Este trabalho foi financiado pelo US Army Grant (W81XWH-08-1-0701) e uma bolsa de Carle Hospital Foundation.

Procedimento está em total compatibilidade com o número de protocolo do IACUC 13302 e foi aprovado pela divisão de recursos animais. 1. Instrumento Preparação <ol><li> Autoclave todos os instrumentos não descartáveis ​​usados ​​antes do procedimento cirúrgico para garantir a esterilidade. </li><li> Esterilizar instrumentos utilizados várias vezes em uma sessão com um esterilizador talão de vidro entre os usos. </li></ol> 2. Preparação Hidrogel <ol><li> Descongelar e células-tronco placa pelo menos 24 horas antes da criação do constructo hidrogel. </li><li> Prepare remendos um dia antes do procedimento cirúrgico usando um aparelho de estereolitografia (ou instrumento similar), que foi descrito em detalhes em publicações anteriores 8,18. </li><li> Para criar o hidrogel, gerar primeiro um design (CAD) modelo assistido por computador do patch desejado e exportar o projeto para o formato stereolithographic (STL). </li><li> Criar uma solução pré-gel por dissolving de poli (etilenoglicol) dimetacrilato (PEGDMA) em 1x PBS estéril para obter uma solução a 20% w / v. Ao mesmo tempo, dissolve-se o fotoiniciador 1- [4- (2-hidroxi-etoxi) -fenil] -2-hidroxi-2-metil-1-propano-1-ona em DMSO. Adicionar o fotoiniciador para a solução final de PEGDMA com um w / v de 0,5%. Directamente antes da reticulação, adicionar 100 ml de a densidade de células desejada. Nota: A densidade de células entre 2,0 x 10 5 -2,0 x 10 6 células / ml é recomendada. </li><li> Pipetar a solução de pré-gel em um prato no centro da plataforma de SLA e executar o software SLA com o desenho STL formatada previamente carregado. </li><li> Remover os remendos do aparelho e incubar os hidrogéis O / N em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro a 5% de bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, e 100 mg / ml de estreptomicina para permitir células para ajustar para o ambiente dentro do patch. </li></ol> 3. Preparação Animal e intubati Oralem <ol><li> Avalie cada rato antes do procedimento para garantir que o animal está em boas condições de saúde, como determinado a partir de seus hábitos de higiene e interações com seus companheiros de gaiola. Nota: fêmeas de 8-10 semanas de idade C57BL / 6J foram usadas para este procedimento, no entanto, qualquer tipo ou idade do rato pode ser utilizado. </li><li> Inserir os animais numa câmara de anestesia e expor a 5% de isofluorano com de 1 L / min de O2 suporte. Monitorar o nível de anestesia por toe pitada reflexo. </li><li> Uma vez que o animal está devidamente anestesiados, pesar e colocá-los no stand intubação. </li><li> Dirigir uma fonte de luz em direcção cavidade torácica do animal e utilizar uma pinça para retrair a superfície da laringe e expor as cordas vocais. Passe cuidadosamente um G angiocath 20 entre as cordas vocais, e suavemente inserir na traquéia. Detectar uma inserção correcta por um movimento mecânico da cavidade torácica uma vez que o cateter está ligado ao ventilador pequeno de animais. </li><li> Ajustar as definições de ventilação para poe peso do animal com base nas orientações do fabricante. </li><li> Uma vez entubado, colocar o animal em decúbito dorsal sobre uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia. Certifique-se de que a almofada de aquecimento não deve exceder 40 ° C. Se necessário, colocar uma barreira entre o animal e a almofada de aquecimento para minimizar a possibilidade de queimaduras. </li><li> Remover o cabelo do local cirúrgico através da utilização de um creme depilatório. Esterilizar o site por 3 esfrega alternadas de betadine e etanol 75% para garantir a esterilização adequada. Inserir uma cortina para expor apenas o local cirúrgico, e colocar veterinário unguento para os olhos para evitar a secura durante o procedimento. </li></ol> 4. Procedimento Cirúrgico <ol><li> A toracotomia é realizada no lado esquerdo do animal, portanto, fazer uma incisão na pele aproximadamente 1 cm para a esquerda do esterno, que atravessa o comprimento do esterno. </li><li> Use uma pinça para separar a camada muscular subjacente da caixa torácica em dois passos. Observar uma Delineating linha que representa os músculos peitorais maiores do animal. Levante esta muscular ligeiramente, separá-lo do músculo oblíquo externo subjacente e retrair medial. Em seguida, liberar o músculo oblíquo externo da caixa torácica subjacente da mesma maneira, e retrair lateralmente, proporcionando uma vista desafogada das segunda, terceira e quarta costelas. </li><li> Realizar a toracotomia entre a terceira ea quarta costelas. Suavemente levantar a quarta costela e usar um cauterizador para abrir a cavidade do peito entre as terceira e quarta costela. Coloque afastadores para abrir ainda mais a cavidade e expor o coração. </li><li> Use uma pinça para romper o pericárdio do coração fina. </li><li> Ligadura da artéria coronária esquerda com uma sutura de nylon 8-0 monofilamento. Coloque a sutura de aproximadamente 4 mm a partir do vértice do coração, directamente abaixo da extremidade inferior do átrio esquerdo. Determinar a colocação adequada de sutura por um branqueamento do miocárdio ventricular e um aumento no tamanho do átrio esquerdo, após o Suture foi amarrado. </li></ol> 5. remendo Colocação e Glue <ol><li> Manter manchas a 37 ° C e 5% de CO 2 condições até à sua utilização. </li><li> Suavemente levantar o remendo com uma espátula plana terminada e colocá-lo suavemente na superfície do coração, no local do enfarte. Nota: Para evitar que escorregue do ventrículo esquerdo, o patch pode ser mantido no lugar por levemente mantendo contato usando a espátula ou a ponta de um par de fórceps. </li><li> Preparar a cola por mistura de uma proporção de 4: 1 de fibrinogénio a trombina. Misture a solução por pipetagem repetida até que começa a engrossar, geralmente dentro de 1 min após o início da preparação. </li><li> Uma vez que a viscosidade da solução atinge o nível desejado, transferir rapidamente aproximadamente 10 ml a superfície do emplastro. Nota: O tempo de coagulação da cola de fibrina é rápido, proporcionando uma pequena janela de oportunidade para a transferência eficiente da cola. </li></ol> 6. Sutura <ol><li&gt; Executar todas as suturas de fechamento usando uma sutura de nylon 6-0 monofilamento. </li><li> Feche a camada de costela com 3-4 suturas interrompidas individuais. </li><li> Antes do fechamento completo da camada intercostal, inserir uma cânula de PE-10 para dentro da incisão para evacuar a cavidade torácica após o encerramento é completa e restabelecer