazität der neonatalen Lungen mit 10 &amp; mgr; l Volumina von Salzlösung eingeflößt zu erkennen. Der Unterschied in der Röntgentrübungen sind noch ausgeprägter, wenn Natriumkanal-Inhibitoren in den alveolaren Luftraum eingebracht werden, da die Salz Herausforderungen nicht absorbiert werden kann, und die Lungen weiter Fluid in den Luftraum zu sezernieren. In dem Fall, dass ein unangemessen hohes Volumen an Kochsalzlösung eingeführt wird, Tiere in die Abbildungskammer mit Sauerstoff strömt in die Kammer über die Anästhesie Ports Platzierung kann die Atmung in überfluteten Lunge erleichtern. Unsere Ergebnisse Röntgenbildgebung unter Verwendung von vergleichbar Alveolarflüssigkeit Abstände gemessen herkömmlicheren Ansätzen, wie beispielsweise Lungen wet-zu-Trocken - Gewichtsverhältnisse und Evans Blau zur Bestimmung der Proteinkonzentration 4. Wir zeigen nun, dass dieser Ansatz auf der Neugeborenen-Maus pup angewendet werden. Diese Röntgen imAging-Technik Lungenflüssigkeitsvolumen zur Bestimmung kann leicht mit zusätzlichen Bildgebungsverfahren kombiniert werden. Zum Beispiel können fluoreszierende Marker oder Biolumineszenz-Sonden gleichzeitig in die Alveolen und bewertet eingeflößt werden. (Nachweis von fluoreszierenden und Lumineszenzsonden wurde 8 beschrieben, und sprengt den Rahmen dieses Berichts). Die Fähigkeit, das Volumen der Lungenflüssigkeit zusammenRegister (X-ray-Bildgebung) neben der Fähigkeit, fluoreszierenden Biomarker zu erkennen ist eine von mehreren Vorteilen dieses dynamischen Test unter Verwendung von und das kommerzielle System zur Messung der Lungenflüssigkeit Clearance. Weitere Vorteile dieser Ansatz der Verwendung für die Abfertigung und die relative Lungenflüssigkeitsvolumen Bestimmung beinhaltet die Fähigkeit, Langzeitstudien durchzuführen (also die Anzahl der Tiere benötigt Abnahme statistisch signifikanten Beobachtungen zu erreichen), und die Fähigkeit, in frei kleine Veränderungen der Lungenflüssigkeitsvolumen zu erfassen, die Atmung , anästhesiert, Neugeborenen Maus Welpen. Eine Einschränkung der Verwendung einjedoch in vivo Bildgebung Ansatz ist, dass die Anästhesie , die Verteilung von Gas und die Durchblutung in der Lunge verändern kann. Mismatches in Ventilation und Perfusion (V / Q) und Rangieren wurden unter Anästhesie in Freiwilligen gesunden Erwachsenen 12, so dass die Sauerstoffversorgung des Körpers gezeigt zu erhöhen reduzieren. Dieser nachteilige Effekt kann jedoch durch eine Erhöhung der eingeatmeten Sauerstoffkonzentration kompensiert werden. Aus technischer Sicht Variabilität zwischen den Abbildungssystemen in Röntgenfluss Energie kann Optimierung jedes System vor der Durchführung bildgebenden Untersuchungen erfordern. Beispielsweise auf einem System mit einer Röntgenquelle mit Flußmittel und / oder ein Detektor mit überlegenen Quantenwirkungsgrad, eine höhere f / Stopp und unteren binning Zustand könnte eine bessere Bildqualität liefern, wenn kleine Änderung in der Röntgen Impedanz zu bewerten.

