Name: implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis
Uploaded: 2014-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
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Este trabalho foi financiado por fundos da American Heart Association (AM), Departamento de Defesa dos EUA (BC074986), e do Boston Children Hospital Faculdade Career Development Fellowship (TM, AM). Os autores agradecem a Amanda Jiang e Elisabeth Jiang para assistência técnica.

NOTA: O estudo in vivo em animais foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde. O protocolo foi revisto e aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal do Hospital Infantil de Boston (números de protocolo: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Todos os medicamentos utilizados neste protocolo são de grau farmacêutico e esses medicamentos são preparados em condições estéreis. 1. Preparação de fibrina Gel <ol><li> Prepare gel de fibrina que contém o VEGF e bFGF. <ol><li> Descongelar as soluções estoque de fibrinogénio e trombina que são armazenadas a -80 ° C até à temperatura ambiente (25 ° C). </li><li> Adicionar trombina (concentração final: 2,5 U / ml), CaCl2 (concentração final: 45 mM), de VEGF (concentração final: 0-100 ng / ml) e bFGF (concentração final: 0-100 ng / ml) para o fibrinogénio solução (concentração final: 12,5 mg / ml em 0,9% sodium uma solução de cloreto 43-45) em um tubo de 1,5 ml. </li><li> Misture delicadamente por pipetagem. </li><li> Pipeta suavemente 200 ul da mistura num prato de plástico estéril de uma forma gota a gota, usando uma pipeta de ponta p200. </li><li> Incubar as gotas a 37 ° C durante 30-60 minutos até se solidificar. NOTA: O gel solidificado pode ser mantido no prato de plástico selado à temperatura ambiente (25 ° C) durante várias horas antes da implantação (Figura 1a). </li></ol></li><li> Apare o gel de fibrina em aproximadamente 3 x 3 x 3 cubos mm utilizando pequenas tesouras cirúrgicas antes da implantação. </li></ol> 2. Preparação do rato <ol><li> Anestesiar rato adulto (8-12 semanas) por injecção intraperitoneal (IP) de injecção de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e confirmam que o rato é adequadamente anestesiados por beliscar dedo do pé do rato. <ol><li> Use vet pomada nos olhos do mouse para prevenir o ressecamento durante o experimento. </li></ol></li><li> Shave fur sobre o lado esquerdo da caixa torácica do mouse. </li><li> Execute entubação endotraqueal do mouse. </li><li> Posicione o mouse sobre a intubação ficar em ângulo de 70 ° e segure o mouse no lugar ligando seus incisivos superiores ao longo de um pequeno anel de borracha localizado na parte superior do suporte. </li><li> Gentilmente retrair a língua de um lado usando uma pinça sem corte. </li><li> Visualizar a laringe, com o auxílio de um microscópio de pescoço de ganso iluminador de fibra óptica. </li><li> Insira endotraqueal cateter elástico (21 G) na traquéia. </li><li> Confirme se o mouse está respirando espontaneamente de uma forma suave (regular 100-150 ciclos / min, sem respiração paradoxal ou superficial). </li><li> Posicione o mouse em posição frontal sob o microscópio de dissecação. </li><li> Mecanicamente ventilar o mouse utilizando um ventilador de roedor (150 ciclos / min e 7 ml / kg volume corrente). </li><li> Contagem costelas para localizar espaço intercostal entre 4ª e 5ª costela. </li><li> Criar um campo estéril sobre a área by completamente limpando com álcool e iodopovidona. Cubra o campo cirúrgico adequadamente com um campo cirúrgico estéril. </li></ol> 3. Rato Cirurgia <ol><li> Após a injecção local de bupivacaína a 0,25% (200 ul) na pele, fazer uma incisão cutânea transversal (cerca de 1 cm de comprimento) sobre o espaço intercostal com tesouras de dissecção. </li><li> Após a injeção de bupivacaína a 0,25% (200 mL) no músculo intercostal, fazer uma incisão do músculo entre a 4ª e 5ª costela usando uma tesoura pequena multa. </li><li> Insira um afastador dissecando entre as costelas para visualizar totalmente o pulmão esquerdo. <ol><li> Raspe uma pequena área (1 x 1 mm quadrados) de pleura visceral do centro de pulmão esquerdo usando uma pinça fina. </li><li> Aplique uma leve pressão sobre a área usando um cotonete estéril até que o sangramento e vazamentos são totalmente controlados. </li><li> Coloque pequena quantidade de mistura fresca de fibrinogénio / trombina (cola de fibrina) (passo 1.1.2. 