a pressão intrapleural adequada. </li><li> Feche os músculos peitorais com 3-4 suturas interrompidas individuais. </li><li> Selar a camada de pele com sutura contínua. </li><li> Depois do encerramento completo, anexar uma seringa de 1,0 ml para a extremidade da cânula e usá-lo para evacuar a cavidade torácica. </li><li> Aplicar um adesivo de tecido para o local da incisão para reforçar o local da sutura. </li></ol> 7. O tratamento pós-operatório <ol><li> Submeter ratinhos uma injecção de buprenorfina (0,05-1,0 mg / kg) e carprofeno (2,2 mg / kg) por via subcutânea imediatamente após a ligação coronária e pelo menos 20 min antes da avivamento. Administrar as duas drogas 6-8 horas após a cirurgiaE, em seguida, dar duas vezes por dia por até três dias para controlar a dor e angústia. </li><li> Monitorar continuamente os animais até consciente e cada hora para a seguinte primeira cirurgia 4 horas. Realize um segundo exame a noite da cirurgia (2-4 horas mais tarde) para administrar uma segunda dose de analgésico. </li><li> Monitorar os animais diariamente após o segundo dia após o procedimento, até que os animais parecem estáveis. </li></ol> 8. Análise da função cardíaca e Histologia <ol><li> Realizar ecocardiógrafos nos ratos 4 semanas após o procedimento para determinar a extensão dos danos após a MI. </li><li> Anestesiar ratos com 4-5% de isoflurano dentro de uma câmara de anestesia para a indução da anestesia inalatória e, em seguida 2% de isoflurano através de máscara facial para manutenção da anestesia. </li><li> Limpe a área de imagem com um creme depilatório e usar um pequeno ultra-som animal para obter uma varredura ecocardiografia 2D M-mode do batimento cardíaco e gravar os parâmetros asso funcionalciados com ele. </li><li> Eutanásia os ratos numa câmara de dióxido de carbono, em seguida, recolher os corações dos animais e em lugar de uma solução de formalina a 10% durante 24 h. Após 24 horas, transferir os corações para 70% de etanol e manter a 4 ° C até o processamento de tecidos. </li><li> Processar os corações e incorporá-los em blocos de parafina. </li><li> Cortar 5 milímetros secções através da região ventricular do coração, começando no vértice e terminando no átrio. </li><li> Stain fatias com tanto tricrômico de Masson e hematoxilina e eosina utilizando protocolos padrão segmentado. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Com esta abordagem para o modelo murino MI, desenvolvemos um sistema que minimiza o dano para as zonas não miocárdio, que estão associados a outras técnicas de MI de murino. Estas áreas incluem danos causados ​​por uma traqueostomia, o corte da camada muscular, e à ruptura de nervuras para expor a cavidade torácica. Nós acreditamos que estas mudanças melhorar os resultados globais cirúrgicos graças ao cuidado para manter o máximo das principais estruturas, incluindo as costelas e camadas musculares, intacta durante o procedimento cirúrgico. Deve notar-se que existem algumas limitações para esta técnica, com a maior sendo a sua natureza morosa, resultando em apenas 8-10 procedimentos cirúrgicos completos num único dia. Para superar isto, um segundo ventilador pode ser utilizado, permitindo que o procedimento a ser realizado em dois animais simultaneamente. Além disso, grandes vasos, tais como os vasos intercostais einterior artéria torácica, devem ser evitadas quando se realiza a toracotomia. Se perto de um destes recipientes, um cauterizador deve ser usada para evitar o sangramento devido a ruptura de uma artéria. A cola de fibrina é conhecido tanto no laboratório e na clínica, graças à sua capacidade para ajudar rapidamente a formação de coágulos, bem como o seu potencial para entregar e MSCs hospedeiras 14-17,19. Para os nossos propósitos, a cola de fibrina serve como uma abordagem biocompatível para aderir um hidrogel à base de água para construir a superfície do coração. A utilização de uma cola à base de fibrina tem sido bem sucedida em manter a construção de hidrogel no local danificado durante até 8 semanas, com a possibilidade de contacto com o tecido de um longo período de tempo. A utilização deste sistema permitiu a adesão de controlo para a colocação do construto delicada, sem a necessidade de suturas adicionais que prejudicam o miocárdio, bem como a própria construção. Verificou-se que a própria cola não é tóxico para as células encapsuladas umO ND não afectar negativamente o tecido subjacente. O hidrogel e do sistema de cola à base de fibrina pode ser aplicada a uma variedade de outras finalidades de engenharia de tecidos que desejam célula ou contacto terapêutico por um período prolongado de tempo. Além disso, com a utilização do método de fabricação de SLA, desenhos e estruturas podem ser incorporados dentro do remendo para criar um sistema mais complexo para a entrega de célula 18. Um revés para a utilização da cola à base de fibrina é o facto de mais do que um investigador deve estar presente na sala durante a colocação cirúrgica de remendo e adição de cola. É o trabalho do primeiro pesquisador para garantir que o sistema permanece no lugar e não se perder na cavidade torácica, enquanto o segundo investigador mistura a solução e aplica-lo para o patch depois de viscosidade adequada é atingido. Para optimizar o momento da entrega cola, sugere-se que o segundo investigador e também testa vezes a gelificação da cola antes da colocação do remendo,desde gelificação adequada da cola utilizada é crítica para a aderência remendo. Há uma série de passos críticos e áreas propensas erro no âmbito do protocolo, com a primeira sendo a indução do infarto do miocárdio. É imperativo para verificar se há sinais, tais como o branqueamento da parede do ventrículo esquerdo e do alargamento do átrio esquerdo, para garantir a oclusão da artéria coronária esquerda. Isto pode ser feito antes da adição do ponto de cruzamento e simplesmente apertando a extremidade das cordas de sutura. Se for determinado que a artéria coronária esquerda não está fechada por sutura, a cadeia pode ser retirado e reaplicado. A segunda medida é crítica para continuar a acompanhar o tubo de intubação durante todo o procedimento, para garantir que ele permaneça dentro da traquéia e não ficar puxado para fora meados de cirurgia. Finalmente, durante toda a cirurgia, todas as tentativas devem ser feitas para evitar o contato com os pulmões, como qualquer contato tem o potencial de levar a um colapso pulmonar.Se, durante a cirurgia, colapso do pulmão ocorre, simplesmente bloquear o tubo de saída do intubator por até 3 segundos em uma tentativa de re-inflacionar regiões conturbadas dos pulmões.