Bei der Geburt muss das Neugeborene Lunge Übergang von einer Flüssigkeit absondernden zu einem Fluid resorbierbaren Organ ausreichende Belüftung und Sauerstoffversorgung des Körpers zu schaffen. Die Mechanismen, die (oder behindert) wirksame Clearance von Lungenflüssigkeit bei der Geburt erleichtern bleiben unklar. Die Modellierung der Rate von Alveolarflüssigkeit Clearance in C57BL / 6 neugeborenen Maus Welpen werden zu einem besseren Verständnis der regulatorischen Faktoren führen, dass die Rate der Flüssigkeitsaufnahme erhöhen oder abschwächen können. Es könnte auch auf andere neonatal Modellen der akuten Lungenschädigung oder Infektionen angewendet werden und zu neuen therapeutischen Strategien für Neugeborene mit Atemnot führen könnte. Da Neugeborene Lungen winzig im Vergleich zu erwachsenen Lungen sind, herkömmliche Maßnahmen von Alveolarflüssigkeit Clearance, die auf Lavage oder gravimetrische Messungen beruhen möglicherweise nicht geeignet genau in Neugeborenen Lungen Modelle Lungenflüssigkeit Clearance zu studieren. In diesem Protokoll zeigen wir einen Assay, der für ermöglichtdie genaue Bestimmung der Alveolarflüssigkeit Clearance-Raten in 10 postnatalen Tag C57BL / 6-Maus Welpen ein kleines Tier Imager. Ein großer Vorteil eines fluoroskopischen Ansatz der Verwendung ist , dass die Tiere in vivo abgebildet werden. Sie sind frei zu atmen und kann von dieser minimal-invasiven Test für die künftige Beobachtung und Untersuchung erholen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, Lungenödem bei Neugeborenen Lunge zu modellieren, und die Rate der Alveolarflüssigkeit Clearance bei Neugeborenen Lungen bewerten. Diese Technik wurde entwickelt, teilweise als eine Strategie zur Verringerung der Zahl der Tiere erforderlich zu verringern, noch experimentelle Ausgang zu maximieren. Diese Technik ermöglicht auch eine bessere Erkennung von Lungenflüssigkeitsvolumen Röntgenbildgebung mit und erfordert Kenntnisse in grundlegenden Tierzurückhaltung und Handhabung 1; Kleintierarztpraxen und tracheale Instillation 2, ein kleines Tier - Imager und grundlegende Bildanalyse - Software. Die Ermittler , die wünschen Lungenflüssigkeitsvolumen in vivo zu bewerten (frei breathing narkotisierten Tier-Modelle) können Sie dieses Verfahren für ihre Anwendung finden. Schließlich könnte dieses Protokoll andere bestehende Modelle von Neugeborenen in der mechanistischen Untersuchung der bronchopulmonalen Dysplasie verwendet Lungenverletzung zu ergänzen, einschließlich Hyperoxie-induzierten Lungenverletzung, mechanische Belüftung und Modelle von Lungenentzündung 3.

<table><tbody><tr><td>Preclinical Imaging System (In- Vivo MS FX PRO)</td><td>Bruker; Billerica, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Ketaset; Fort Dodge Animal Health, IA</td><td>26637-411-01</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Laboratories; Shenandoah, IA</td><td>4821</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (with Calcium and Magnesium)&amp;nbsp;</td><td>Lonza; Walkersville, MD</td><td>17-513F</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Amresco; Solon, OH</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>Potassuim chloride</td><td>Fisher Scientific; Fair Lawn, NJ</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich; St. Loius, MO</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich; St. Loius, MO</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>0.3 ml insulin syringe with 31 G x 5/16&quot; (8 mm) needle</td><td>BD Insulin Syringe; Franklin Lakes, NJ</td><td>328438</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time x-ray imaging of lung fluid volumes in neonatal mouse lung