20 &amp; #181; l) sobre a área usando ponta p200 pipeta. </li></ol></li><li> Suavemente colocar um gel de fibrina (passo 1.2), utilizando pequenas pinças sobre a área (Figura 1b). <ol><li> Confirmar que o gel é bem fixo na área durante os movimentos respiratórios dos pulmões. </li></ol></li><li> Certifique-se de que não existe nem enorme vazamento de ar, nem hemorragia do pulmão. </li><li> Fechar incisões (camadas de músculo e pele) com sutura absorvível, que não tem de ser removido. </li><li> Aspirar a cavidade torácica com 27 G agulha e seringa de 1 ml para evitar pneumotórax. </li><li> Terminar ventilação mecânica. </li></ol> 4. Rato Recovery <ol><li> Verifique se o mouse está respirando espontaneamente de uma forma suave (regular 100-150 ciclos / min, sem respiração paradoxal ou superficial). </li><li> IP injectar 1 ml de pré-aquecido 0,9% de NaCl para evitar a desidratação. </li><li> Permitir mouse para recuperar na almofada de água quente circulante. </li><li> Remover o endotrachetubo al depois de confirmar que o rato tem respiração estável. </li><li> Injectar meloxicam (5 mg / kg, injecção subcutânea (SC), durante 3 dias como analgésico pós-operatório. </li><li> Monitorar os movimentos do mouse com cuidado em um mínimo de 15 minutos de intervalo até que seja esternal (capaz de rolar sua estômago e permanecer em pé) e consciente. </li><li> Após a recuperação, o retorno do mouse para uma nova gaiola isolada de ratos sem cirurgia. </li><li> Monitorar o local da cirurgia para sinais de infecção (vermelhidão, inchaço, secreção), funções biológicas básicas do animal (alimentos e água ingestão, urinar, defecar, ganho de peso corporal), bem como sinais clínicos de angústia (piloerection, reduziu a locomoção) diariamente após a procedimento cirúrgico. </li></ol> 5. A colheita do Pulmão <ol><li> 7 a 30 dias após a implantação, eutanásia do rato usando CO 2 através fonte de gás comprimido. </li><li> Faça uma incisão entre a ponta do apêndice xifóide eo esternoentalhe (esternotomia mediana) e toda a colheita de pulmão com o gel implantado para análise histológica e bioquímica, cortando a traqueia e dissecar todas as conexões com o coração, pulmões e traquéia. </li><li> Corrigir gel implantado com pulmão com solução de paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ºC, incorporar em composto OCT, e tomar seções passo em série de 30 mm de espessura. </li><li> Execute histológico (hematoxilina e eosina) e análises de imuno-histoquímica (marcador endotelial: CD31, marcador epitelial: aquaporin (AQP) 5 e surfactante proteína (SP) -B) usando microscópio confocal 22,37,40. </li><li> Compilar pilhas de secções ópticas (30 mm de espessura) para formar imagens tridimensionais de endotelial pulmão e células epiteliais utilizando imagem 3D software de análise de 37. </li><li> Quantificar áreas projectadas dos vasos sanguíneos recém-formados usando software de análise de imagem 46. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Este artigo apresenta um novo método para implantar biomateriais na superfície do pulmão de vida do rato adulto. Com este sistema, a angiogénese derivados de pulmão hospedeiro com sucesso, se condensa no interior do material. Este sistema permite que os investigadores para explorar a interferência entre as células endoteliais, outras células (por exemplo, células epiteliais, células mesenquimais, células imunes), e vários componentes da matriz extracelular que são necessárias para a angiogénese local, 50-53 e regeneração alveolar 24,54. Embora o implante in vivo de hidrogel subcutânea convencional tem sido usado extensivamente para a pesquisa da angiogênese 37-39, esses métodos não recapitular angiogénese específica de órgão. Este