Um enfarte do miocárdio (MI) é definida como a interrupção de sangue para uma região do coração causada por oclusão de uma artéria coronária principal. O dano resultante de um MI é devido à remodelação do tecido cardíaco viável em tecido cicatricial não-funcional, o que diminui a capacidade do coração ou, mais especificamente, no ventrículo esquerdo, para bater apropriadamente. Isto resulta numa diminuição no volume de sangue que pode ser entregue ao corpo com cada batimento cardíaco, conhecido como o volume de curso, e a percentagem de sangue que é bombeado para fora do coração com cada batimento cardíaco, conhecido como a fracção de ejecção 6. Estas, juntamente com outras funções diminuídas, aumenta a pressão sobre o resto do coração para manter a função adequada. Muitas vezes, esse aumento da pressão pode se tornar tão grave que faz com que um segundo ataque cardíaco, um fenômeno visto em aproximadamente 10% dos indivíduos 7. Enquanto práticas médicas têm evoluído para tratarrescaldo de um MI, nenhuma técnica foi desenvolvida para parar, reduzir ou reverter os efeitos colaterais negativos da remodelação do tecido. Terapias com células-tronco surgiram como uma via possível para um tal tratamento, no entanto, apesar do seu potencial promissor, as células-tronco não têm sido bem sucedidos no contexto clínico. Uma teoria para as suas deficiências é a incapacidade de garantir as células benéficos permanecer no local de enfarte longo o suficiente para gerar resultados favoráveis ​​5. Demonstrou-se que não mais do que 24% de células que são simplesmente injectada no local de enfarte sobreviveram e permaneceram no local danificado um dias pós-parto 2. A perspectiva possível para resolver este problema de retenção celular é desenvolver sistemas de hidrogel biocompatíveis que encapsulam células ou terapêuticas, que podem ser entregues com o sítio danificado. O hidrogel de escolha neste protocolo é um poli (etileno-glicol) dimetacrilato devido ao seu uso anterior em encapsulamento de células procedures, no entanto, qualquer hidrogel capaz de encapsulação pode ser utilizado 8. A entrega do remendo directamente para o local da lesão assegura o contacto célula-a-tecido durante um período prolongado de tempo, aumentando o período de tempo as células podem fornecer factores benéficos para o miocárdio subjacente. Um gargalo para o remendo abordagem é a dificuldade de fazer aderir o penso à superfície do coração. Muitos grupos superar este através de uma variedade de técnicas, sendo o mais prevalente de uma sutura simples amarrar a construção à superfície do coração de 9,10. Isto tem sido bem sucedida num certo número de casos em que a construção é feita de um material mais rígido, mas falha quando tentada em um sistema de hidrogel, devido à concentração elevada de água e delicada natureza da construção remendo. Para superar isto, nós utilizamos um sistema de adesivo externa cola de fibrina que imita a química da formação de coágulos. A cola de fibrina tem sido utilizada em vários gabinetes médicos, Including lágrimas Dura, fístulas brônquicas, e transplante da córnea, destacando a biocompatibilidade do produto na forma de um selante de ferida 11-13. Além disso, a fibrina tem sido usado para uma variedade de fins cardíacas, incluindo o tratamento cirúrgico das rupturas do ventrículo esquerdo e cirurgias de revascularização miocárdica, no entanto, a sua utilização como uma cola de aderência para uma correção cardíaca não é comumente usado 14-17. Uma formulação simples de trombina e fibrinogénio resulta em uma cola biocompatível que pode ser colocado directamente no lado de fora de um remendo cardíaca externa, proporcionando um sistema de adesão viável para garantir a interacção remendo coração.