Bei der Geburt erfährt der Lunge einen tiefen phänotypischen Wechsel von Sekretion der Absorption, die unabhängig voneinander auf die Atmung zur Anpassung ermöglicht. Die Förderung und diesen Phänotyp aufrechtzuerhalten ist von entscheidender Bedeutung in der normalen alveolären Wachstum und Gasaustausch während des gesamten Lebens. Mehrere in vitro - Studien haben die Rolle der wichtigsten Regulationsproteine ​​gekennzeichnet, Signalmoleküle und Steroidhormone, die die Rate der Lungenflüssigkeit Clearance beeinflussen. Allerdings müssen in vivo Untersuchungen durchgeführt werden , um zu ermitteln , ob diese regulatorischen Faktoren wichtige physiologische Rolle bei der Regulierung der perinatalen Lungenflüssigkeitsaufnahme spielen. Als solches stellt die Nutzung von Echtzeit-Röntgenbildgebung perinatale Lungenflüssigkeit Clearance oder Lungenödem, um zu bestimmen, einen technologischen Fortschritt auf dem Gebiet. Wir berichten hier über erläutern und einen Ansatz illustrieren die Rate der alveoläre Lungenflüssigkeit Clearance und alveolar Überschwemmungen in C57BL / 6-Mäuse an postnatalen Tag 10 uns zu beurteilenRöntgenbildgebungs und Analyse ing. Die erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls bedarf der vorherigen Zustimmung von institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschüsse (IACUC), einem in - vivo - Kleintier - Röntgen-Bildgebungssystem und kompatible molekulare Bildgebung Software.