sistema, no qual hidrogel é implantado diretamente na superfície do pulmão, vai permitir aos investigadores para explorar o papel do microambiente específico do pulmão em angiogênese e regeneração alveolar no pulmão do rato adulto. Estes géis podem ser fabricados a partir de vários BIOMATE rico em ECMriais (por exemplo, colágenos, fibrinas) que podem ser complementados com vários fatores químicos (por exemplo, fatores angiogênicos, fatores de crescimento) 55,56, as células progenitoras e / ou células iPS. Além de fatores químicos, forças mecânicas também controlar a angiogênese 23,37. A rigidez das mudanças de gel de fibrina em um dependente da concentração de fibrinogênio forma 57 e manipular a concentração de fibrinogênio pode afetar a angiogênese, não só através de sinais químicos, mas também através de pistas físicas 58,59. Portanto, as propriedades físico-químicas dos geles de fibrina pode ser necessário optimizar com cuidado para recapitular a angiogénese específica do órgão fisiológico no futuro. A cicatrização de feridas após raspagem da pleura visceral e também produz um coágulo de fibrina endógena, que inclui vários tipos de células hospedeiras e promove o processo de cicatrização e regeneração do tecido. Este coágulo natural pode interagir com o gel de fibrina exogenamente implantado, e, portanto, controlar angiogênese no gel implantado. Fluorescente fibrinogênio marcado pode permitir aos pesquisadores distinguir entre coágulo de fibrina natural e gel de fibrina implantado e explorar esses mecanismos. Embora este seja um método poderoso para caracterizar a angiogénese em pulmões de ratinho adulto, aplicação para o estudo do desenvolvimento do pulmão e doenças em ratinhos neonatais provavelmente apresentam desafios técnicos. O objetivo final deste estudo é recrutar vasos sanguíneos funcionais em gel de fibrina implantados em pulmões doentes e de usar a matriz como um dispositivo médico para restaurar as estruturas pulmonares funcionais. Possíveis comunicações entre as células hospedeiras e o vascular e estruturas alveolares no interior dos géis, bem como a funcionalidade destas estruturas deve ser explorado em experiências futuras. Desde os níveis de VEGF nos pulmões estão diminuídos em pacientes com DBP 60 e enfisema 61, acrescentando VEGF para a matriz pode melhorar o recrutamento de vasos sanguíneos nos impl matrizanted nesses pulmões doentes. As propriedades mecânicas também diferem entre os pulmões saudáveis ​​e doentes 23,62. Por exemplo, a expressão de metaloproteinases de matriz e lisil-oxidase, que controlam a degradação e reticulação do colagénio, respectivamente, são alteradas em várias doenças pulmonares, incluindo a DPOC e fibrose pulmonar 63-67. Em pulmões doentes, certas linhagens de células progenitoras endoteliais para pulmão e células epiteliais estão esgotados 68. Assim, a manipulação destes factores (factores angiogénicos, ECMs, rigidez ECM) ou implantando geles de fibrina suplementadas com células progenitoras 69 irá provavelmente conduzir à formação de vasos sanguíneos funcionais dentro da matriz e a recuperação da função pulmonar em várias condições patológicas. Desde factores químicos pode ser completada dentro dos geles de fibrina para modular a angiogénese local, o sistema também pode ser utilizado explorar sinais ambientais específicos que podem normalizar pulmões doentes em doenças pulmonares crónicas. </p&gt; Em resumo, este artigo introduz um método para implante de hidrogel de fibrina sobre a superfície do pulmão de rato vivo, o que permite aos investigadores para caracterizar a angiogénese específica do pulmão in vivo. Modificação de vários factores (por exemplo, campo de tempo, as concentrações e combinações de factores angiogénicos, vários tipos de hidrogéis, propriedades físico-químicas dos hidrogéis) neste sistema, irá revelar os mecanismos de regeneração e a angiogénese no pulmão. Assim, este sistema vai avançar significativamente os conhecimentos científicos da biologia vascular básica, engenharia de tecidos, assim como a medicina pulmonar.