<table><tbody><tr><td>Harvard Model 687 Mouse Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-0001</td><td></td></tr><tr><td>Inintech Biosciences LLC Dry Glass Bead Sterilizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9531961</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ6 surgical microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cautery Kit</td><td>Gemini</td><td>GEM 5917</td><td></td></tr><tr><td>Delicate Forceps - 0.4 mm Tips Angled</td><td>Fine Science Tools</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>Agricola Retractor - 3.5 cm Spread</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors - 2.5 mm Blades Straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Needle Holder - w/Lock Tungsten Carbide 14 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors - Delicate Straight 10.5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>8-0 monofilament suture</td><td>Ethicon</td><td>8730P</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Silk suture</td><td>Ethicon</td><td>639G</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T7009</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond Tissue Adhesive</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr></tbody></table>

a hydrogel construct and fibrin-based glue approach to deliver therapeutics in a murine myocardial infarction model.

The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of treatments in vivo1. The traditional, established protocol has been further fine-tuned to minimize the damage to the animal. Notably, the pectoral muscle layers are teased away rather than simply cut, and the thoracotomy is approached intercostally as opposed to breaking the ribs in a sternotomy, preserving the integrity of the ribcage. With these changes, the overall stress on the animal is decreased. 
Stem cell therapies aimed to alleviate the damage caused by MIs have shown promise over the years for their pro-angiogenic and anti-apoptotic benefits. Current approaches of delivering cells to the heart surface typically involve the injection of the cells either near the damaged site, within a coronary artery, or into the peripheral blood stream2-4. While the cells have proven to home to the damaged myocardium, functionality is limited by their poor engraftment at the site of injury, resulting in diffusion into the blood stream5. This manuscript highlights a procedure that overcomes this obstacle with the use of a cell-encapsulated hydrogel patch. The patch is fabricated prior to the surgical procedure and is placed on the injured myocardium immediately following the occlusion of the left coronary artery. To adhere the patch in place, biocompatible external fibrin glue is placed directly on top of the patch, allowing for it to dry to both the patch and the heart surface. This approach provides a novel adhesion method for the application of a delicate cell-encapsulating therapeutic construct.