Die linke Felder in den Figuren 9 - 10 sind von PN 10 Mauslungen zu Beginn der Studie abgebildet (pre-eingeflößt). Diese Bilder zeigen erfolgreiche Einträufeln von Salz Herausforderungen in den linken Lappen der Neugeborenen-Lungen. In 9 wurde die Mauslunge tracheal mit der Salzlösung , die oben definiert eingeflößt (siehe Abschnitt 2.1). Die mittlere und rechte Bilder von Figur 9 sind Röntgenbilder aus derselben Maus 5 erhaltenen min und 2 h nach Instillation; Dieses Tier hatte erfolgreich die Salz Herausforderung gelöscht. Insbesondere erhöhte sich die Röntgenstrahlintensität von dieser Tiere ROI von 187,67 bis 515. Somit besteht eine umgekehrte Korrelation zwischen Pixelvolumendichte und Lungenflüssigkeit; das heißt, je größer der relative Wert ist, desto weniger Flüssigkeit gibt es in der Lunge. Es kann hilfreich sein , zu verstehen , dass mehr Röntgenenergie (also einen größeren wiesener Wert) absorbiert wird , wenn es weniger Flüssigkeit attenuati istng die X-ray. In 10 wurde die PN 10 Mauslunge tracheal mit einer Verbindung eingeflößt oxidiertem Glutathion enthält (in Kochsalzlösung unter 2.1 beschrieben auflösen) , die Alveolarflüssigkeit Clearance der Salz Herausforderung durch die Blockierung epithelialen Natriumkanals Aktivität gehemmt; der numerische Wert dieses ROI des Tieres aus der pre-Instill und post-eingeträufelt Röntgen abzubildenden Dateien, indikativ für zunehmende Röntgenopazität verringern. Insbesondere die Nettointensität des Tieres ca. 5 min nach dem Einträufeln war - 64 und verringerte sich auf - 182. Auch hier ist zu beachten, die inverse Beziehung zwischen der ROI Pixelintensität und der Menge der Flüssigkeit in der Lunge; erhöhte Fluid in der oberen linken Lappen der Lunge dämpft Röntgenabsorption. Auswertung der Nettointensität des ROI ermöglicht eine quantitative Auswertung von Änderungen in der Rate der Lungenflüssigkeit Clearance, wenn auch Erfassungs-Software ermöglicht auch die Ermittler zum Ausdruck bringenDaten in Form von g / cm 3 , wenn gewünscht. Darüber hinaus können die Forscher jedes Tier als seine eigene Kontrolle verwenden und alle Röntgenintensitäten zu einem Anfangszeitpunkt (Io), wie zum Beispiel t = 5 min und berichten Nettoänderungen in Röntgenopazität (dh ein Maß für die Änderung normalisieren in Lungenflüssigkeitsvolumen). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig1.jpg" /> Abbildung 1. Belichtungseinstellungen. Dieser Screenshot zeigt die entsprechenden Einstellungen Belichtung in diesem Protokoll verwendet. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig2.jpg" /> Abbildung 2. Einstellungen Datei. Dieser Screenshot zeigt einen wichtigen Schritt in eine Datei Einstellung zu erzeugen, die verwendet werdenin einem Protokoll. Ein Pop - up - Fenster (siehe Abbildung) werden für den Erwerb Einstellungen Datei einen neuen Namen anfordern. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig3.jpg" /> Abbildung 3. Imaging - Protokoll. Dieser Screenshot zeigt einen wichtigen Schritt bei der Bestimmung, ob ein neues Bildgebungsprotokoll erfolgreich erstellt wurde. Ein Pop - up - Fenster (siehe Abbildung) erscheint und eine neue Protokollname wird für das erzeugte Protokoll angefordert werden. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig4.jpg" /> Abbildung 4. ProtOcol Schritte. Dieser Screenshot zeigt eine Verknüpfung eine Akquisitionseinstellungsdatei zu kopieren, legen Sie einen neuen Schritt, oder ein Schritt innerhalb eines Bildgebungsprotokoll zu löschen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig5.jpg" /> Abbildung 5. Beleuchtung Referenz. Dieser Screenshot der Beleuchtung Referenzbefehl und die entsprechenden Einstellungen in der Tierbildgebung geeignete Software für die Erstellung eines Beleuchtungsreferenzdatei zeigt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig6.jpg" /> Abbildung 6. Auto Select </strong&gt;. Dieser Screenshot der Auto - Funktion auswählen und die entsprechenden Einstellungen in der Tier Imaging - Software geeignet für die Anwendung einer Beleuchtungsreferenzdatei zeigt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="7" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig7.jpg" /> Abbildung 7. Lichtkorrektur. Dieser Screenshot zeigt die entsprechende Anwendung einer Beleuchtungsreferenzdatei nach Tierbildgebung erzeugt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig8.jpg" /> Abbildung 8. Führen Sie Protokoll. Dieser Screenshotzeigt , wie ein ausgewähltes Protokoll auszuführen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig8large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig8large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="9" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig9.jpg" /> Abbildung 9. Röntgenbilder geräumte Lunge Repräsentative Bild von PN 10 Lungen vor der Aufnahme einer Salz Herausforderung dar. (Pre-einzuflößen; linken Fensterbereich); 5 min nach dem Einträufeln (Mitte), und 2 h nach der Salz Herausforderung aus der ansonsten gesunden Lunge (rechtes Bild) verzogen hatte. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig9large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="10" src="/files/ftp_upload/52751/52751fig10.jpg" /> Figure 10. Röntgenbilder von Flooded Lungs. Vertresentativen Bild von PN 10 Lunge vor einer Salz Herausforderung zu empfangen (pre-einzuflößen; linke Platte), die Glutathion-Disulfid, das den Transport parazellulär gelösten Stoff hemmt; 5 min nach dem Einträufeln von Glutathion - Disulfid (Mitte), und 2 h nach der parazellulären Transport Hemmung, die alveoläre Überflutung führt (rechtes Bild). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52751/52751fig10large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Kein Filter = </td><td> 10 sec Belichtungs </td></tr><tr><td> 0.1mm = </td><td> 15 sec Belichtungs </td></tr><tr><td> 0.2mm = </td><td> 20 sec Belichtungs </td></tr><tr><td> 0.4mm = </td><td> 30 sec Belichtungs </td></tr><tr><td> 0.8mm = </td><td> 30 sec Belichtungs </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Die Größe des Röntgenfilters entspricht einer bestimmten Belichtungszeit für creine Beleuchtungsreferenzdatei zu essen. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Illumination Referenzdatei. Diese Datei meldet die entsprechenden Belichtungszeiten zur Erzeugung von Beleuchtungsreferenzdateien basierend auf Röntgenfilter in der Bildgebung verwendet.

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Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

Echtzeit-Röntgenbildgebung von Lungenflüssigkeitsvolumen in Neonatal Mauslunge

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

real-time-x-ray-imaging-of-lung-fluid-volumes-in-neonatal-mouse-lung

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

8.6K Aufrufe.  Emory University. We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology. 