O objetivo geral deste protocolo é a introdução de um método para implantar gel de fibrina na superfície do pulmão de rato adulto, o que permite aos pesquisadores para caracterizar os mecanismos moleculares da vascular pulmonar e desenvolvimento alveolar, e para aproveitar esse conhecimento, a fim de desenvolver materiais biomiméticos capaz de recapitular vascular pulmonar fisiológico e formação alveolar para o tratamento de várias doenças pulmonares. Mais de 35 milhões de americanos sofrem de doenças pulmonares crônicas, incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica e fibrose pulmonar. Esses pacientes têm sintomas crônicos de longa duração respiratórios, como falta de ar, aperto no peito, tosse persistente e cansaço, que prejudiquem significativamente a sua vida diária 1-3. Apesar de uma grande quantidade de esforço para desenvolver terapias eficazes para essas doenças pulmonares, atualmente não há cura; portanto, a qualidade de vida para estes pacientes é pobre e econômica e os custos humanos são oigh 4-7. Atualmente, o transplante de pulmão é a única maneira de salvar os pacientes em fase terminal de doenças pulmonares crônicas. No entanto, por causa da escassez de doadores de transplante, de alto custo, complicações graves, e baixa taxa de sobrevivência 11/08, o transplante não é uma abordagem ideal. Rápido progresso recente em técnicas de engenharia de tecidos tem possibilitado aos pesquisadores modificar geneticamente pulmão implantável por repovoamento todo descelulada pulmão com vários tipos de células progenitoras ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células 12,13. No entanto, esses pulmões bioengenharia são funcionais apenas em animais hospedeiros, por várias horas após a implantação 12,14,15. Utilizando biomateriais para regenerar as estruturas complexas e funções dos pulmões também tem sido bastante bem sucedida. Isso pode ser porque os processos biológicos fundamentais que regem a regeneração do pulmão adulto não têm sido bem explorado. No pulmão, a formação do sistema vascular é um dos acontecimentos mais precoces e mais importantes during desenvolvimento e regeneração 16-21. Vasculaturas recém-formados no pulmão não só fornecer oxigénio, nutrientes e os vários componentes celulares necessários para a formação de órgãos, mas também fornecem sinais reguladores instrutivos para células vizinhas 22-25. Assim, a angiogênese desempenha papel-chave na alveolarização regenerativo no pulmão adulto 24,26,27. Além disso, contribui para a angiogênese desregulamentado doenças pulmonares crônicas, como doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) 28, displasia broncopulmonar (DBP) 21-23, e fibrose pulmonar 29. Assim, o desenvolvimento de estratégias mais eficientes para a engenharia pulmões ou o tratamento de doenças pulmonares crônicas, é necessário entender os mecanismos fundamentais da angiogênese específico do pulmão. Cada órgão apresenta propriedades mecânicas e químicas únicas, que podem diferir entre as condições fisiológicas e patológicas 30-33. Estes microenviron órgão-específicamentos regular comportamentos de células endoteliais e orquestrar a formação da rede vascular de forma específica do órgão 24,34-36. Assim, o desenvolvimento de estratégias mais eficazes para a regeneração do pulmão, o mecanismo subjacente a angiogênese específico do pulmão precisa ser entendido. Embora os ensaios de angiogénese in vivo convencionais, tais como implantação subcutânea de hidrogel têm sido amplamente utilizados para pesquisa da angiogênese 37-39, esses métodos não recapitular angiogénese específica de órgão. Recentemente, um novo método para implante de Matrigel em um molde elástico no pulmão do rato tem sido desenvolvido e mostrado para recrutar com sucesso os vasos sanguíneos e células epiteliais do pulmão em 22 géis. Esta abordagem única permitirá que os investigadores para explorar o mecanismo de angiogênese específico do pulmão, bem como as interações entre os vasos sanguíneos e células pulmonares não-vasculares em condições fisiológicas e patológicas. Desde 1) Matrigel não é adequado para a aplicação clínica; 2) o emolde lastic usado para lançar o gel pode afetar interações entre hidrogéis e tecido pulmonar de acolhimento e 3) o molde elástico no pulmão potencialmente causa comprometimento da função pulmonar e dor durante a respiração, como uma abordagem mais clinicamente relevante, uma matriz de fibrina 3D contendo fatores angiogênicos (factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) / factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF)) foi implantado no pulmão do rato sem vazamento no molde elástico, e tem sucesso recapitulado hospedeiro angiogénese derivados de pulmão. Gel de fibrina, fibrilas de polímero gerados a partir de fibrinogénio clivada pela trombina, a armadilha é conhecida uma variedade de factores angiogénicos, tais como bFGF e VEGF para acelerar a angiogénese in vivo 40,41. Devido à sua capacidade regenerativa e natureza biodegradável 42, gel de fibrina é amplamente utilizada no campo da engenharia de tecidos. Este artigo apresenta uma abordagem inovadora e única para implantar gel de fibrina na superfície do pulmão de Adul vivot mouse e demonstra que o anfitrião angiogênese derivado do pulmão é recapitulada no interior dos géis in vivo. Este método, o qual permite aos investigadores a estudar angiogénese específica do pulmão, provavelmente irá levar ao desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para vários tipos de doenças pulmonares e avançar significativamente os esforços para regenerar com sucesso adulto pulmão.