Durante o procedimento cirúrgico, a ligação da artéria coronária esquerda pode ser identificado por um acentuado branqueamento a jusante da artéria oclusa. Como um teste antes de amarrar o nó, a sutura pode ser apertado brevemente para verificar se ele está no lugar apropriado. Além disso, uma vez que a oclusão da artéria os resultados na redução quase instantâneo na capacidade do átrio esquerdo para bater apropriadamente, átrio esquerdo irá aumentar em resposta a um refluxo de sangue no sistema. Medições de ecocardiografia em modo-M tomado tão cedo quanto dois dias pós-infarto mostrar uma cessação de movimento da parede esquerda, indicativo da reconstrução muscular. Cálculos qualitativos feitos a partir dos dados mostram uma diminuição da fração de ejeção e volume sistólico nos corações infartados. No final da experiência, quando os corações são recolhidos para fins histológicos, uma clara dilatação do ventrículo esquerdo, pode ser visto, juntamente com um adelgaçamento do ventrículo esquerdoda parede, e a deposição de colagénio que indica a deposição de tecido de cicatriz no local de funcionamento cardiomiócitos (Figura 1). Também visto na análise histológica é a presença do hidrogel construir graças à administração do gel de fibrina (Figura 2). Para nossos propósitos, o sistema adesivo deve ser suficiente para permitir o controle posicionamento preciso e minimizar o escoamento subsequente em órgãos circunvizinhos viscoso, mas o suficiente para não maleável para interferir com a função do coração. Foram realizados testes preliminares para calcular a viscosidade, tempo de gelificação, e a rigidez de várias proporções de fibrinogénio / trombina, a fim de determinar a combinação adequada que se adapte às nossas necessidades. Análise in vivo foi realizada para testar a capacidade da cola de fibrina para manter patch- -adesão ao tecido permitindo ainda para a função cardíaca completo (dados não mostrados). Deve notar-se que a cola de fibrina não prejudicar o miocárdio, tal como evidenciado pela lack de remodelação do tecido ou afinamento ventricular no local (Figura 2). Os cardiomiócitos permanecem intactas apesar da adição de um emplastro tanto cardíaca e sua cola que acompanha. Além disso, o teste de viabilidade que confirma que a administração de cola de fibrina para a superfície externa de um emplastro de hidrogel encapsulando células não afectou a sobrevivência das células dentro do remendo (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52562/52562fig1.jpg" /> Figura 1:. Coronários Artery Resultados Ligadura deixado em uma diminuição da função cardíaca medida ao ecocardiograma modo-M ecocardiografia de saudáveis ​​(a) e infartados (b) corações. Corações infartados mostram uma clara falta de movimento da parede onde o tecido viável foi substituído por tecido cicatricial. Isso se correlaciona com uma diminuição mensurável na fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FE), acidente vascular cerebral cardíacade volume (SV), e o débito cardíaco (CO). A análise histológica de saudável (c) e (d) corações infartados mostra dilatação do ventrículo esquerdo e afinamento da parede do ventrículo esquerdo do miocárdio infartado, ambos os sinais de remodelação do tecido e deposição de tecido cicatricial. Imagens histológicas são fatias secções transversais que capturam a menor (câmara) ventrículos direito e esquerdo (maior câmara) e. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52562/52562fig2.jpg" /> Figura 2:. Aplicação de fibrina Flue Garante remendo Adesão ao coração O penso é colocado sobre a superfície do coração, enquanto a cavidade torácica é exposto durante o procedimento (a). Uma vez colocado, uma cola à base de fibrina é adicionado no topo do coração e deixou-se secar. O patch pode ser claramente visto em cortes histológicos de tecido cardíaco que foram coletadas em uma semana pós-procedimento (b).Dissociação do remendo da superfície do coração em imagens histológicas é um artefato do processo de cobrança e corte. Os resultados são consistentes até 8 semanas de adesão. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52562/52562fig3.jpg" /> Figura 3: cola à base de fibrina-não prejudique encapsulados Tecidos A viabilidade celular foi medida através de análise MTT de 1 semana após a administração de uma cola à base de fibrina utilizando protocolos descritos em pormenor em publicações anteriores 8.. A viabilidade das células dentro do emplastro não foi afectada pela adição da cola à superfície da construção.

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A Hydrogel Construct and Fibrin-based Glue Approach to Deliver Therapeutics in a Murine Myocardial Infarction Model.

This protocol aims to alleviate the limitation of poor cell engraftment for stem cell treatment of myocardial infarctions through the use of a hydrogel system and a fibrin-based glue. With this approach, cell-to-tissue contact post-infarction can be maintained, increasing the therapeutic potential of beneficial agents at the site of injury.

Um hidrogel Construir e fibrina à base de cola Approach to Deliver Therapeutics em um Infarto do Miocárdio modelo murino.

The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of ...

a-hydrogel-construct-fibrin-based-glue-approach-to-deliver

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

8.6K visualizações.  University of Illinois at Urbana-Champaign. This protocol aims to alleviate the limitation of poor cell engraftment for stem cell treatment of myocardial infarctions through the use of a hydrogel system and a fibrin-based glue. With this approach, cell-to-tissue contact post-infarction can be maintained, increasing the therapeutic potential of beneficial agents at the site of injury.

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Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

Biologicamente fabricação de materiais derivados injetável para Engenharia de Tecidos do Miocárdio

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Bioengenharia

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering 

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying cellular responses under various culture conditions in vitro. The three dimensional environment more closely mimics what the cells observe in vivo due to the application of mechanical and chemical stimuli in all dimensions 1. Three-dimensional hydrogels can either be made from synthetic polymers such as PEG-DA 2 and PLGA 3 or a number of naturally occurring proteins such as collagen 4, hyaluronic acid 5 or fibrin 6,7. Hydrogels created from fibrin, a naturally occurring blood clotting protein, can polymerize to form a mesh that is part of the body's natural wound healing processes 8. Fibrin is cell-degradable and potentially autologous 9, making it an ideal temporary scaffold for tissue engineering.
Here we describe in detail the isolation of neonatal cardiomyocytes from three day old rat pups and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. Neonatal myocytes are a common cell source used for in vitro studies in cardiac tissue formation and engineering 4. Fibrin gel is created by mixing fibrinogen with the enzyme thrombin. Thrombin cleaves fibrinopeptides FpA and FpB from fibrinogen, revealing binding sites that interact with other monomers 10. These interactions cause the monomers to self-assemble into fibers that form the hydrogel mesh. Because the timing of this enzymatic reaction can be adjusted by altering the ratio of thrombin to fibrinogen, or the ratio of calcium to thrombin, one can injection mold constructs with a number of different geometries 11,12. Further we can generate alignment of the resulting tissue by how we constrain the gel during culture 13.
After culturing the engineered cardiac tissue constructs for two weeks under static conditions, the cardiac cells have begun to remodel the construct and can generate a contraction force under electrical pacing conditions 6. As part of this protocol, we also describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including functional analysis of the active force generated by the cardiac muscle construct upon electrical stimulation, as well as methods for determining final cell viability (Live-Dead assay) and immunohistological staining to examine the expression and morphology of typical proteins important for contraction (Myosin Heavy Chain or MHC) and cellular coupling (Connexin 43 or Cx43) between myocytes.

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

We describe the isolation of neonatal cardiomyocytes and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. We describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including active force generated upon electrical stimulation and cell viability and immunohistological staining.

Encapsulamento de Cardiomyocytes em um hidrogel de fibrina para engenharia de tecidos cardíacos

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Cell-based Therapy for Heart Failure in Rat: Double Thoracotomy for Myocardial Infarction and Epicardial Implantation of Cells and Biomatrix

Cardiac cell therapy has gained increasing interest and implantation of biomaterials associated with cells has become a major issue to optimize myocardial cell delivery. Rodent model of myocardial infarction (MI) consisting of Left Anterior Descending Artery (LAD) ligation has commonly been performed via a thoracotomy; a second open-heart surgery via a sternotomy has traditionally been performed for epicardial application of the treatment. Since the description of LAD ligation model, post-surgery mortality rate has dropped from 35-13%, however the second surgery has remained critical. In order to improve post-surgery recovery and reduce pain and infection, minimally invasive surgical procedures are presented.&#160;Two thoracotomies were performed, the initial one for LAD ligation and the second one for treatment epicardial administration. Biografts consisting of cells associated with solid or gel type matrices were applied onto the infarcted area.&#160;LAD ligation resulted in loss of heart function as confirmed by echocardiography performed after 2 and 6 weeks. Goldner trichrome staining performed on heart sections confirmed transmural scar formation. First and second surgeries resulted in less that 10%&#160;post-operative mortality.&#160;

Implantation of a biograft to treat myocardial infarction induced by LAD ligation in a rodent model has conventionally required two open-heart surgeries. In order to reduce mortality and provide optimal conditions for fixation of solid and gelatinous biomatrices associated with cells, minimally invasive procedures have been developed.

Terapia Celular para insuficiência cardíaca em Rat: Double toracotomia para infarto do miocárdio e Epicárdica implante de células e Biomatrix

Cardiac cell therapy has gained increasing interest and implantation of biomaterials associated with cells has become a major issue to optimize myocardial ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. Several commercial extracellular matrix products are available as hydrogels or membranes, but these do not possess tissue-specific biological activity. Because perfusion decellularization is usually not possible with human heart tissue, we developed a 3-step immersion decellularization process. Human myocardial slices procured during surgery are first treated with detergent-free hyperosmolar lysis buffer, followed by incubation with the ionic detergent, sodium dodecyl sulfate, and the process is completed by exploiting the intrinsic DNase activity of fetal bovine serum. This technique results in cell-free sheets of cardiac extracellular matrix with largely preserved fibrous tissue architecture and biopolymer composition, which were shown to provide specific environmental cues to cardiac cell populations and pluripotent stem cells. Cardiac extracellular matrix sheets can then be further processed into a microparticle powder without further chemical modification, or, via short-term pepsin digestion, into a self-assembling cardiac extracellular matrix hydrogel with preserved bioactivity.

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

This protocol describes the complete decellularization of human myocardium while preserving its extracellular matrix components. Further processing of the extracellular matrix results in the production of microparticles and a cytoprotective self-assembling hydrogel.

Processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para In Vitro e In Vivo de aplicações

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Biologia do Desenvolvimento

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the limited access to donor hearts. An example of a treatment to recover the function of the heart consists of the local delivery of drugs and bioactives from a hydrogel. In this paper a method is introduced to formulate and inject a drug-loaded hydrogel non-invasively and side-specific into the pig heart using a long, flexible catheter. The use of 3-D electromechanical mapping and injection via a catheter allows side-specific treatment of the myocardium. To provide a hydrogel compatible with this catheter, a supramolecular hydrogel is used because of the convenient switching from a gel to a solution state using environmental triggers. At basic pH this ureido-pyrimidinone modified poly(ethylene glycol) acts as a Newtonian fluid which can be easily injected, but at physiological pH the solution rapidly switches into a gel. These mild switching conditions allow for the incorporation of bioactive drugs and bioactive species, such as growth factors and exosomes as we present here in both in vitro and in vivo experiments. The in vitro experiments give an on forehand indication of the gel stability and drug release, which allows for tuning of the gel and release properties before the subsequent application in vivo. This combination allows for the optimal tuning of the gel to the used bioactive compounds and species, and the injection system.

Supramolecular hydrogelators based on ureido-pyrimidinones allow full control over the macroscopic gel properties and the sol&#8211;gel switching behavior using pH. Here, we present a protocol for formulating and injecting such a supramolecular hydrogelator via a catheter delivery system for local delivery directly in relevant areas in the pig heart.

Um Supramolecular hidrogel injetável e carregado com a droga para a injeção local por cateter no coração de porco

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes in myocardial ischemia and to develop and optimize future treatment.
Two different methods of creating myocardial ischemia are performed in laboratory rodents. The first method is to create cryo infarction, a fast but inaccurate technique, where a cryo-pen is applied on the surface of the heart (1-3). Using this method the scientist can not guarantee that the cryo-scar leads to ischemia, also a vast myocardial injury is created that shows pathophysiological side effects that are not related to myocardial infarction. The second method is the permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD). Here the LAD is ligated with one single stitch, forming an ischemia that can be seen almost immediately. By closing the LAD, no further blood flow is permitted in that area, while the surrounding myocardial tissue is nearly not affected. This surgical procedure imitates the pathobiological and pathophysiological aspects occurring in infarction-related myocardial ischemia.
The method introduced in this video demonstrates the surgical procedure of a mouse infarction model by ligating the LAD. This model is convenient for pathobiological and pathophysiological as well as immunobiological studies on cardiac infarction. The shown technique provides high accuracy and correlates well with histological sections.

This video demonstrates how to use a fast and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of myocardial ischemia.

LAD Ligadura: Um Modelo murino de Infarto do Miocárdio

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes ...

Biologia

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and repair damage in simple tissues in the orthopedic and periodontal fields. However, attempts to regenerate the structures and functions of more complex three-dimensional (3D) organs such as lungs have not been very successful because the biological processes of organ regeneration have not been well explored. It is becoming clear that angiogenesis, the formation of new blood vessels, plays key roles in organ regeneration. Newly formed vasculatures not only deliver oxygen, nutrients and various cell components that are required for organ regeneration but also provide instructive signals to the regenerating local tissues. Therefore, to successfully regenerate lungs in an adult, it is necessary to recapitulate the lung-specific microenvironments in which angiogenesis drives regeneration of local lung tissues. Although conventional in vivo angiogenesis assays, such as subcutaneous implantation of extracellular matrix (ECM)-rich hydrogels (e.g., fibrin or collagen gels or Matrigel - ECM protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells), are extensively utilized to explore the general mechanisms of angiogenesis, lung-specific angiogenesis has not been well characterized because methods for orthotopic implantation of biomaterials in the lung have not been well established. The goal of this protocol is to introduce a unique method to implant fibrin gel on the lung surface of living adult mouse, allowing for the successful recapitulation of host lung-derived angiogenesis inside the gel. This approach enables researchers to explore the mechanisms by which the lung-specific microenvironment controls angiogenesis and alveolar regeneration in both normal and pathological conditions. Since implanted biomaterials release and supply physical and chemical signals to adjacent lung tissues, implantation of these biomaterials on diseased lung can potentially normalize the adjacent diseased tissues, enabling researchers to develop new therapeutic approaches for various types of lung diseases.

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

Implantação de fibrina Gel no tapete do pulmão para o Estudo de angiogênese Lung-specific

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

Medicina

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other biologicals that enhance angio- or vasculogenesis into the infarct border zone (IBZ), tissue perfusion is improved, and the myocardium can be protected from further damage. For maximum therapeutic effect, it is hypothesized that the regenerative substance is best delivered to the IBZ. This requires accurate injections and has led to the development of new injection techniques. To validate these new techniques, we have designed a validation protocol based on myocardial tissue analysis. This protocol includes whole-heart myocardial tissue processing that enables detailed two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) analysis of the cardiac anatomy and intramyocardial injections. In a pig, myocardial infarction was created by a 90-min occlusion of the left anterior descending coronary artery. Four weeks later, a mixture of a hydrogel with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) and fluorescent beads was injected in the IBZ using a minimally-invasive endocardial approach. 1 h after the injection procedure, the pig was euthanized, and the heart was excised and embedded in agarose (agar). After the solidification of the agar, magnetic resonance imaging (MRI), slicing of the heart, and fluorescence imaging were performed. After image post-processing, 3D analysis was performed to assess the IBZ targeting accuracy. This protocol provides a structured and reproducible method for the assessment of the targeting accuracy of intramyocardial injections into the IBZ. The protocol can be easily used when the processing of scar tissue and/or validation of the injection accuracy of the whole heart is desired.

This protocol describes a novel method for the 3D comparison of whole-heart myocardial tissue with MRI. This is designed for the accurate assessment of intramyocardial injections in the infarct border zone of a chronic porcine model of myocardial infarction.

Análise Tecidos do Miocárdio Whole-coração 3D

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ligation is a challenging procedure and has a high mortality rate due to its nature. We developed a method to consistently transplant bioprinted patches of cells and hydrogels onto the epicardium of an infarcted mouse heart to test their regenerative properties in a robust and feasible way. First, a deeply anesthetized mouse is carefully intubated and ventilated. Following left lateral thoracotomy (surgical opening of the chest), the exposed LAD is permanently ligated and the bioprinted patch transplanted onto the epicardium. The mouse quickly recovers from the procedure after chest closure. The advantages of this robust and quick approach include a predicted 28-day mortality rate of up to 30% (lower than the 44% reported by other studies using a similar model of permanent LAD ligation in mice). Moreover, the approach described in this protocol is versatile and could be adapted to test bioprinted patches using different cell types or hydrogels where high numbers of animals are needed to optimally power studies. Overall, we present this as an advantageous approach which may change preclinical testing in future studies for the field of cardiac regeneration and tissue engineering.

This protocol aims to transplant a 3D bioprinted patch onto the epicardium of infarcted mice modeling heart failure. It includes details regarding anesthesia, the surgical chest opening, permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery and application of a bioprinted patch onto the infarcted area of the heart.

Transplante de um Patch Bioimpresso 3D em um modelo murino de infarto do miocárdio

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

3D Human Myocardial Tissue Generation Using Melt Electrospinning Writing of Polycaprolactone Scaffolds and hiPSC-Derived Cardiac Cells

The development of functional human cardiac tissues holds significant promise for advancing applications in drug screening, disease modeling, and regenerative medicine. This protocol describes the stepwise fabrication of 3D myocardial tissues with advanced mimicry of native cardiac structure by combining melt electrospinning writing (MEW) polycaprolactone (PCL) scaffolds with fibrin hydrogels and human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived cardiac cells. The process involves embedding a mixture of cardiomyocytes (hiPSC-CMs) and cardiac fibroblasts (hiPSC-CFs) within a fibrin matrix to create mini-tissues, with structural support provided by MEW-generated scaffolds. These fibrillar scaffolds are fabricated at the micro- to nanoscale, allowing for precise control over fiber architecture, which plays a key role in organizing cell distribution and alignment. Meanwhile, the fibrin matrix promotes cell viability and mimics the extracellular environment. Characterization of the generated tissues reveals well-organized sarcomeres within hiPSC-CMs, along with stable contractile activity. The tissues demonstrate consistent spontaneous beating as early as two days post-seeding, with sustained functionality over time. The combination of hiPSC-CFs with hiPSC-CMs enhances the structural integrity of the tissues while supporting long-term cell viability. This approach offers a reproducible, adaptable, and scalable method for creating biomimetic cardiac tissue models, providing a versatile platform for preclinical drug testing, mechanistic studies of cardiac disease, and potential regenerative therapies.

A reproducible method is presented to generate 3D myocardial tissues combining melt electrospinning writing (MEW) polycaprolactone (PCL) scaffolds and fibrin hydrogels with hiPSC-derived cardiomyocytes and fibroblasts. This technique offers precise control over scaffold architecture and can be applied in preclinical drug testing and cardiac disease modeling.