Name: a hydrogel construct and fibrin-based glue approach to deliver therapeutics in a murine myocardial infarction model.
Uploaded: 2015-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Hydrogel Construct and Fibrin-based Glue Approach to Deliver Therapeutics in a Murine Myocardial Infarction Model. at JoVE.com

이 작품은 미국 육군 그랜트 (W81XWH-08-1-0701)과 칼레 재단 병원에서 원정대에 의해 투자되었다.

절차 IACUC 프로토콜 번호 13302와 완벽한 호환성에 동물 자원의 분할에 의해 승인되었습니다. 1. 장비 준비 <ol><li> 멸균을 위해 수술 전에 사용 된 모든 비 - 일회용 악기 압력솥. </li><li> 용도 사이 유리 비드와 함께 살균 세션에서 여러 번 사용기구를 멸균. </li></ol> 2. 하이드로 겔 준비 <ol><li> 해동 및 하이드로 겔 구조의 생성에 최소 24 시간 이전에 판 줄기 세포. </li><li> 이전에 출판 (8, 18)를 상세하게 설명되었다 조형 장치를 이용하여 수술 (또는 유사 기기)에 전날 패치를 준비한다. </li><li> 하이드로 겔을 만들려면, 먼저 원하는 패치의 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 모델을 생성 및 조형 형식 (STL)에 디자인을 수출하고 있습니다. </li><li> dissolvin에 의해 사전 겔 용액 만들기멸균 PBS 1X에 g의 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 메타 크릴 레이트 (PEGDMA)를 20 % w / V 수용액을 얻었다. 동시에, 광개시제 1- [4- (2- 히드 록시에 톡시) 페닐] -2- 히드 록시 -2- 메틸 -1- 프로판 -1- 온 DMSO에 용해. / 0.5 V % w 마지막에 PEGDMA 솔루션 광개시제를 추가합니다. 가교 바로 전에, 세포 밀도의 원하는 100 ㎖를 추가한다. 참고 : 세포 / ㎖ 추천 6 10 × -2.0 5 10 × 2.0 사이의 세포 밀도를. </li><li> SLA 플랫폼의 중심에 접시에 프리 겔 용액을 피펫 및 이전에 업로드 STL 포맷 디자인 SLA 소프트웨어를 실행. </li><li> 장치로부터 패치를 제거하고 둘 베코 변성 이글 배지 5 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 (DMEM), 100 U / ㎖ 페니실린 하이드로 O / N을 배양하고, 세포를 조절하는 100 mg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 있도록 패치 내의 환경. </li></ol> 3. 동물 준비 및 구강 intubati에 <ol><li> 자신의 케이지 동료와 함께 자신의 정리 습관과 상호 작용의 결정에 따라 동물, 건강에 있는지 확인하는 절차에 앞서 각 마우스를 평가합니다. 참고 : 여성 8-10주 오래 C57BL / 6J 마우스는이 절차에 사용 된, 그러나, 임의의 마우스 연령 또는 유형이 사용될 수있다. </li><li> 마취 챔버에 동물을 배치하고 1 L / 분 O 2 지원으로 5 % 이소 플루오 란에 노출. 발가락 핀치 반사에 의한 마취의 수준을 모니터링합니다. </li><li> 동물이 제대로 마취되면, 무게 삽관 스탠드에 배치합니다. </li><li> 동물의 흉강으로 광원을 직접 성대 후두 표면을 철회하고 노출 집게를 사용합니다. 조심스럽게 성대 사이에 20 G의 angiocath을 안내하고 원활 기관에 삽입합니다. 카테터는 작은 동물 인공 호흡기에 연결되면 흉강의 기계적인 움직임으로 적절한 삽입을 감지합니다. </li><li> 토륨 환기 설정을 조정합니다제조자의 지침에 기초하여 동물의 체중 E. </li><li> 삽관 후 저체온증을 방지하기 위해 가열 패드에 앙와위에서 동물을 배치합니다. 가열 패드가 40 ℃를 초과하지 않도록하십시오. 필요한 경우, 화상의 가능성을 최소화하기 위해 동물과 난로 사이의 배리어를 배치했다. </li><li> 제모 크림의 사용을 통해 수술 부위에서 머리를 제거합니다. 적절한 살균을 위해 betadine 75 % 에탄올 3 교번하여 수술 부위를 소독. 다만 수술 부위를 노출하고, 절차를 수행하는 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 배치 드레이프를 놓습니다. </li></ol> 4. 수술 <ol><li> 개흉술 따라서, 흉골의 길이를 실행 흉골의 좌측에 피부 절개를 약 1cm을, 동물의 왼쪽에 수행된다. </li><li> 두 단계로부터 기본 흉곽 근육 층을 분리 집게를 사용한다. 