<table><tbody><tr><td>Fibrinogen from human placenta</td><td>Sigma</td><td>F4883</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>T9549</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse VEGF 164</td><td>R&amp;amp;D</td><td>493-MV</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse bFGF</td><td>R&amp;amp;D</td><td>3139-FB</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Rodent Intubation Stand</td><td>Braintree Scientific INC</td><td>RIS 100</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>Fiber-Optic Light Source</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-35</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>21 G Elastic catheter</td><td>B.Braun</td><td>4251652-02</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>MiniVent Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>CGS-8009</td><td>For ventilation</td></tr><tr><td>Stemi DV4 Steromicroscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-070-515</td><td>For surgey</td></tr><tr><td>Absobable suture</td><td>Ethicon</td><td>PDP304</td><td>Surgical suture</td></tr><tr><td>Antibody against CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against AQP5</td><td>Abcam</td><td>AB78486</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against SP-B</td><td>Abcam</td><td>AB40876</td><td>Immunohistochemistry</td></tr></tbody></table>

implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis

Os recentes avanços significativos nas técnicas de pesquisa com células-tronco e bioengenharia têm feito grandes progressos na utilização de biomateriais para regenerar e reparar danos em tecidos simples nas áreas de ortopedia e periodontais. No entanto, as tentativas para regenerar as estruturas e as funções dos órgãos (3D) mais complexas tridimensionais, tais como os pulmões não têm sido muito bem sucedida, porque os processos biológicos de regeneração de órgãos não foram bem exploradas. Torna-se claro que a angiogênese, a formação de novos vasos sanguíneos, desempenha papel fundamental na regeneração de órgãos. Recentemente formado vasculaturas não só fornecer oxigénio, nutrientes e os vários componentes celulares que são necessários para a regeneração de órgãos, mas também fornecem sinais instrutivos para os tecidos em regeneração locais. Portanto, para regenerar com sucesso em pulmões de um adulto, que é necessário para recapitular os microambientes específicos do pulmão em que a angiogénese unidades de regeneração dos tecidos pulmonares locais. Embora conventional ensaios in vivo da angiogénese, tais como a implantação subcutânea de matriz extracelular (ECM) rico em hidrogéis (por exemplo, colagénio ou fibrina géis ou Matrigel - mistura de proteínas de ECM segregado por células de sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm rato), são amplamente utilizados para explorar a mecanismos gerais de angiogénese, a angiogénese específica do pulmão não tem sido bem caracterizada porque os métodos para o implante ortotópico de biomateriais no pulmão não foram bem estabelecidos. O objetivo deste protocolo é a introdução de um método único para implantar gel de fibrina na superfície do pulmão de vida do rato adulto, permitindo a recapitulação bem sucedida de acolhimento angiogênese derivado do pulmão dentro do gel. Esta abordagem permite aos investigadores para explorar os mecanismos pelos quais o microambiente-pulmão específico controla a angiogénese e regeneração alveolar em condições normais e patológicas. Desde o lançamento biomateriais implantados e fornecer sinais físicos e químicos para adjacente ltecidos ung, implantação destes biomateriais no pulmão doente pode potencialmente normalizar os tecidos doentes adjacentes, permitindo que pesquisadores a desenvolver novas abordagens terapêuticas para vários tipos de doenças pulmonares.