Serie: Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung is the most difficult to assess using intravital optical imaging due to its enclosed position within the body, delicate nature and vital role in sustaining proper physiology. While clinical modalities (positron emission tomography (PET), magnetic resonance imaging (MRI) and computed tomography (CT)) are capable of providing noninvasive images of this tissue, they lack the resolution necessary to visualize the earliest seeding events, with a single pixel consisting of nearly a thousand cells. Current models of metastatic lung seeding postulate that events just after a tumor cell&#39;s arrival are deterministic for survival and subsequent growth. This means that real-time intravital imaging tools with single cell resolution 2 are required in order to define the phenotypes of the seeding cells and test these models. While high resolution optical imaging of the lung has been performed using various ex vivo preparations, these experiments are typically single time-point assays and are susceptible to artifacts and possible erroneous conclusions due to the dramatically altered environment (temperature, profusion, cytokines, etc.) resulting from removal from the chest cavity and circulatory system 3. Recent work has shown that time-lapse intravital optical imaging of the intact lung is possible using a vacuum stabilized imaging window 2,4,5 however, typical imaging times have been limited to approximately 6 hr. Here we describe a protocol for performing long-term intravital time-lapse imaging of the lung utilizing such a window over a period of 12 hr. The time-lapse image sequences obtained using this method enable visualization and quantitation of cell-cell interactions, membrane dynamics and vascular perfusion in the lung. We further describe an image processing technique that gives an unprecedentedly clear view of the lung microvasculature.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Forschung

Krebsforschung

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic alterations in oncogenes such as the KRAS oncogene, which constitutes ~25% of lung cancer cases. The difficulty in therapeutically targeting KRAS-driven lung cancer partly stems from having poor models that can mimic the progression of the disease in the lab. We describe a method that permits the relative quantification of primary KRAS lung tumors in a Cre-inducible LSL-KRAS G12D mouse model via ultrasound imaging. This method relies on brightness (B)-mode acquisition of the lung parenchyma. Tumors that are initially formed in this model are visualized as B-lines and can be quantified by counting the number of B-lines present in the acquired images. These would represent the relative tumor number formed on the surface of the mouse lung. As the formed tumors develop with time, they are perceived as deep clefts within the lung parenchyma. Since the circumference of the formed tumor is well-defined, calculating the relative tumor volume is achieved by measuring the length and width of the tumor and applying them in the formula used for tumor caliper measurements. Ultrasound imaging is a non-invasive, fast and user-friendly technique that is often used for tumor quantifications in mice. Although artifacts may appear when obtaining ultrasound images, it has been shown that this imaging technique is more advantageous for tumor quantifications in mice compared to other imaging techniques such as computed tomography (CT) imaging and bioluminescence imaging (BLI). Researchers can investigate novel therapeutic targets using this technique by comparing lung tumor initiation and progression between different groups of mice.

This protocol describes the steps taken to induce KRAS lung tumors in mice as well as the quantification of formed tumors by ultrasound imaging. Small tumors are visualized in early timepoints as B-lines. At later timepoints, relative tumor volume measurements are achieved by the measurement tool in the ultrasound software.

Nachweis der Lungentumorprogression bei Mäusen durch Ultraschall-Bildgebung

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Immunologie und Infektion

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Vaskuläres Gießen von Erwachsenen und frühpostnatalen Mauslungen für Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Entwicklungsbiologie

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which causes significant deterioration in lung function and subsequent death from respiratory failure.
The pathogenesis of IPF in experimental animal models has been induced by bleomycin administration. In this study, we investigate an IPF-like mouse model induced by a double intratracheal bleomycin instillation. Standard histological assessments used for studying lung fibrosis are invasive terminal procedures. The goal of this work is to monitor lung fibrosis through noninvasive imaging techniques such as Fluorescent Molecular Tomography (FMT) and Micro-CT. These two technologies validated with histology findings could represent a revolutionary functional approach for real time non-invasive monitoring of IPF disease severity and progression. The fusion of different approaches represents a step further for understanding the IPF disease, where the molecular events occurring in a pathological condition can be observed with FMT and the subsequent anatomical changes can be monitored by Micro-CT.

We describe a non-invasive multimodal imaging approach based on Micro-CT and fluorescence molecular tomography for longitudinal assessment of the mouse lung fibrosis model induced by double intratracheal instillation of bleomycin.

Eine multimodale Bildgebung Ansatz basierend auf Mikro-CT und Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für längs-Bewertung der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose bei Mäusen

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a protocol for studying the pathogenesis of E. coli O1:K1:H7, a serotype responsible for high mortality rates in neonates. Our method utilizes intravital imaging of neonatal pups at different time points during the progression of infection. This imaging, paralleled by measurement of bacteria in the blood, inflammatory profiling, and tissue histopathology, signifies a rigorous approach to understanding infection dynamics during sepsis. In the current report, we model two infectious inoculums for comparison of bacterial burdens and severity of disease. We find that subscapular infection leads to disseminated infection by 10 h post-infection. By 24 h, infection of luminescent E. coli was abundant in the blood, lungs, and other peripheral tissues. Expression of inflammatory cytokines in the lungs is significant at 24 h, and this is followed by cellular infiltration and evidence of tissue damage that increases with infectious dose. Intravital imaging does have some limitations. This includes a luminescent signal threshold and some complications that can arise with neonates during anesthesia. Despite some limitations, we find that our infection model offers an insight for understanding longitudinal infection dynamics during neonatal murine sepsis, that has not been thoroughly examined to date. We expect this model can also be adapted to study other critical bacterial infections during early life.

Infection of neonatal mice with bioluminescent E. coli O1:K1:H7 results in a septic infection with significant pulmonary inflammation and lung pathology. Here, we describe procedures to model and further study neonatal sepsis using longitudinal intravital imaging in parallel with enumeration of systemic bacterial burdens, inflammatory profiling, and lung histopathology.

Ein neonatales Bildgebungsmodell der gramnegativen bakteriellen Sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung injury (ALI)/acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other respiratory pathologies in vivo is difficult due to the limited accessibility and inherent motion artifacts of the lungs. Nonetheless, various approaches have been developed to overcome these challenges. This protocol describes a method for intravital fluorescence microscopy to study real-time leukocyte-endothelial interactions in the pulmonary microcirculation in an experimental model of ALI. An in vivo lung imaging system and 3-D printed intravital microscopy platform are used to secure the anesthetized mouse and stabilize the lung while minimizing confounding lung injury. Following preparation, widefield fluorescence microscopy is used to study leukocyte adhesion, leukocyte rolling, and capillary function. While the protocol presented here focuses on imaging in an acute model of inflammatory lung disease, it may also be adapted to study other pathological and physiological processes in the lung.

Intravital fluorescence microscopy can be utilized to study leukocyte-endothelial interactions and capillary perfusion in real-time. This protocol describes methods to image and quantify these parameters in the pulmonary microcirculation using a vacuum-stabilized lung imaging system.

Intravitale Weitfeldfluoreszenzmikroskopie der pulmonalen Mikrozirkulation bei experimenteller akuter Lungenschädigung mit einem vakuumstabilisierten Bildgebungssystem

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Hyperpolarized 129Xe Lung MRI and Spectroscopy in Mechanically Ventilated Mice

Hyperpolarized (HP) xenon-129 (129Xe) is an inhaled magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent with unique spectral and physical properties that can be exploited to quantify pulmonary physiology, including ventilation, restricted diffusion (alveolar-airspace size), and gas exchange. In humans, it has been used to evaluate disease severity and progression in a variety of pulmonary disorders and is approved for clinical use in the United States and United Kingdom. Beyond its clinical applications, the ability of 129Xe MRI to noninvasively assess pulmonary pathophysiology and provide spatially resolved information is valuable for preclinical research. Among animal models, mice are the most widely used due to the accessibility of genetically modified disease models. Here, 129Xe MRI is promising as a minimally invasive, radiation-free, and sensitive technique to longitudinally monitor lung disease progression and therapy response (e.g., in drug discovery). This technique can extend to preclinical applications by incorporating an MRI-triggered, free-breathing apparatus or mechanical ventilator to deliver gas. Here, we describe the steps and provide checklists to ensure robust data collection and analysis, including creating a thermally polarized xenon gas phantom for quality control, optimizing polarization, animal handling (sedation, intubation, ventilation, and care for mice), and protocols for ventilation, restricted diffusion, and gas exchange data. While preclinical 129Xe MRI can be applied in various animal models (e.g., rats, pigs, sheep), this protocol focuses on mice due to the challenges posed by their small anatomy, which are balanced by their affordability and the availability of many disease models.

Hyperpolarized xenon MRI can quantify regional lung microstructure (air-space dimensions) and physiology (ventilation and gas exchange) in translational research and clinical care. Although challenging, it can provide comparable pulmonary insights in preclinical studies. This protocol describes the infrastructure and procedures needed to perform routine xenon lung MRI in mice.

Hyperpolarized (HP) xenon-129 (129Xe) is an inhaled magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent with unique spectral and physical properties that can ...

Biotechnik

<meta charset="utf8"></head><body>Konservierung der Pilzsporenlokalisierung in der Lunge für die Fluoreszenzmikroskopie

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and bronchioles, branch until terminating in the alveolar airspace where gas exchange occurs. Infections originating in the bronchioles or alveoli elicit distinct host responses and disease manifestations. Therefore, understanding precisely where spores naturally localize in the lungs, particularly soon after infection, expands opportunities for investigation of host-pathogen interactions. Herein, we detail an in-situ analysis of lungs from mice infected with Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&#916; arthroconidia. Conventional methods for histological preservation involve liquid inflation of the airways with a fixative solution, which displaces the natural location of aspirated fungal particles, pushing spores from proximal bronchioles to terminal airspaces.
Conversely, this method of air-inflation with blood vasculature perfusion-fixation preserves the physiologic position of fungal spores within the bronchioles. Moreover, we describe a simple approach to cryopreserving, embedding, and imaging lung specimens. We also share high-throughput computational techniques via the open-source QuPath program to analyze the spatial distribution of fungal spores within the lung. The method presented here is simple and quick, requires minimal equipment to perform, and can be easily adapted for use with many respiratory fungal infection models.

<meta charset="utf8"></head><body>Effiziente Methode zur Bildgebung der Lunge von Mäusen, die die räumliche Dynamik von Pilzsporen in den Atemwegen bewahrt

We present a method for a fungal pathogenesis model that preserves the natural positioning of fungal spores in the lung airways for analysis via fluorescent microscopy.

Effiziente Methode zur Bildgebung der Lunge von Mäusen, die die räumliche Dynamik von Pilzsporen in den Atemwegen bewahrt

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and ...

Echtzeit-Röntgenbildgebung von Lungenflüssigkeitsvolumen in Neonatal Mauslunge

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster

Nachweis der Lungentumorprogression bei Mäusen durch Ultraschall-Bildgebung

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Vaskuläres Gießen von Erwachsenen und frühpostnatalen Mauslungen für Micro-CT Imaging

Eine multimodale Bildgebung Ansatz basierend auf Mikro-CT und Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für längs-Bewertung der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose bei Mäusen

Ein neonatales Bildgebungsmodell der gramnegativen bakteriellen Sepsis

Intravitale Weitfeldfluoreszenzmikroskopie der pulmonalen Mikrozirkulation bei experimenteller akuter Lungenschädigung mit einem vakuumstabilisierten Bildgebungssystem

Hyperpolarized ¹²⁹Xe Lung MRI and Spectroscopy in Mechanically Ventilated Mice

Effiziente Methode zur Bildgebung der Lunge von Mäusen, die die räumliche Dynamik von Pilzsporen in den Atemwegen bewahrt

Effiziente Methode zur Bildgebung der Lunge von Mäusen, die die räumliche Dynamik von Pilzsporen in den Atemwegen bewahrt