델라을 준수동물의 pectoralis 주요 근육을 나타냅니다 운 전압 라인. 기본 외부 경사 근육에서 분리 및 내측 철회, 약간이 근육을 들어 올립니다. 그 후, 동일한 방식으로 기본 흉곽로부터 외부 경사 근육을 확보하고, 제 3 및 제 4 리브 unobscured보기를 제공하는 측 방향으로 후퇴. </li><li> 세 번째와 네 번째 갈비뼈 사이의 개흉술을 수행합니다. 조심스럽게 네 번째 늑골을 들어 올려 세 번째와 네 번째 갈비뼈 사이의 흉강을 엽니 다 cauterizer를 사용합니다. 더 캐비티를 열고 심장을 노출 견인기를 놓습니다. </li><li> 마음의 얇은 심낭을 파열 집게를 사용합니다. </li><li> 8-0 모노 필라멘트 나일론 봉합사와 왼쪽 관상 동맥을 결찰. 직접 좌심방의 하단부 아래, 약 4mm 마음의 정점에서 봉합사를 놓습니다. 심실의 심근 및 창백 수 투어 후 좌심방의 크기가 증가하여 적절한 봉합 위치가 결정다시 묶여있다. </li></ol> 5. 패치 배치 및 접착제 <ol><li> 사용할 때까지 CO 2 조건을 37 ℃에서 패치를 유지하고 5 %. </li><li> 부드럽게 평면 종단 주걱을 사용하여 패치를 들어 올려 부드럽게 경색의 사이트에서, 마음의 표면에 놓습니다. 주 : 좌심실 빠지는 것을 방지하기 위해, 패치 가볍게 주걱 또는 집게의 쌍의 팁을 사용하여 접촉을 유지하여 제 위치에 유지 될 수있다. </li><li> 트롬빈에 피브리노겐의 1 비율 : 4를 혼합하여 접착제를 준비합니다. 이 제제의 시작 후 통상 1 분 이내에, 두껍게하기 시작까지 반복 피펫으로 용액을 섞는다. </li><li> 용액 점도가 원하는 레벨에 도달하면, 신속하게 패치 표면에 약 10 mL로 옮긴다. 참고 : 피브린 접착제의 응고 시간이 빠르다, 접착제의 효율적인 전송을위한 기회의 작은 창을 제공한다. </li></ol> 6. 봉합 <ol><l난&gt; 6-0 모노 필라멘트 나일론 봉합사를 사용하여 모든 폐쇄 봉합을 수행합니다. </li><li> 3-4 개별 중단 봉합 리브 층을 닫습니다. </li><li> 늑간 층의 완전 폐쇄하기 전에, 폐쇄가 완료된 후 흉강을 철수하고 적절한 흉부 내 압력을 다시 절개로 PE-10의 캐 뉼러를 삽입합니다. </li><li> 3-4 개별 중단 봉합과 가슴 근육을 닫습니다. </li><li> 연속 봉합선으로 피부 층을 인감. </li><li> 완전 폐쇄 후, 캐 뉼러의 단부에 1.0 mL의 주사기를 연결하고 흉강 대피 사용. </li><li> 봉합 사이트를 강화하기 위해 절개 사이트에 조직 접착제를 적용합니다. </li></ol> 7. 후 수술 적 치료 <ol><li> 쥐에게 프레 노르 핀 (0.05-1.0 ㎎ / ㎏) 및 피하 직전 부흥 관상 동맥 결찰 및 20 분 이상 다음과 같은 카프로 펜 (2.2 ㎎ / ㎏)의 주입을 준다. 두 약물 수술 후 6 ~ 8 시간을 관리합니다다음 통증과 고통을 제어하기까지 3 일 동안 하루에 두 번 제공합니다. </li><li> 지속적으로 처음 4 시간 다음 수술을 의식하고 매 시간마다 때까지 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 진통제의 두 번째 복용량을 관리하는 두 번째 검진에게 수술 (2-4 시간 이상)의 밤을 수행합니다. </li><li> 동물이 안정 나타날 때까지, 절차에 따라 두 번째 날 이후 매일 동물을 모니터링합니다. </li></ol> 심장 기능 및 조직학 8. 분석 <ol><li> MI는 다음의 손상 정도를 결정하는 절차에 따라, 마우스 사주에 echocardiographs 수행. </li><li> 흡입 마취의 유도를위한 마취 챔버 내에서 4-5%의 이소 플루 란과 쥐를 마취 및 유지 보수 마취 얼굴 마스크를 통해 다음 2 % 이소 플루 란. </li><li> 제모 크림 이미징 영역을 지우고 뛰는 심장의 2D M 모드 심 초음파 검사를 얻기 위해 작은 동물 초음파를 사용하여 기능 매개 변수 ASSO를 기록그것으로 ciated. </li><li> 그 다음 24 시간 동안 10 %의 포르말린 용액에 동물과 장소에서 하트를 수집 이산화탄소 챔버에서 쥐를 안락사. 24 시간 후, 70 % 에탄올에 마음을 전송하고 조직 처리 될 때까지 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 마음을 처리하고 파라핀 블록을 포함. </li><li> 정점에서 시작 아트리움에서 끝나는, 심장의 심실 영역을 통해 5mm 부분을 잘라. </li><li> 얼룩은 메이슨의 트리 크롬과 헤 마톡 실린 및 표준 프로토콜을 사용하여 에오신 염색 모두 조각을 절단. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

쥐의 심근 경색 모델에이 방법으로, 우리는 다른 쥐의 심근 경색 기술과 관련된 비 심근 지역에 피해를 최소화하는 시스템을 개발했다. 이 지역은 기관 절개술에 의한 손상, 근육 층의 절단 및 흉강을 노출 리브의 파손을 포함한다. 우리는 이러한 변화는 수술시로, 갈비뼈와 근육 층을 포함, 주요 구조물의 많은 손상을 유지하는 데 걸리는 치료에 전체 수술 결과 덕분에 개선 있다고 생각합니다. 이는 하루에 단지 8-10 전체 수술 절차의 결과로, 일부 제한되는 최대의 시간 소모 특성과,이 기술에 있다는 것을 주목해야한다. 이것을 극복하기 위해, 제 인공 호흡기 절차가 동시에 두 동물에서 수행 될 수 있도록하기 위해 사용될 수있다. 또한, 이러한 늑간 혈관 등 주요 혈관 및개흉술을 수행 할 때 내부 흉부 동맥은 피해야한다. 이들 용기 중 하나 근처에 있으면, cauterizer 인해 파열 동맥 출혈을 방지하기 위해 사용되어야한다. 피브린 접착제 신속 혈전 형성에 도움하는 능력뿐만 아니라 잠재적 전달하고 호스트 MSC들 14-17,19에 실험실과 임상 모두 덕분에 공지되어있다. 우리의 목적을 위해, 피브린 접착제는 수용성 하이드로 겔은 심장의 표면에 구성 준수에 대한 생체 적합성 접근을 역임. 섬유소 기반의 접착제의 사용은 시간의 긴 양의 조직 접촉의 가능성으로, 최대 8 주 동안 손상된 사이트에서 하이드로 겔 구조를 유지 성공적으로 입증되었습니다. 이 접착 성 시스템의 사용은 심근뿐만 아니라 구조 자체를 손상 부가 봉합없이 섬세한 구조의 배치에 대한 제어를 허용했다. 우리는 접착제 자체가 캡슐화 된 세포에 비 독성임을 발견차에 부정적인 기본 조직에 영향을주지 않습니다. 하이드로 겔 및 피브린 접착제 기반 시스템은 오랜 시간 동안 세포 또는 치료를 원하는 접촉 다른 조직 공학 다양한 목적에 적용 할 수있다. 또한, SLA 제조 방법의 사용으로, 설계 및 구조는 세포 전달 (18)보다 복잡한 시스템을 만드는 데 패치 내에서 통합 될 수있다. 피브린 계 접착제의 사용을 방해하는 한 개 이상의 연구원 패치 배치 및 접착제 첨가 도중에 수술 실용에 존재해야한다는 사실이다. 그것은 제 연구원의 작업이 제 연구원 용액을 혼합하고 적절한 점도에 도달 한 후 패치에 적용하면서 패치가 제자리에 남아 흉강에서 분실하지 않도록하는 것이다. 접착제 공급의 타이밍을 최적화하기 위해서는, 제 연구원도 패치 배치하기 전에 접착제의 겔화 시간과 테스트 것을 제안접착제의 적절한 겔화 이후 패치 접착 중요합니다. 먼저 심근 경색의 유도되고있는 프로토콜 내의 중요한 단계 및 에러가 발생하기 쉬운 영역의 개수가있다. 이 좌측 관상 동맥의 폐색을 보장하기 위해, 예컨대 좌심실 벽의 창백 및 좌심방의 확대 등의 징후를 확인하는 것이 필수적이다. 이것은 단순히 교차하고 봉합 문자열 단부를 조여 스티치의 첨가에 앞서 수행 될 수있다. 이 좌측 관상 동맥을 봉합에 의해 묶여 있지 않은 것으로 판정 된 경우, 문자열을 취출 할 수 있으며 재 도포. 초 임계 측정은 기관 내에 남아 미드 수술 인출되지 않도록하기 위해, 절차 내내 삽관 튜브를 계속 감시 할 것이다. 마지막으로, 수술 내내 모든 접촉 시도는 폐 붕괴로 이어질 가능성이 있기 때문에, 폐와의 접촉을 피하도록해야한다., 수술 중, 폐 collapsing으로 발생 간단히하기위한 시도로 최대 3 초간 intubator의 유출 관을 차단하면 폐 고생 영역을 다시 팽창.

심근 경색 (MI)는 주요 관상 동맥의 폐색으로 인한 심장의 영역에 혈액 차단으로 정의된다. MI 인한 손상으로 인해, 또는보다 구체적으로, 좌심실은 제대로 치는 심장의 기능을 감소 비 기능적 흉터 조직으로 생존 가능한 심장 조직의 리모델링이다. 이것은 행정 용적으로 알려진 모든 심장 박동, 및 박출계수 6라고도 각 심장 박동 심장 밖으로 펌핑되어 혈액의 백분율로 본체에 전달 될 ​​수있는 혈액의 체적 감소를 초래. 이들은, 다른 기능 감소와 함께, 적절한 기능을 유지하기 위해 심장의 나머지 부분에 변형을 증가시킨다. 이 두 번째 심장 마비에서 개인 (7)의 약 10 % 본 현상을 일으키는 종종이 증가 된 균주는 매우 심각한 될 수 있습니다. 의료 행위는 치료를 위해 진화하는 동안MI의 직후, 아니 기술은 저속, 정지, 또는 조직 리모델링의 부작용을 반전하기 위해 개발 없습니다. 줄기 세포 치료가 유망한 잠재력에도 불구하고, 이러한 치료 가능한 수단으로 부상 한 줄기 세포는 임상에서 성공적으로 검증되지 않았다. 그들의 결점 일설 유익한 세포 유리한 결과를 생성하는 5 충분히 경색 부위에서 유지되도록 할 수 없다는 것이다. 그것은 단순히 경색 부위에 주입 세포의 더 이상의 24 %가 생존하지 않고 손상된 사이트 1 일 인도 후 2에 남아 있음을 보였다. 세포의 보존이 문제를 해결하기위한 가능한 전망은 손상된 세포 또는 사이트로 전달 될 수있는 치료제, 하나를 캡슐화하는 생체 적합성 히드로 겔 시스템을 개발하는 것이다. 이 프로토콜의 선택의 하이드로 겔 인해 전지 밀봉 PR에 이전에 사용 된 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 메타 크릴 레이트 인ocedures 그러나 캡슐화 할 수있는 임의의 하이드로 겔 8을 사용할 수있다. 직접 부상에 패치의 전달은 세포가 심근 근본적인 요인에 유익을 제공 할 수있는 시간의 길이를 증가, 장기간에 걸쳐 세포 간 조직의 접촉을 보장한다. 패치 접근법 병목 심장 표면에 패치를 부착하는 어려움이다. 많은 그룹은 기술, 심장 표면 9,10에 구조를 묶는 간단한 봉합되는 가장 널리 다양한 통해이를 극복했다. 이 구조는 강성 재료로 제조되는 경우의 수가 성공적으로 입증하지만 인해 높은 물 농도 패치 구조의 섬세한 특성상 하이드로 시스템에서 시도 할 때 실패했다. 이것을 극복하기 위해, 우리는 혈전 형성의 화학을 모방 피브린 접착제 외부 접착 시스템을 이용했다. 섬유소 접착제는 INC, 수많은 의료 수술에 사용되어왔다상처 밀봉 11-13로 제품의 생체 적합성을 강조, 경질 눈물, 기관지 누공, 각막 이식을 luding. 또한 섬유소하지만, 심장 패치 부착 접착제로서의 사용은 일반적으로 14 ~ 17 사용하지 좌심실 파열 및 관상 동맥 우회 수술 수술을 포함한 심장 다양한 목적을 위해 사용되어왔다. 심장 작용에 패치를 보장하기 위해 가능한 부착 시스템을 제공하는 단계, 외부 심장 패치의 외부에 직접 배치 될 수있는 생체 적합성 접착제 피브리노겐과 트롬빈 결과의 간단한 제제.

<table><tbody><tr><td>Harvard Model 687 Mouse Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-0001</td><td></td></tr><tr><td>Inintech Biosciences LLC Dry Glass Bead Sterilizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9531961</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ6 surgical microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cautery Kit</td><td>Gemini</td><td>GEM 5917</td><td></td></tr><tr><td>Delicate Forceps - 0.4 mm Tips Angled</td><td>Fine Science Tools</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>Agricola Retractor - 3.5 cm Spread</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors - 2.5 mm Blades Straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Needle Holder - w/Lock Tungsten Carbide 14 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors - Delicate Straight 10.5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>8-0 monofilament suture</td><td>Ethicon</td><td>8730P</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Silk suture</td><td>Ethicon</td><td>639G</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T7009</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond Tissue Adhesive</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr></tbody></table>

a hydrogel construct and fibrin-based glue approach to deliver therapeutics in a murine myocardial infarction model.

The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of treatments in vivo1. The traditional, established protocol has been further fine-tuned to minimize the damage to the animal. Notably, the pectoral muscle layers are teased away rather than simply cut, and the thoracotomy is approached intercostally as opposed to breaking the ribs in a sternotomy, preserving the integrity of the ribcage. With these changes, the overall stress on the animal is decreased. 
Stem cell therapies aimed to alleviate the damage caused by MIs have shown promise over the years for their pro-angiogenic and anti-apoptotic benefits. Current approaches of delivering cells to the heart surface typically involve the injection of the cells either near the damaged site, within a coronary artery, or into the peripheral blood stream2-4. While the cells have proven to home to the damaged myocardium, functionality is limited by their poor engraftment at the site of injury, resulting in diffusion into the blood stream5. This manuscript highlights a procedure that overcomes this obstacle with the use of a cell-encapsulated hydrogel patch. The patch is fabricated prior to the surgical procedure and is placed on the injured myocardium immediately following the occlusion of the left coronary artery. To adhere the patch in place, biocompatible external fibrin glue is placed directly on top of the patch, allowing for it to dry to both the patch and the heart surface. This approach provides a novel adhesion method for the application of a delicate cell-encapsulating therapeutic construct.

수술하는 동안, 좌측 관상 동맥의 결찰이 폐색 된 동맥의 하류 희게 표시된 의해 식별 될 수있다. 매듭을 묶는 전에 테스트로, 봉합사는 적절한 위치에 있는지 확인하기 위해 잠시 동안 강화 될 수있다. 또한, 적절히 이길 좌심방의 능력에 거의 순간적인 감소 동맥 폐색의 결과 때문에, 좌심방이 시스템 내의 혈액의 역류에 응답하여 확대된다. M 모드 심 초음파 측정 후 경색이 근육의 재건을 나타내는 왼쪽 벽 운동의 중단을 보여 빠르면 2와 일 촬영. 데이터로 만든 성적 계산은 경색 마음 구혈률의 감소와 뇌졸중 볼륨을 보여줍니다. 하트가 조직학을 위해 수집 된 실험의 종료시, 좌심실 명확한 팽창은 좌심실의 박형화와 함께 볼 수있다벽 및 심근 세포를 (도 1)를 작동하는 대신에 반흔 조직의 침착을 나타내며 콜라겐 침착. 또한, (도 2) 조직 학적 분석에 하이드로 겔의 존재는 피브린 겔 투여 덕분 구성이다 알. 우리의 목적을 위해, 접착제 시스템은 심장 기능을 방해 정밀한 위치 제어를 허용하고 후속으로 주변 장기 유출을 최소화하기 위해 충분한 점성 있지만 충분하지 연성이어야한다. 예비 시험은 우리의 요구에 맞는 적절한 조합을 결정하기 위해, 점도, 겔화 시간 및 각종 피브리노겐 / 트롬빈 비의 강성을 계산하도록 실시 하였다. 생체 내 분석은 패치 - 유지를 피브린 접착제의 능력을 시험하기 위해 수행 하였다 투 조직 유착 여전히 전체 심장 기능을 허용하면서 (데이터는 보이지 않음). 이는 L에 의해 입증 피브린 접착제, 심근을 끼치 지 않았 음을 주목해야한다사이트에 조직 리모델링 또는 심실 얇아 ACK (그림 2). 심근은 심장 패치와 함께 제공되는 접착제 양의 추가에도 불구하고 그대로 유지됩니다. 또한, 생존 시험 셀이 봉입 하이드로 겔 패치의 외부 표면에 피브린 접착제의 투여 (도 3) 패치 내의 세포 생존에 영향을 미치지 않았 음을 확인했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52562/52562fig1.jpg" /> 그림 1 :. () 건강하고 경색 (b)는 마음의 심장 기능의 감소를 왼쪽 관상 동맥 결찰 결과는 심 초음파로 측정 한 M 모드 심 초음파. 경색 마음은 살아있는 조직이 흉터 조직으로 대체 된 벽 운동의 명확한 부족을 보여줍니다. 이 좌심실 구혈률에 측정 가능한 감소 (EF), 심장 스트로크와 상관 관계볼륨 (SV), 및 심 박출량 (CO). 건강 (c) 및 경색 (D) 마음의 조직 학적 분석은 좌심실과 심근 경색의 좌심실 벽의 숱이, 조직 리모델링과 반흔 조직 증착 모두 표시의 팽창을 보여줍니다. 조직 학적 이미지는 왼쪽 (대형 챔버)과 오른쪽 (작은 방) 심실을 캡처 단면 조각이다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52562/52562fig2.jpg" /> 그림 2 :. 심장에 섬유소 굴뚝 보장 패치 접착의 응용 프로그램 흉강이 절차를 수행하는 동안 노출되는 동안 패치가 마음의 표면에 위치 (A). 배치 후에 피브린 계 접착제는 심장의 상부에 첨가하여 건조시킨다. 패치는 명확 일주 시술 후 (b)에서 회수하고 심장 조직의 조직 학적 단면에서 볼 수있다.조직 학적 이미지에서 심장 표면에서 패치의 해리는 수집 및 단면 처리 과정의 유물이다. 결과는 접착 최대 8 주 일치한다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52562/52562fig3.jpg" /> 도 3 : 피브린 계 접착제는 캡슐화 된 조직을 손상시키지 않는다 세포 생존율이 이전 공보 8에 상세히 기술 프로토콜을 사용하여 피브린 계 접착제의 투여 후 일주 MTT 분석을 통해 측정 하였다.. 패치 내에서 세포의 생존 능력은 구조물의 표면에 접착제의 첨가에 의해 영향을받지 않았다.

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A Hydrogel Construct and Fibrin-based Glue Approach to Deliver Therapeutics in a Murine Myocardial Infarction Model.

This protocol aims to alleviate the limitation of poor cell engraftment for stem cell treatment of myocardial infarctions through the use of a hydrogel system and a fibrin-based glue. With this approach, cell-to-tissue contact post-infarction can be maintained, increasing the therapeutic potential of beneficial agents at the site of injury.

하이드로 겔은 구축 및 쥐 심근 경색 모델에서 치료를 제공하기 위해 접착제 접근을 섬유소 기반.

The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of ...

a-hydrogel-construct-fibrin-based-glue-approach-to-deliver

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

8.6K 조회수.  University of Illinois at Urbana-Champaign. This protocol aims to alleviate the limitation of poor cell engraftment for stem cell treatment of myocardial infarctions through the use of a hydrogel system and a fibrin-based glue. With this approach, cell-to-tissue contact post-infarction can be maintained, increasing the therapeutic potential of beneficial agents at the site of injury.

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Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

심근 조직 공학을위한 생물학 유래 주사용 재료의 제조

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

연구

생체공학

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering 

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying cellular responses under various culture conditions in vitro. The three dimensional environment more closely mimics what the cells observe in vivo due to the application of mechanical and chemical stimuli in all dimensions 1. Three-dimensional hydrogels can either be made from synthetic polymers such as PEG-DA 2 and PLGA 3 or a number of naturally occurring proteins such as collagen 4, hyaluronic acid 5 or fibrin 6,7. Hydrogels created from fibrin, a naturally occurring blood clotting protein, can polymerize to form a mesh that is part of the body's natural wound healing processes 8. Fibrin is cell-degradable and potentially autologous 9, making it an ideal temporary scaffold for tissue engineering.
Here we describe in detail the isolation of neonatal cardiomyocytes from three day old rat pups and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. Neonatal myocytes are a common cell source used for in vitro studies in cardiac tissue formation and engineering 4. Fibrin gel is created by mixing fibrinogen with the enzyme thrombin. Thrombin cleaves fibrinopeptides FpA and FpB from fibrinogen, revealing binding sites that interact with other monomers 10. These interactions cause the monomers to self-assemble into fibers that form the hydrogel mesh. Because the timing of this enzymatic reaction can be adjusted by altering the ratio of thrombin to fibrinogen, or the ratio of calcium to thrombin, one can injection mold constructs with a number of different geometries 11,12. Further we can generate alignment of the resulting tissue by how we constrain the gel during culture 13.
After culturing the engineered cardiac tissue constructs for two weeks under static conditions, the cardiac cells have begun to remodel the construct and can generate a contraction force under electrical pacing conditions 6. As part of this protocol, we also describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including functional analysis of the active force generated by the cardiac muscle construct upon electrical stimulation, as well as methods for determining final cell viability (Live-Dead assay) and immunohistological staining to examine the expression and morphology of typical proteins important for contraction (Myosin Heavy Chain or MHC) and cellular coupling (Connexin 43 or Cx43) between myocytes.

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

We describe the isolation of neonatal cardiomyocytes and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. We describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including active force generated upon electrical stimulation and cell viability and immunohistological staining.

심장 조직 공학을위한 섬유소 히드로겔에 Cardiomyocytes의 캡슐

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Cell-based Therapy for Heart Failure in Rat: Double Thoracotomy for Myocardial Infarction and Epicardial Implantation of Cells and Biomatrix

Cardiac cell therapy has gained increasing interest and implantation of biomaterials associated with cells has become a major issue to optimize myocardial cell delivery. Rodent model of myocardial infarction (MI) consisting of Left Anterior Descending Artery (LAD) ligation has commonly been performed via a thoracotomy; a second open-heart surgery via a sternotomy has traditionally been performed for epicardial application of the treatment. Since the description of LAD ligation model, post-surgery mortality rate has dropped from 35-13%, however the second surgery has remained critical. In order to improve post-surgery recovery and reduce pain and infection, minimally invasive surgical procedures are presented.&#160;Two thoracotomies were performed, the initial one for LAD ligation and the second one for treatment epicardial administration. Biografts consisting of cells associated with solid or gel type matrices were applied onto the infarcted area.&#160;LAD ligation resulted in loss of heart function as confirmed by echocardiography performed after 2 and 6 weeks. Goldner trichrome staining performed on heart sections confirmed transmural scar formation. First and second surgeries resulted in less that 10%&#160;post-operative mortality.&#160;

Implantation of a biograft to treat myocardial infarction induced by LAD ligation in a rodent model has conventionally required two open-heart surgeries. In order to reduce mortality and provide optimal conditions for fixation of solid and gelatinous biomatrices associated with cells, minimally invasive procedures have been developed.

쥐에서 심장 마비에 대한 세포 기반 치료 : 심근 경색에 대한 두 개흉술 및 세포 및 Biomatrix의 심 외막 이식

Cardiac cell therapy has gained increasing interest and implantation of biomaterials associated with cells has become a major issue to optimize myocardial ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. Several commercial extracellular matrix products are available as hydrogels or membranes, but these do not possess tissue-specific biological activity. Because perfusion decellularization is usually not possible with human heart tissue, we developed a 3-step immersion decellularization process. Human myocardial slices procured during surgery are first treated with detergent-free hyperosmolar lysis buffer, followed by incubation with the ionic detergent, sodium dodecyl sulfate, and the process is completed by exploiting the intrinsic DNase activity of fetal bovine serum. This technique results in cell-free sheets of cardiac extracellular matrix with largely preserved fibrous tissue architecture and biopolymer composition, which were shown to provide specific environmental cues to cardiac cell populations and pluripotent stem cells. Cardiac extracellular matrix sheets can then be further processed into a microparticle powder without further chemical modification, or, via short-term pepsin digestion, into a self-assembling cardiac extracellular matrix hydrogel with preserved bioactivity.

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

This protocol describes the complete decellularization of human myocardium while preserving its extracellular matrix components. Further processing of the extracellular matrix results in the production of microparticles and a cytoprotective self-assembling hydrogel.

기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

발생학

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the limited access to donor hearts. An example of a treatment to recover the function of the heart consists of the local delivery of drugs and bioactives from a hydrogel. In this paper a method is introduced to formulate and inject a drug-loaded hydrogel non-invasively and side-specific into the pig heart using a long, flexible catheter. The use of 3-D electromechanical mapping and injection via a catheter allows side-specific treatment of the myocardium. To provide a hydrogel compatible with this catheter, a supramolecular hydrogel is used because of the convenient switching from a gel to a solution state using environmental triggers. At basic pH this ureido-pyrimidinone modified poly(ethylene glycol) acts as a Newtonian fluid which can be easily injected, but at physiological pH the solution rapidly switches into a gel. These mild switching conditions allow for the incorporation of bioactive drugs and bioactive species, such as growth factors and exosomes as we present here in both in vitro and in vivo experiments. The in vitro experiments give an on forehand indication of the gel stability and drug release, which allows for tuning of the gel and release properties before the subsequent application in vivo. This combination allows for the optimal tuning of the gel to the used bioactive compounds and species, and the injection system.

Supramolecular hydrogelators based on ureido-pyrimidinones allow full control over the macroscopic gel properties and the sol&#8211;gel switching behavior using pH. Here, we present a protocol for formulating and injecting such a supramolecular hydrogelator via a catheter delivery system for local delivery directly in relevant areas in the pig heart.

돼지 심장에 현지 카테터 주입 용 주사 및 약물로드 초분자 히드로 겔

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes in myocardial ischemia and to develop and optimize future treatment.
Two different methods of creating myocardial ischemia are performed in laboratory rodents. The first method is to create cryo infarction, a fast but inaccurate technique, where a cryo-pen is applied on the surface of the heart (1-3). Using this method the scientist can not guarantee that the cryo-scar leads to ischemia, also a vast myocardial injury is created that shows pathophysiological side effects that are not related to myocardial infarction. The second method is the permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD). Here the LAD is ligated with one single stitch, forming an ischemia that can be seen almost immediately. By closing the LAD, no further blood flow is permitted in that area, while the surrounding myocardial tissue is nearly not affected. This surgical procedure imitates the pathobiological and pathophysiological aspects occurring in infarction-related myocardial ischemia.
The method introduced in this video demonstrates the surgical procedure of a mouse infarction model by ligating the LAD. This model is convenient for pathobiological and pathophysiological as well as immunobiological studies on cardiac infarction. The shown technique provides high accuracy and correlates well with histological sections.

This video demonstrates how to use a fast and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of myocardial ischemia.

내사 - 결합 : 심근 경색의 Murine 모델

Research models of infarction and myocardial ischemia are essential to investigate the acute and chronic pathobiological and pathophysiological processes ...

생물학

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and repair damage in simple tissues in the orthopedic and periodontal fields. However, attempts to regenerate the structures and functions of more complex three-dimensional (3D) organs such as lungs have not been very successful because the biological processes of organ regeneration have not been well explored. It is becoming clear that angiogenesis, the formation of new blood vessels, plays key roles in organ regeneration. Newly formed vasculatures not only deliver oxygen, nutrients and various cell components that are required for organ regeneration but also provide instructive signals to the regenerating local tissues. Therefore, to successfully regenerate lungs in an adult, it is necessary to recapitulate the lung-specific microenvironments in which angiogenesis drives regeneration of local lung tissues. Although conventional in vivo angiogenesis assays, such as subcutaneous implantation of extracellular matrix (ECM)-rich hydrogels (e.g., fibrin or collagen gels or Matrigel - ECM protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells), are extensively utilized to explore the general mechanisms of angiogenesis, lung-specific angiogenesis has not been well characterized because methods for orthotopic implantation of biomaterials in the lung have not been well established. The goal of this protocol is to introduce a unique method to implant fibrin gel on the lung surface of living adult mouse, allowing for the successful recapitulation of host lung-derived angiogenesis inside the gel. This approach enables researchers to explore the mechanisms by which the lung-specific microenvironment controls angiogenesis and alveolar regeneration in both normal and pathological conditions. Since implanted biomaterials release and supply physical and chemical signals to adjacent lung tissues, implantation of these biomaterials on diseased lung can potentially normalize the adjacent diseased tissues, enabling researchers to develop new therapeutic approaches for various types of lung diseases.

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

마우스 폐에 섬유소 젤의 주입은 폐 관련 신생 혈관 연구에

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

의학

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other biologicals that enhance angio- or vasculogenesis into the infarct border zone (IBZ), tissue perfusion is improved, and the myocardium can be protected from further damage. For maximum therapeutic effect, it is hypothesized that the regenerative substance is best delivered to the IBZ. This requires accurate injections and has led to the development of new injection techniques. To validate these new techniques, we have designed a validation protocol based on myocardial tissue analysis. This protocol includes whole-heart myocardial tissue processing that enables detailed two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) analysis of the cardiac anatomy and intramyocardial injections. In a pig, myocardial infarction was created by a 90-min occlusion of the left anterior descending coronary artery. Four weeks later, a mixture of a hydrogel with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) and fluorescent beads was injected in the IBZ using a minimally-invasive endocardial approach. 1 h after the injection procedure, the pig was euthanized, and the heart was excised and embedded in agarose (agar). After the solidification of the agar, magnetic resonance imaging (MRI), slicing of the heart, and fluorescence imaging were performed. After image post-processing, 3D analysis was performed to assess the IBZ targeting accuracy. This protocol provides a structured and reproducible method for the assessment of the targeting accuracy of intramyocardial injections into the IBZ. The protocol can be easily used when the processing of scar tissue and/or validation of the injection accuracy of the whole heart is desired.

This protocol describes a novel method for the 3D comparison of whole-heart myocardial tissue with MRI. This is designed for the accurate assessment of intramyocardial injections in the infarct border zone of a chronic porcine model of myocardial infarction.

3D 전체 심장 심근 조직 분석

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ligation is a challenging procedure and has a high mortality rate due to its nature. We developed a method to consistently transplant bioprinted patches of cells and hydrogels onto the epicardium of an infarcted mouse heart to test their regenerative properties in a robust and feasible way. First, a deeply anesthetized mouse is carefully intubated and ventilated. Following left lateral thoracotomy (surgical opening of the chest), the exposed LAD is permanently ligated and the bioprinted patch transplanted onto the epicardium. The mouse quickly recovers from the procedure after chest closure. The advantages of this robust and quick approach include a predicted 28-day mortality rate of up to 30% (lower than the 44% reported by other studies using a similar model of permanent LAD ligation in mice). Moreover, the approach described in this protocol is versatile and could be adapted to test bioprinted patches using different cell types or hydrogels where high numbers of animals are needed to optimally power studies. Overall, we present this as an advantageous approach which may change preclinical testing in future studies for the field of cardiac regeneration and tissue engineering.

This protocol aims to transplant a 3D bioprinted patch onto the epicardium of infarcted mice modeling heart failure. It includes details regarding anesthesia, the surgical chest opening, permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery and application of a bioprinted patch onto the infarcted area of the heart.

심근 경색의 뮤린 모델에서 3D 생체 인쇄 패치의 이식

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

3D Human Myocardial Tissue Generation Using Melt Electrospinning Writing of Polycaprolactone Scaffolds and hiPSC-Derived Cardiac Cells

The development of functional human cardiac tissues holds significant promise for advancing applications in drug screening, disease modeling, and regenerative medicine. This protocol describes the stepwise fabrication of 3D myocardial tissues with advanced mimicry of native cardiac structure by combining melt electrospinning writing (MEW) polycaprolactone (PCL) scaffolds with fibrin hydrogels and human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived cardiac cells. The process involves embedding a mixture of cardiomyocytes (hiPSC-CMs) and cardiac fibroblasts (hiPSC-CFs) within a fibrin matrix to create mini-tissues, with structural support provided by MEW-generated scaffolds. These fibrillar scaffolds are fabricated at the micro- to nanoscale, allowing for precise control over fiber architecture, which plays a key role in organizing cell distribution and alignment. Meanwhile, the fibrin matrix promotes cell viability and mimics the extracellular environment. Characterization of the generated tissues reveals well-organized sarcomeres within hiPSC-CMs, along with stable contractile activity. The tissues demonstrate consistent spontaneous beating as early as two days post-seeding, with sustained functionality over time. The combination of hiPSC-CFs with hiPSC-CMs enhances the structural integrity of the tissues while supporting long-term cell viability. This approach offers a reproducible, adaptable, and scalable method for creating biomimetic cardiac tissue models, providing a versatile platform for preclinical drug testing, mechanistic studies of cardiac disease, and potential regenerative therapies.

A reproducible method is presented to generate 3D myocardial tissues combining melt electrospinning writing (MEW) polycaprolactone (PCL) scaffolds and fibrin hydrogels with hiPSC-derived cardiomyocytes and fibroblasts. This technique offers precise control over scaffold architecture and can be applied in preclinical drug testing and cardiac disease modeling.