Para examinar se a formação vascular pulmonar derivados do hospedeiro, se condensa no interior dos biomateriais implantados no pulmão, geles de fibrina suplementado com grandes factores angiogénicos de VEGF e bFGF (0, 10 e 100 ng / ml cada) foram implantados na superfície das que vivem nos pulmões de ratinho quanto relataram o uso de Matrigel 22. 47 geles de fibrina que contêm estes factores de crescimento angiogénicos foram fabricados como se mostra na Figura 1a. Após toracotomia, uma pequena área da superfície do pulmão esquerdo foi raspado utilizando uma pinça e o gel de fibrina fabricado foi implantado no pulmão de rato adulto utilizando a uma pequena quantidade de cola de fibrina, o qual é aprovado pela FDA e amplamente utilizada como selante eficaz para parar vazamentos de ar e reduz o sangramento em cirurgia de pulmão 48,49 (Figura 1b). A maioria dos ratos recuperaram sem sintomas respiratórios graves (por exemplo, pneumotórax, dificuldades respiratórias). Sete dias após a implantação, os ratos foram sacrificados e os pulmões foram harvested. Gel de fibrina implantado foi incorporada no pulmão hospedeiro 7 dias após a implantação (Figura 1c). Reconstrução 3D de imagens de fluorescência confocal revelou que as células endoteliais CD31-positivo derivados do hospedeiro formadas redes vasculares no interior dos géis de 7 dias após o implante de uma forma dependente da dose de VEGF / bFGF (Figura 2a, c). Tipo II I (SP-B positivo) as células epiteliais pulmonares (AQP5 positivo) e de tipo também foram recrutados ao longo dos vasos sanguíneos recentemente formados no interior dos géis que foram suplementados com concentrações mais elevadas de VEGF e bFGF (cada 100 ng / ml) (Figura 2a) . Coloração de H &amp; E de secções histológicas revelaram que outros tipos de células hospedeiras também migraram para o gel de 7 dias após a implantação (Figura 2b). Estes resultados sugerem que as redes vasculares regenerativos derivado de pulmão hospedeiras são construídos com sucesso dentro dos geles de fibrina que são suplementados com factores angiogénicos e implantados na superfície de mou adultose pulmão. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52012/52012fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1:. (A) O gel de fibrina preparado antes da implantação (b) fibrina gel implantado sobre a pleura visceral raspadas do pulmão esquerdo (setas) (c) Implantado gel de fibrina (pontas de seta) incorporada no pulmão hospedeiro 7 dias após a implantação.. Barras de escala de 1 mm. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52012/52012fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2: (a) micrografias de fluorescência mostrando a formação de redes vasculares (CD31 positivo; verde) e recrutados tipo I (AQP5-positivo; magenta) ou tipo II (SP-B positivo; magenta) células epiteliais do pulmão no interior do gel de fibrina suplementado com várias concentrações de VEGF e bFGF (0, 10 e 100 ng / ml de cada) 7 dias após a implantação. As linhas tracejadas indicam a interface entre o gel de fibrina e do pulmão implantado hospedeiro. Barra de escala:. 20 um (b) Micrografia luz de coloração de H &amp; E mostra a infiltração de células hospedeiras em gel de fibrina a 7 dias após a implantação. As setas indicam a interface entre o gel e pulmonar do hospedeiro. Barra de escala: 20 mm (c) Gráfico mostrando áreas projectadas dos vasos sanguíneos recentemente formados nos geles de fibrina que são suplementados com várias concentrações de VEGF e bFGF (0, 10 e 100 ng / ml de cada) 7 dias após a implantação..

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Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

Implantação de fibrina Gel no tapete do pulmão para o Estudo de angiogênese Lung-specific

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

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10.0K visualizações.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School. Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse. 

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Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Células Tumorais

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Medicina

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

Células-tronco de programação para Therapeutic angiogênese Usando nanopartículas poliméricas biodegradáveis

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Bioengenharia

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

Angiogênese no pulmão de rato Isquêmica

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

Uma janela permanente para investigar metástase do câncer no pulmão

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

Pesquisa do câncer

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

Implantação de Veia Cava Inferior interposição de enxerto no Rato Modelo

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which causes significant deterioration in lung function and subsequent death from respiratory failure.
The pathogenesis of IPF in experimental animal models has been induced by bleomycin administration. In this study, we investigate an IPF-like mouse model induced by a double intratracheal bleomycin instillation. Standard histological assessments used for studying lung fibrosis are invasive terminal procedures. The goal of this work is to monitor lung fibrosis through noninvasive imaging techniques such as Fluorescent Molecular Tomography (FMT) and Micro-CT. These two technologies validated with histology findings could represent a revolutionary functional approach for real time non-invasive monitoring of IPF disease severity and progression. The fusion of different approaches represents a step further for understanding the IPF disease, where the molecular events occurring in a pathological condition can be observed with FMT and the subsequent anatomical changes can be monitored by Micro-CT.

We describe a non-invasive multimodal imaging approach based on Micro-CT and fluorescence molecular tomography for longitudinal assessment of the mouse lung fibrosis model induced by double intratracheal instillation of bleomycin.

Um Multimodal abordagem de imagem baseado em Micro-CT e fluorescência Molecular tomografia para avaliação Longitudinal de fibrose pulmonar induzida por bleomicina em ratos

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Imunologia e Infecção

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

Indução de lesão de pulmão de camundongo por injeção endotraqueal de bleomicina

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of thoracic malignancies, additional animal models that can recapitulate diverse human lung cancer subtypes and stages are needed. Allograft or xenograft models are versatile and enable the quantification of tumorigenic capacity in vivo, using malignant cells of either murine or human origin. However, previously described methods of lung cancer cell engraftment have been performed in non-physiological sites, such as the flank of mice, due to the inefficiency of orthotopic transplantation of cells into the lungs. In this study, we describe a method to enhance orthotopic lung cancer cell engraftment by pre-conditioning the airways of mice with the fibrosis inducing agent bleomycin. As a proof-of-concept experiment, we applied this approach to engraft tumor cells of the lung adenocarcinoma subtype, obtained from either mouse or human sources, into various strains of mice. We demonstrate that injuring the airways with bleomycin prior to tumor cell injection increases the engraftment of tumor cells from 0-17% to 71-100%. Significantly, this method enhanced lung tumor incidence and subsequent outgrowth using different models and mouse strains. In addition, engrafted lung cancer cells disseminate from the lungs into relevant distant organs. Thus, we provide a protocol that can be used to establish and maintain new orthotopic models of lung cancer with limiting amounts of cells or biospecimen and to quantitatively assess the tumorigenic capacity of lung cancer cells in physiologically relevant settings.

We describe a method to significantly enhance orthotopic engraftment of lung cancer cells into the murine lungs by pre-conditioning the airways with injury. This approach may also be applied to study stromal interactions within the lung microenvironment, metastatic dissemination, lung cancer co-morbidities, and to more efficiently generate patient derived xenografts.

Pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina aumenta a eficiência da enxertia de célula de câncer pulmão ortotópico

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of ...

Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced pulmonary fibrosis.&#160; However, distribution of intratracheally-administered agents to the distal mouse lung is often asymmetric, with lung parenchymal concentrations increased in the smaller (but equally accessible) left lung of the mouse.&#160; Described in this report is a novel intrabronchial (IB) approach to cannulate the left and/or right lungs of living mice non-operatively.&#160; It is also demonstrated how this approach can be used to selectively administer agents to one lung or adapted (via dose-adjusted IB delivery) to improve the left-right symmetry of lung delivery of experimental agents, thereby improving models of diffuse lung disease such as bleomycin-induced pulmonary fibrosis.

Intratracheal (IT) administration of experimental agents in mice often results in asymmetric delivery to the distal lungs.&#160; In this report, we describe a direct intrabronchial (IB) approach to cannulate each lung in living mice non-operatively.&#160; This approach can be used to selectively administer agents to one lung or may be adapted to improve the symmetric agent delivery to both lungs.

Administração Intrabronquial direta para melhorar a deposição do agente seletivo dentro do pulmão do rato

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced ...

Transplantation of Bioengineered Lung Using Decellularized Mouse Lungs and Primary Human Endothelial Cells

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor shortages and posttransplant complications persist. Bioengineered lungs, integrating patient-specific cells into decellularized animal scaffolds, present a promising alternative. Despite progress in using bioengineered lungs in animal models, functionality and structure remain immature. This protocol addresses a critical barrier in organ bioengineering: the need for a cost-effective experimental platform. By using mouse models instead of larger animals like rats or swine, researchers can significantly reduce the resources required for each experiment, accelerating research progress. 
The protocol outlines a detailed procedure for lung bioengineering using mouse heart-lung blocks and human primary cells, focusing on isolation strategy for the mouse heart-lung block, decellularization, bioreactor setup, perfusion-based organ culture, and orthotopic transplantation of bioengineered lungs. This mouse-scale platform not only reduces experimental costs but also provides a viable framework for optimizing cell types and numbers for recellularization, testing different cell types using histological and molecular methods, and ensuring blood flow post-transplantation. The method holds potential for broad applications, including studying cell interactions in three-dimensional culture conditions, cell-matrix interactions, and ex vivo cancer modeling, thereby advancing the field of organ bioengineering.

This paper describes how to create bioengineered mouse lungs using decellularization and recellularization methods. It also details subsequent orthotopic lung transplantation.

Transplante de Pulmão de Bioengenharia Usando Pulmões de Camundongos Descelularizados e Células Endoteliais Humanas Primárias

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor ...