Name: studying dna looping by single-molecule fret
Uploaded: 2014-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET at JoVE.com

Agradecemos James Waters, Gable Wadsworth e Bo Broadwater pela leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também a quatro revisores anônimos por fornecer observações úteis. Reconhecemos o apoio financeiro do Georgia Institute of Technology, o Prémio Carreira Burroughs Wellcome Fund na Interface Científica, ea pesquisa estudante concessão de rede de NSF Physics dos sistemas vivos.

1. Preparação dsDNA Amostra <ol><li> Projete DNAs globalmente curvas repetindo uma seqüência de 10-mer. Por exemplo, 5&#39;-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 &#39;é um ADN curvo 186 pb, em que X é uma base aleatória adicional e a sequência que flanqueia a sequência de 10-mer de repetição são sequências de adaptador. NOTA:. Neste exemplo, dois 10-mers com preferências opostas à formação nucleosome com base em um estudo de larga escala ocupação nucleosome por Kaplan et al 15 foram escolhidos. Uma vez que a repetição helicoidal de ADNcd é perto de 10 pb, qualquer desvio líquido do eixo helicoidal do 10-mer se acumulam para produzir uma forma como um arco circular (Figura 3A). Uma vez que o período helicoidal está mais perto de 10,5 pb, uma base adicional é inserido depois de cada duas repetições para manter a estrutura curva planar como possível. Essas seqüências mais curtas do que 200 pb pode ser encomendado a partir companies que o serviço de síntese de genes oferta. É conveniente para flanquear essas seqüências com seqüências de adaptadores comuns para as etapas subseqüentes. O procedimento é esquematizado na Figura 3B. </li><li> Realizar PCR com iniciador de síntese 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) e iniciador 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). NOTA: Iniciador 2 é marcado com o Cy3 dador FRET na extremidade 5 &#39;. Uma receita típica de PCR e ciclismo protocolo, são apresentados nas Tabelas 1 e 2. </li><li> Realizar PCR com Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) e Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). NOTA: Iniciador 3 é marcado com o aceitador FRET Cy5 através da espinha dorsal e a biotina-ligante na extremidade 5 &#39;. Receita PCR e ciclismo protocolo são como acima. </li><li> Purifica-se os produtos de PCR utilizando um kit de limpeza de PCR. </li><li> Misture o produto Cy3 marcado e o produto marcado com Cy5 em um tampão para a troca de fio (100 mM de NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,0, EDTA 1 mM) em concentrações finais de 0,4 e# 181; M e 0,1 M, respectivamente. NOTA: O excesso Cy3 ADN aumenta a concentração do duplex que transporta tanto Cy3 e Cy5 como resultado da troca de fio. </li><li> Taxas de fios por incubação a 98,5 ° C por 2 min, arrefecimento gradual para 5 ° C com uma taxa de rampa de 0,1 ° C / seg, e incubar em 5 &#160; ° C durante 2 horas. </li></ol> 2. Eletroforese em Gel para detectar dsDNA Curvatura <ol><li> Despeje a gel de poliacrilamida a 16,17 por mistura de acrilamida e soluções de bis-acrilamida numa proporção de 29.2:0.8, 5% (w / v) em 1X Tris / borato / EDTA (TBE), tampão a pH 8,0. Nota: 10 ml de solução de gel contém: 1,217 ml de 40% de acrilamida, 0,667 ml de 2% de bis-acrilamida, 1 ml de TBE 10X, 100 L de persulfato de amónio (APS) 10%, 10 l de TEMED, e o resto é dH2O Solidificação completa do gel leva cerca de 30 min. </li><li> Carregar o gel de poliacrilamida com amostras de DNA e a escada de DNA em 1X tampão de carga (5% de glicerol, 0,03% (w / v) bl bromofenolue) e correr o gel a 5-8 V / cm a 4 ° C durante 45 minutos ou até a frente do corante aproxima-se da extremidade do gel. </li><li> Mancha do gel utilizando tampão 1X TBE contendo brometo de 0,5 g / ml de etídio durante 30 min. Identificar as bandas de DNA sob iluminação UV. Comparar as posições da banda com o marcador de tamanho (escada de 100 pb de ADN) para calcular os tamanhos aparentes das moléculas de DNA. NOTA: Curved DNAs geralmente se movem mais lentamente do que DNAs retas. </li></ol> 3. Caudal Preparação das células <ol><li> Fure 6-7 pares de furos ao longo de dois lados opostos de uma lâmina de vidro (3&#39;&#39; x 1&#39;&#39;) usando uma furadeira e brocas de diamante. Após a perfuração, esfregue o slide em água corrente para remover o pó de vidro visível. NOTA: Os furos servem como entradas e saídas de perfusão. Durante a perfuração, o arrefecimento da lâmina com água é importante para evitar a fissuração. </li><li> Colocar as lâminas na posição vertical em uma jarra de vidro e encha-o com água. Sonicar por 15 min e transferi-los para outra jarra de vidro dedicated para limpeza acetona. Encha-o com acetona e sonicado por 15 min. Lavar as lâminas com etanol usando um borrifador e depois com água. Coloque-os em um frasco de polipropileno, preenchê-lo com 5 M de hidróxido de potássio e sonicado por 15 min. Finalmente, sonicate as lâminas em água por 15 min. Limpar as lamelas (# 1, 24 x 40 mm), utilizando o mesmo protocolo. NOTA: lâminas e lamínulas limpos podem ser armazenados em dH 2 O para uso a longo prazo. </li><li> Mistura-se 1 mg de biotina-PEG-silano (MW 3400), com 80 mg de mPEG-silano (MW 2000) em 340 L de solução de bicarbonato de sódio 0,1 M. Misture bem e centrifugar a mistura rapidamente para se livrar das bolhas. NOTA: A funcionalização da superfície de polietileno glicol (PEG) ajuda a reduzir a ligação não específica de ADN na superfície. </li><li> Coloque 80 L da solução de PEG em cada slide e delicadamente abaixar uma lamela sobre ele. Aguarde 45 min. Separe a lamela do slide com uma pinça, lave-os com uma quantidade abundante de dH 2 O e deixe them secar ao ar livre. </li><li> Coloque tiras finas de fita dupla-pau em todo o slide para formar canais. Alinhe uma lamela sobre ele e pressione firmemente o lamela contra o slide para formar canais estanques. O uso de 5 minutos de epóxi para vedar as extremidades dos canais. </li></ol> 4. Preparação de Solução de Trolox <ol><li> Coloque ~ 30 mg de Trolox e 10 ml de dH2O num balão e usar uma barra magnética de agitação para agitar a solução ao ar livre durante 18 horas. </li><li> Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 um e ajustar o pH a 7 por adição de ~ 6 ul de base Tris 1 M. (pH 11). Nota: Trolox é um reagente anti-piscar, que é comumente usado em uma única molécula estuda 18. A acção antifading de Trolox vem de um seu derivado oxidado, que está presente na solução de Trolox parcialmente degradado 19. Dissolver rapidamente Trolox em metanol ou uma solução de pH elevado Tris devem ser evitadas por causa da oxidação ineficaz. </li></ol> 5. Single-molImagem ecule <ol><li> Injectar 15 mL de solução de NeutrAvidin (0,5 mg / ml) para dentro do canal e esperar durante 2 min antes da lavagem com 100 mL de tampão de T50 (10 mM Tris-HCl, 50 mM de NaCl, pH 7,0). </li><li> Injectar 50 mL de amostra de DNA (50-100 pM) para dentro do canal. Aguarde 5 minutos e enxaguar o DNA não ligado afastado com 100 L de tampão T50. NOTA: as moléculas de ADN irá ligar-se especificamente à superfície através da interacção biotina-NeutrAvidin. </li><li> Encher o canal com o tampão de imagem que contém um sistema de eliminação de oxigénio 20 (PCD 100 mM, APC 5, Trolox 1 mM, e NaCl 500 mM). </li><li> Defina o EMCCD no modo de transferência de quadros para transmitir 2 x 2 imagens Guardado (256 x 256) para o computador a 25 quadros por segundo. </li><li> Coloque o óleo de imersão sobre a objetiva do microscópio, e fixar a célula de fluxo no palco microscópio usando clipes de amostras. Grosseiro-ajustar o foco, olhando para o padrão de reflexão do laser na parede. Fine-ajustar o foco usando a exibição ao vivo de fluorescência imidades no monitor. </li><li> Comece a aquisição de dados com o laser de 532 nm, em. Verifique a visualização ao vivo e ajustar o foco, se necessário. Pare de aquisição de dados quando a maioria das moléculas têm Foto-descoloração. NOTA: Nesta instalação, um programa escrito em laboratório C para controlar o microscópio e exibir imagens ao vivo no monitor como eles são salvos no disco rígido é usado. </li></ol> 6. Processamento de Imagem e Análise de Dados NOTA: A série temporal de 256 x 256 imagens são processadas por um código MATLAB para gerar traços de Cy3 e Cy5 intensidades tempo de moléculas individuais. Para emparelhar pixels entre o canal doador eo canal receptor da imagem split-view, 6-7 pares de Cy3 e Cy5 pontos, cada par de uma mesma molécula uniformemente dispersas em todo o campo de visão, são colhidos manualmente, e uma transformação afim é calculada usando as coordenadas desses pontos como pontos de ancoragem. <ol><li> Usando um script MATLAB, olhar através de todos os tempos uma única molécula traça tchapéu mostra várias transições entre os sinais de baixa e alta traste. Identificar os estados em loop e unlooped. NOTA: O sinal de FRET é definida como a intensidade de Cy5 (Ia) dividido pela soma de Cy3 e Cy5 intensidades (I-a + I d). Estado loop tem alto valor FRET enquanto estado unlooped tem baixo valor FRET. O histograma dos sinais de FRET uma única molécula é bimodalmente distribuídas por causa de looping reversível e unlooping. </li><li> Encontre o limiar que separa as duas distribuições, determinando a intersecção entre as duas curvas de Gauss embutidos. </li><li> Calcule a eficiência FRET como <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq7.jpg" /> e atribuir os estados em loop com altos valores de FRET e os estados unlooped com baixos valores de traste. </li><li> Usando um script MATLAB, analisar o número acumulado de moléculas (N (t)) que dava (ouatingiu o elevado estado FRET) em diferentes lapsos de tempo desde o início da aquisição de dados. Observação: Uma vez que uma molécula de dsDNA pode começar em qualquer conformação do estado unlooped no início da aquisição de dados, a taxa de aumento na população anelada reflete a taxa de looping média média mais conformações iniciais. Extraia o looping ciclo taxa k ajustando N (t) com uma função exponencial: <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq1.jpg" /> Se aumenta bifasicamente, ele pode ser equipado com uma função exponencial dupla: <img fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51667/eq2.jpg" /> Neste caso, k é obtido a partir de ciclo: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51667/eq3.jpg" /> NOTA: Teoricamente, a probabilidade de sobrevivência que um polímero não tem loop no tempo t não é um simples ou dupla função exponencial 12. Fitt Exponencialing é usado como um meio prático para extrair o tempo médio de looping. </li></ol> 7. Determinação do Fator J NOTA: O factor J representa como concentrado numa extremidade de um ADNcd é em torno da outra extremidade. Ele pode ser determinado por interpolação a concentração de um segmento de extremidade do DNA que produzir a mesma taxa de reacção com o outro segmento de extremidade como a taxa de looping medido. Experimentalmente, um segmento de extremidade é imobilizado sobre a superfície, e o outro segmento de extremidade é introduzido numa determinada concentração c. Se a taxa de recozimento medido entre as duas extremidades é k emparelhar, então o factor de J 21 é dada pela <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq4.jpg" /> . A constante de velocidade de recozimento (k = k recozimento de emparelhamento / C) é independente da concentração da sonda. <ol><li> Fluxo 20 l de 30-50 pM biotina-Cy5 oligo (Primer 3) into um canal NeutrAvidin-revestido. Lavar o canal com 100 T50 mL para lavar oligos não ligados. </li><li> Preparar o tampão de formação de imagens conforme descrito na parte 5 com a adição de Cy3 oligo (iniciador 2) a uma concentração final de 50 nM. Fluxo este buffer de imagem para o canal. </li><li> Mantendo o laser de 532 nm, gire rapidamente o laser de 640 nm para identificar os locais de oligos Cy5 ligado à superfície. Desligue o laser de 640 nm e começar a monitorar o sinal de FRET. NOTA: Após a hibridização de um oligo Cy3 a um Cy5 oligo-bound superfície, Cy5 fluorescência surgirão FRET. </li><li> Usando um script MATLAB, analisar o número de moléculas que se iniciam no estado livre (baixa intensidade Cy5), mas mais tarde se transformar em Estado (alta intensidade de Cy5) recozido em função do tempo a partir de vestígios de intensidade Cy5. </li><li> Traçar este número de moléculas em função do tempo recozidos. Coloque esta curva com uma única função exponencial ( <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq5.jpg"/&gt;) Para obter a taxa de recozimento (k recozimento). </li><li> Repetir esta experiência a diferentes concentrações de Cy3 oligo (60, 100, e 180 nm) para confirmar a linearidade entre a velocidade de recozimento e a concentração de reagente. Extrai-se a constante de velocidade de segunda ordem de recozimento (k recozimento ) A partir da inclinação. </li><li> Calcular o factor de J <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq6.jpg" /> , Onde k é a taxa de ciclo de looping medido nas mesmas condições de tampão. </li></ol>

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Um ensaio de uma única molécula simples baseado em FRET foi utilizado para estudar a cinética de looping de ADN de diferentes formas intrínsecas. DNAs curvos podem ser preparados por uma sequência de repetição de 10-mer em fase com o período helicoidal de 10,5 pb, e suas curvaturas pode ser estimada utilizando PAGE. Estes dsDNAs são projetados com extremidades pegajosas para permitir a estabilização laço transitória. Foram extraídos a taxa de looping do aumento exponencial do número de moléculas em loop ao longo do tempo. A constante da taxa de hibridação entre os segmentos de extremidade desconectados pegajoso é usado para determinar a concentração equivalente de a densidade de probabilidade de loop, que é conhecido como o factor de J. Num ensaio de ciclização de ADN-ligase de base, a medição da probabilidade de fecho de ADN é sensível à concentração de ligase, e o factor de J pode ser sobrestimada se ligase é excessiva 9. A ligação não específica de DNA ligase ao DNA também pode afetar o 10 looping. Além disso, LIGASe atividade depende de sal e decai com o tempo. Assim, é difícil estudar looping de ADN em condições sub-óptimas para a actividade de ligase. Em contraste, um ensaio baseado em FRET looping é isento de todas estas preocupações. O protocolo experimental é semelhante ao da Vafabakhsh e Ha 13, excepto dois aspectos importantes que não são dignas de discussão. Vafabakhsh e Ha 13 construído suas moléculas de dsDNA por ligação de vários oligonucleótidos sintéticos. Embora o erro (inserção, exclusão ou substituição) taxa por nucleotídeos na síntese oligo é negligenciável (f 0,181%) 23, a fração de seqüências de DNA não-intencionais aumenta linearmente com o comprimento oligo. Portanto, uma amostra duplex 100 pb preparado por este protocolo pode conter até ~ 33% duplex imperfeitas que podem resultar em maior taxa de looping 24. Em comparação, o nosso protocolo utiliza reacção em cadeia de polimerase (PCR), para sintetizar as moléculas de dsDNA, que tem uma fidelidade muito maior do que o ADN do chemosynthesis 25. De acordo com os dados do fabricante, a polimerase de alta fidelidade usamos iria gerar uma molécula de ADN de 100 pb correcta em 99,8% de probabilidade, após 30 ciclos de amplificação por PCR. Outra diferença fundamental entre os dois estudos é o esquema de imobilização superfície. No nosso estudo, as moléculas de ADN são ligados à superfície através das suas extremidades, enquanto que no protocolo de Vafabakhsh e Ha 13, estão ligados através de uma base interna. A previsão era de que, com base no efeito de confinamento sozinho, um dsDNA preso internamente pode circular com mais frequência do que um dsDNA livre, até um fator de cinco, dependendo da localização da pinagem interna 26. Portanto, quando se mede o factor J como uma função do comprimento de contorno do DNA, pinagem interno pode introduzir variabilidade inesperado. Também é possível que a base modificada com o ligante tem uma capacidade fraca de emparelhamento de base, o que pode resultar numa taxa de laçada superior. No entanto, despite essas diferenças aparentes, os dois protocolos produzem fatores J semelhantes a 100 bp (~ 3 nm vs ~ 2 nM). Este ensaio looping baseada FRET é uma promessa para estudar uma ampla gama de fenômenos relacionados à looping dsDNA incluindo o efeito dos desajustes, cortes ou lacunas em dsDNA looping 27, o efeito das proteínas de ligação DNA em dsDNA looping, e dependência da temperatura de flexibilidade dsDNA. Estes tópicos seria difícil de tratar com a ciclização à base de ligase convencional. O ensaio de looping baseados em FRET pode também ser utilizado para medir o factor de J em relação ao comprimento do contorno, o qual é a relação padrão para testar os modelos de polímero. No entanto, o protocolo que apresentamos aqui não é bem adequada para estudar looping de dsDNA menor do que 100 pb. Abaixo desse comprimento, dsDNA looping se torna extremamente lento e, portanto, a taxa medida será afetado por outros processos não intencionais, como a fotodegradação. Pode acelerar a cinética de looping aparentes por nósing alta concentração de sal ([Na +]&gt; 500 mM), mas relevância fisiológica de tal medida se torna duvidosa. Assim, a investigação de dsDNA dobrando escalas de comprimento abaixo de 100 bp irá beneficiar de uma abordagem ortogonal para ensaios baseados em ciclização.

Compreender as propriedades mecânicas do dsDNA é de fundamental importância em ciências básicas e aplicações de engenharia. A estrutura do dsDNA é mais complicado do que uma escada helicoidal reto porque os ângulos de rolo, de inclinação e torção entre pares de bases sucessivas pode variar de acordo com seqüência. Flutuações térmicas podem causar dsDNA se submeter a diversos modos de flutuações conformacionais tais como flexão, torção e alongamento. Transições, como fusão e dobras também pode ocorrer em condições extremas. Entre esses movimentos, dsDNA flexão tem o impacto biológico mais perceptível 1. dsDNA flexão está associada com a repressão ou a activação de genes, trazendo dois locais distantes próximos uns dos outros. Também desempenha um papel importante no empacotamento do ADN no interior do núcleo da célula ou uma cápside viral. Dobrando deformação de dsDNA pode ser visualizado experimentalmente por microscopia de alta resolução (AFM 2 e TEM 3), e o thermodynamics cinética e podem ser estudados por meio de ensaios de loop, que ligam quimicamente sítios justapostas do dsDNA. Um tal ensaio é dependente da ligase de ciclização 4. Neste ensaio, as moléculas de dsDNA com (coesas) extremidades &#39;sticky&#39; são circularizado ou dimerizada por DNA ligase. Ao comparar as taxas de círculo e a formação de dímero, pode-se obter uma concentração molar eficaz de uma das extremidades do DNA na vizinhança da outra extremidade, que é conhecido como o factor de J. Este factor de J é dimensionalmente equivalente à densidade de probabilidade de encontrar uma extremidade do ADN a uma curta distância a partir da outra extremidade, e, portanto, reflecte a flexibilidade do ADN. Medindo o factor J como uma função do comprimento do DNA revela várias características sobre a mecânica de ADN, incluindo o comprimento de 4,5 persistência. A cadeia sem-fim-como modelo (WLC) tem sido amplamente considerado como o modelo de polímero canônico para a mecânica dsDNA com base em seu sucesso na explicaçãoIning as curvas de força-de extensão obtidos no ADN puxando as experiências 6 e predizer correctamente os factores J dsDNAs de mais do que 200 pb 7. No entanto, utilizando o ensaio de ciclização em moléculas de dsDNA tão curtos como 100 pb, Cloutier e Widom medidos os factores J ser várias ordens de magnitude maiores do que a previsão do modelo WLC 8. Um ano depois, Du et al. produzido factores J de acordo com o modelo WLC utilizando o ensaio de ciclização com concentrações mais baixas de ligase e atribuído o resultado anómalo a partir do grupo Widom a altas concentrações de ligase utilizada 9. Esta controvérsia exemplifica a influência inevitável de DNA-ligase em cinética de ciclização quando se utiliza o ensaio convencional 9. Além disso, a DNA ligase também pode afetar a estrutura do DNA e rigidez através inespecífica 10,11 vinculativo. Para eliminar as preocupações técnicas de ensaios looping dependentes de proteína, que recentemente demonstrou um protensaio looping ein-livre baseado em fluorescência Resonance Energy Transfer (FRET) 12. Neste método, as conformações laçados são detectados por FRET entre o doador e receptor ligado perto das extremidades coesivas de uma molécula de DNA. Um total de microscópio de fluorescência de reflexão interna de tipo de objectivo (TIRFM) é utilizado para registar trajectórias de looping reversível e eventos unlooping de moléculas de DNA únicas imobilizado à superfície, por um período de tempo prolongado. Este método apresenta a montagem baseado em PCR de moléculas de ADN para gerar moléculas de ADN livre de desadaptação, o que é uma melhoria essencial ao longo de um método semelhante por Vafabakhsh e Ha 13. O aspecto de molécula única deste protocolo permite a medição da distribuição, para além Ensemble médias enquanto que o aspecto de FRET permite medir a dinâmica de looping de ADN repetidamente a partir da mesma molécula, mesmo em condições que possam prejudicar a actividade de ligase. A configuração TIRFM é mostrado na Figura 1. Um costumeConcebido fase amostra é colocada sobre um corpo do microscópio Olympus IX61. 532 nm e 640 nm lasers são introduzidos a partir do lado e são reflectidos por pequenos espelhos elípticas 14 para o objectivo de NA elevado para atingir o ângulo crítico de incidência na interface lamela de água. Notamos que mais difundido através TIR-objectivo usando espelhos dicroicos ou configurações TIR-base de prisma também pode ser utilizado para esta aplicação de FRET. A imagem de fluorescência formada pelo microscópio é dividido em dadores e aceitadores de imagens por um espelho dicróico. Eles são, então, re-trabalhada em duas metades de um EMCCD. Filtros de emissão adicionais passa-longa são usados ​​para reduzir o sinal de fundo. O controle de temperatura é essencial para a aquisição de dados cinéticos reprodutíveis. Por controlo da temperatura, o objectivo é separada da peça de nariz do corpo do microscópio para minimizar a transferência de calor e de água a partir de uma temperatura controlada resfriador / aquecedor é feito circular através de uma gola de bronze que se encaixa firmementeem todo o interior metal embaixo do casaco objetivo. Esta configuração é capaz de alcançar o controlo robusto temperatura na superfície lamela entre 15 e 50 ° C (Figura 2). Neste trabalho, a temperatura da amostra foi mantida a 24 ° C. O protocolo a seguir apresenta o procedimento passo-a-passo para a construção de DNA, a estimativa de forma DNA, molécula única experiência, e J determinação do fator.

<table><tbody><tr><td>Small DNA FRAG Extract Kit-100PR</td><td>VWR</td><td>97060-558</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide 40% solution 500 ml</td><td>VWR</td><td>97064-522</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml</td><td>VWR</td><td>97063-948</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp</td><td>Fermentas</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Mini Vertical PAGE System</td><td>VWR</td><td>89032-300</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter 0.2 &amp;mu;m CS50</td><td>VWR</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813-1G</td><td>triplet state quencher</td></tr><tr><td>Protocatechuic acid (PCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08992-50MG</td><td>oxygen scavenging system</td></tr><tr><td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td>oxygen scavenging system</td></tr><tr><td>mPEG-silane, MW 2,000 1 g</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Silane, MW 3,400</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>F-540L</td><td></td></tr><tr><td>Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47020</td><td></td></tr><tr><td>Premium plain glass microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR micro cover glass, rectangular, no. 1</td><td>VWR</td><td>48404-456</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>temperature control</td></tr><tr><td>Objective Cooling Collar</td><td>Bioptechs</td><td>150303</td><td>temperature control</td></tr><tr><td>KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage</td><td>Semprex</td><td>KMI53</td><td></td></tr><tr><td>High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW</td><td>Edmund optics</td><td>NT66-968</td><td>Cy3 excitation</td></tr><tr><td>CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector</td><td>Coherent</td><td>1139604</td><td>Cy5 excitation</td></tr><tr><td>650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>FF650-Di01-25x36</td><td>splitting dichroic</td></tr><tr><td>LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, &amp;amp; 543.5 nm lasers, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>LM01-552-25</td><td>combining dichroic</td></tr><tr><td>Brightline Fluorescence Filter 593/40</td><td>Semrock</td><td>FF01-593/40-25</td><td>Cy3 emission filter</td></tr><tr><td>635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>BLP01-635R-25</td><td>Cy5 emission filter</td></tr><tr><td>EMCCD iXon+</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>IX51 inverted microscope frame</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil type-F for fluorescence microscopy</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>2 mm Diameter 45&amp;deg; Rod Lens Aluminum Coated&amp;nbsp;</td><td>Edmund optics</td><td>54-092</td><td>miniature mirror</td></tr><tr><td>1/4&quot; Travel Single-Axis Translation Stage</td><td>Thorlabs</td><td>MS-1</td><td>translation of miniature mirror</td></tr><tr><td>&amp;Oslash;1&quot; Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A</td><td>focusing lens</td></tr><tr><td>Adjustable Mechanical Slit</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td></td></tr><tr><td>Dielectric Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Oslash;1&quot; Achromatic Doublet, f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A</td><td>relay lens</td></tr><tr><td>Lens Mount for &amp;Oslash;1&quot; Optics</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic Filter Mount</td><td>Thorlabs</td><td>FFM1</td><td></td></tr><tr><td>Fixed Cage Cube Platform</td><td>Thorlabs</td><td>B3C</td><td></td></tr><tr><td>Kinematic Mount for &amp;Oslash;1&quot; Optics</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lens, &amp;Oslash;1&quot;, f = 40 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-A</td><td>collimating lens</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lense, &amp;Oslash;6.0 mm, f = 15 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1222-A</td><td>telescope lens</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lense, &amp;Oslash;6.0 mm, f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1433-A</td><td>telescope lens</td></tr></tbody></table>

studying dna looping by single-molecule fret

Dobrando de ADN de cadeia dupla (dsDNA) está associado com muitos processos biológicos importantes, tais como o reconhecimento de DNA-proteína e embalagem de ADN em nucleossomas. A termodinâmica da dobragem ADNcd foi estudado por um método chamado de ciclização que se baseia na ADN-ligase para se juntar covalentemente extremidades pegajosas curtas de um ADNcd. No entanto, a eficiência ligadura pode ser afetada por vários fatores que não estão relacionados com dsDNA looping, como a estrutura do DNA em torno das extremidades pegajosas unidas e ligase também pode afetar a taxa de looping aparente através de mecanismos como a ligação não específica. Aqui, vamos mostrar como medir dsDNA cinética looping sem ligase por detectar a formação transitória laço DNA por FRET (Fluorescence Resonance Energy Transferência). moléculas de dsDNA são construídos utilizando um protocolo baseado em PCR simples, com um par de FRET e um ligante de biotina. A densidade de probabilidade looping conhecido como o factor de J é extraído a partir da taxa de looping e a taxa de hibridação entre duas desconexãoted extremidades pegajosas. Ao testar dois dsDNAs com diferentes curvaturas intrínsecas, mostra-se que o factor de J é sensível à forma intrínseca do dsDNA.

As moléculas de ADN utilizadas para o estudo de looping consistem de uma região dúplex de sequência variável, e o comprimento e saliências em cadeia simples que sejam complementares uma da outra. As saliências, que são 7 bases de comprimento, pode emparelhar com o outro para capturar o estado anelada. Cada saliência contém ou Cy3 ou Cy5 que está ligado na espinha dorsal do DNA através da química amidite. O Cy5 saliência está também relacionada com biotina-TEG (15 átomos-Tetra-Etileno Glicol espaçador) para a imobilização de superfície (ver Figura 4A). Todas estas modificações podem ser incorporadas no dsDNA seguindo um protocolo baseado em PCR (protocolo 1 e Figura 3B). O comprimento escolhido ea seqüência das saliências funcionam bem para produzir eventos FRET detectáveis ​​e reversíveis em condições experimentais normais. O entrelaçamento e a cinética unlooping do laço de ADN são sensíveis à temperatura ambiente, e, por conseguinte, um controlador de temperatura é essencial para a reprodutibilidade. Tal controller pode ser prontamente incorporado no microscópio (Figura 2). Usando TIRFM, flutuações de sinais (aceitador) a partir de moléculas de dsDNA imobilizada superfície foram observados (Figura 4B) Cy3 (dador) e Cy5 anti-correlacionados. No estado em laço, a distância entre dois corantes seja menor do que 5 nm, o que iria resultar em sinais de alta Cy5 e Cy3 sinal baixo devido à elevada eficiência de TERF (Figuras 4A e 4C). Vários experimentos de controle foram realizados para provar que o elevado estado FRET representa o estado em loop. O tempo de vida do estado FRET alta aumentou com o aumento do comprimento saliência, o que sugere que o estado de alta FRET é estabilizada por pareamento de bases entre as duas saliências. O tempo de vida do estado FRET alta também diminuiu com a redução comprimento DNA, o que é esperado porque o loop livre aumenta a energia como o loop torna-se menor 12. Com base nessas evidências, o sta alta e baixa FRETtes pode ser atribuído aos estados em loop e unlooped, respectivamente. Para testar o efeito de curvatura intrínseca de dsDNA em looping, dois dsDNAs 186 pb com curvaturas diferentes foram construídos, as quais são designadas (S-DNA) &quot;hetero&quot; e &quot;curvo&quot; (C-DNA) com base na sua curvatura. A sequência de 10-mer de repetição é TTTATCATCC para a ADN-C e TGACAGCAAC para a ADN-S. A curvatura global de cada um destes dsDNAs foi verificada por PAGE (electroforese em gel de poliacrilamida), que é o método mais amplamente utilizado para estimar dsDNA curvatura 16,22. Figura 5 mostra que o S-ADN é executado de forma semelhante para o DNA do mesmo tamanho na escada de ADN (comparar pista 1 e pista 2 na Figura 5). Por outro lado, o ADN-C mostra um tamanho aparente maior em comparação com a sua contrapartida na escada de ADN (~ 1,2 maior do que o seu real tamanho, ver a pista 1 e a pista 3). Esta observação indica que o C-ADN possui um cu intrínseca maiorrvature do que o ADN-S. A Figura 6 mostra uma fluorescência traço representativo do tempo a partir do ADN-C (Figura 6A) e o traço de FRET correspondente (Figura 6B). Em comparação com o DNA-S (Figuras 4B e 4C), o C-DNA produz mais eventos de alto FRET durante o mesmo período de tempo; o DNA C loops de 4 vezes mais freqüentemente do que o S-DNA durante o mesmo tempo de aquisição (Figura 7). Este resultado demonstra que a curvatura intrínseca do DNA podem afetar significativamente a dinâmica de looping. Para extrair o fator J da taxa de loop, é necessário medir a constante de velocidade de segunda ordem independente de concentração para a hibridização entre duas saliências desconectados. A realização de tal medição é mostrado na Figura 8A. Hibridização do oligo Cy3 ao oligo Cy5 imobilizada produz Cy5 rajadas de intensidade devido a se preocupar. De mea múltiplasurements com diferentes concentrações de Cy3-oligo (ver Figura 8B), se pode extrair de um modo estatisticamente robusta. Na nossa experiência, a constante da taxa de hibridação entre os dois oligos em 500 mM de NaCl foi determinado como sendo de 0,45 ± 0,04 x 10 6 M -1 seg -1. O factor J foi calculada dividindo a taxa de looping (k circular) pela constante de velocidade de segunda ordem de recozimento (k recozimento &#39;). Foi 61 ± 3 nM para o S-DNA e 265 ± 48 nM para a ADN-C. O fator J do DNA-S (Figura 9) está de acordo com as medições anteriores justo no comprimento similar 7. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51667/51667fig1highres.jpg" /> Figura 1. Tipo Objetivo TIRFM. A) excitação óptica. Os 532 nm e 640 nm lasers são colimada separadamente a um simildiâmetro ar, incorporada pelo mesmo caminho por um espelho dicróico, e focado em um pequeno espelho elíptico colocado debaixo da abertura de volta objetiva. É importante a utilização de uma lente acromática para focar a minimizar a aberração cromática. B) Microscopia óptica. A posição lateral do espelho miniatura tem de ser finamente ajustadas de modo que pode reflectir o feixe de laser através do objectivo minimamente, enquanto o bloqueio de emissão de fluorescência. Por isso, ela deve ser montada sobre uma pequena fase de tradução. Outra espelho no lado oposto reflecte o laser de saída para impedir que ele se infiltre óptica de detecção. No plano de imagem fora do corpo do microscópio, uma fenda ajustável é colocado para cortar a imagem para metade do tamanho da área de detecção do CCD. A emissão de fluorescência é dividido por um espelho dicróico em dois canais, e as lentes de retransmissão formar a segunda imagem no CCD com 1:1 de ampliação. Um dos espelhos que refletem é ligeiramente girada para compensar o doadore as imagens de aceitador. A passagem de banda e um longpass filtros são usados ​​para reduzir a fundo nos canais de doador e receptor, respectivamente. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51667/51667fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51667/51667fig2highres.jpg" /> Controle Figura 2. Temperatura para experimentos única molécula. Conjunto A temperatura (T s) é a leitura no refrigerador de água / aquecedor. A temperatura real (T a) é medida por um termopar de contacto com a superfície superior da lamela do microscópio. A trama das temperaturas reais contra seis temperaturas definidas diferentes (quadrados pretos) mostra excelente linearidade (linha tracejada verde). A robustez do controlador é mostrada por meio de medições aleatórias feitas em momentos posteriores (diamantes vermelhos). A inserção é o retrato da co temperaturaunidade eo objetivo ntrolling em sua montagem final. A linha vermelha representa a inclinação da unidade. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51667/51667fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51667/51667fig3highres.jpg" /> Figura 3. DNA de design. A) Curvo dsDNA. Um ADNcd 10-mero é representada como um segmento de tubo curvo, e as duas cadeias simples como linhas tracejadas. O eixo helicoidal de qualquer ADN de 10-mer não é perfeitamente recta, e, assim, cada uma concatenação de tais 10-mer levará à inclinação incremental do eixo helicoidal na mesma direcção. Este efeito pode ser explorada para gerar um planar, molécula superhelical. B) preparação baseada em PCR de ADNcd. Os DNAs de cadeia simples são apresentados como uma linha horizontal. Sua curvatura real não é descrito aqui. O segmento central em preto representa o<html> única parte do fragmento de DNA. Mostrado em cinzento claro são as sequências adaptadoras comuns a todos os ADN utilizadas neste estudo. Primer 1 e 4 anneal aos adaptadores frente e para trás, respectivamente. Iniciador 2 marcado com Cy3 é na extremidade 5 &#39;. Primer 3 tem uma marcação de biotina na extremidade 5 &#39;e um Cy5 ligados internamente. As regiões azuis claros de Primer 2 e 3 contêm seqüências complementares que funcionam como extremidades pegajosas. Ou um plasmídeo ou de ADN genómico que contém a sequência de interesse é utilizado como molde em duas reacções de PCR separadas. DsDNA marcado com Cy3 é produzido utilizando o iniciador 1 e 2, e ADN marcado com Cy5 biotinilado é produzido utilizando o iniciador 3 e 4. Estes dois produtos de PCR são aquecidos e arrefecidos em conjunto para a troca de fio. Quatro dsDNAs diferentes são formados, apenas um dos quais contém Cy3, Cy5, e biotina. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51667/51667fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> sempre &quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51667/51667fig4highres.jpg" /> Figura 4. Esquema Experimental. A) Single-molécula experimento FRET. moléculas de dsDNA marcadas com Cy3 (verde) de um lado e Cy5 (vermelho) do outro são imobilizadas sobre a PEG (polietileno glicol)-superfície revestida. Looping reversível e unlooping de dsDNAs resultar em alta FRET (loop) e baixa (FRET) unlooped estados, respectivamente. B) Uma única molécula traço típico tempo de doador (verde) e receptor (vermelho) intensidades de fluorescência. Os estados FRET altas e baixas são identificados como os estados em loop e unlooped, respectivamente. Também é indicado o primeiro tempo loop que é usado para calcular a taxa de ciclo. (Inset) O zoom-in figura mostra o anti-correlação entre as intensidades Cy3 e Cy5. C) Um traço do tempo de eficiência FRET calculado a partir de doador e receptor intensidade traça em B. Figura 4B e <s<html> trong&gt; 4C foram tomadas a partir do ADN recta (S-DNA) como descrito no texto principal. A baixa FRET em 0,2 é devido a excitação direta de Cy5 pelo laser de 532 nm, e confirma a presença de Cy5 ativo fluorescente. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51667/51667fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/51667/51667fig5highres.jpg" /> Figura 5. Eletroforese em gel de poliacrilamida (29.2:0.8 acrilamida / bis-acrilamida, 5% em tampão TBE, pH 8,0) de DNAs sintéticos. Da esquerda para a direita, as pistas contêm um marcador kb, o ADN de 186 pb e Hetero a 186 pb DNA curvo. Este valor é parcialmente adaptado de uma publicação anterior 12 com permissão. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51667/51667fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> _content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/51667/51667fig6highres.jpg" /> Figura 6. Vestígios representativos do ADN curvo (C-ADN) (A) e o seu rastreio FRET correspondente (B). Comparação da intensidade e vestígios FRET entre S-ADN (Figuras 4B e 4C), e C-ADN (Figuras 6A e 6B) mostra claramente que o DNA curvo laços mais freqüência do que o DNA diretamente na mesma condição buffer. (Inset) A figura zoom-in mostra o anti-correlação entre as intensidades Cy3 e Cy5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51667/51667fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/51667/51667fig7highres.jpg" /> Figura 7. Os tempos médios de looping primeiro dos DNAs retas e curvas. Cada time foi extraído a partir de ~ 500 moléculas em cinco campos diferentes. As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM), calculado a partir de 3 experimentos independentes. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51667/51667fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/51667/51667fig8highres.jpg" /> Figura 8. Determinação da constante de velocidade de recozimento do oligo de hibridização. A) Representação esquemática da medição da taxa de recozimento. Cy5 iniciador é imobilizado sobre a superfície, e Cy3 iniciador está presente em 50-180 nM. Ligação e desligação do iniciador Cy3 em 50 nM de ocorrer de forma reversível e levar a rajadas aceitadores detectáveis, os quais são mostrados no cesto. B) A taxa de recozimento depende linearmente da concentração do oligo livre. A inclinação da linha representa a constante de velocidade de segunda ordem de recozimento (k Annea &#39;<html> l). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51667/51667fig8highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/51667/51667fig9highres.jpg" /> Figura 9 Os fatores J dos DNAs retas e curvas calculadas em nM O fator J foi determinada com base em dois measurables:... A taxa de loop do circuito dsDNA ea constante de velocidade de recozimento das saliências complementares gratuitos <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51667/51667fig9highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada .</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="594"><tbody><tr height="50"><td height="50" style="height:50px;width:351px;"> Componente </td><td style="width:123px;"> Volume/50 reação mL </td><td style="width:121px;"> A concentração final </td></tr><tr height="25">oito: 25px; width: 351px; &quot;&gt; Água </td><td style="width:123px;"> 36 mL </td><td style="width:121px;"></td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;width:351px;"> Tampão phusion 5x </td><td style="width:123px;"> 10 ul </td><td style="width:121px;"> 1x </td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;width:351px;"> 10 mM de dNTP </td><td style="width:123px;"> 1 ul </td><td style="width:121px;"> 200 uM de cada </td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;width:351px;"> Cartilha Forward (25 mM) </td><td style="width:123px;"> 1 ul </td><td style="width:121px;"> 0,5 fiM </td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;width:351px;"> Primer reverso (25 mM) </td><td style="width:123px;"> 1 ul </td><td style="width:121px;"> 0,5 fiM </td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;width:351px;"> Phusion começo quente DNA polimerase (2<html> U / mL) </td><td style="width:123px;"> 0,5 ul </td><td style="width:121px;"> 0,02 U / ul </td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;width:351px;"> ADN molde </td><td style="width:123px;"> 0,5 ul </td><td style="width:121px;"> ~ 1 ng </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Mistura de reacção da PCR. O protocolo foi optimizado para a polimerase de ADN Phusion. Os itens devem ser adicionados nesta ordem. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="525"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;width:159px;"> Etapa do Ciclo </td><td style="width:123px;"> Temperatura </td><td style="width:91px;"> Tempo </td><td style="width:153px;"> Número de ciclos </td></tr><tr height="28"><td height="28" style="height:28px;width:159px;"> A desnaturação inicial </td>&quot;&gt; 95 ° C </td><td style="width:91px;"> 30 seg </td><td style="width:153px;"> 1 </td></tr><tr height="28"><td height="28" style="height:28px;width:159px;"> A desnaturação </td><td style="width:123px;"> 95 ° C </td><td style="width:91px;"> 5 seg </td><td rowspan="3" style="width:153px;"> 30 </td></tr><tr height="28"><td height="28" style="height:28px;width:159px;"> Recozimento </td><td style="width:123px;"> 60 ° C </td><td style="width:91px;"> 10 seg </td></tr><tr height="28"><td height="28" style="height:28px;width:159px;"> Extensão </td><td style="width:123px;"> 72 ° C </td><td style="width:91px;"> 15 seg / kb </td></tr><tr height="28"><td height="56" rowspan="2" style="height:56px;width:159px;"> Extensão final </td><td style="width:123px;"> 72 ° C </td><td style="width:91px;"> 5 min </td><td rowspan="2" style="width:153px;"> 1 </td></tr><tr height="28"><td height="28" style="height:28px;width:123px;"> 4 &amp; #176; C </td><td style="width:91px;"> segurar </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Instruções dos ciclos de PCR. A temperatura de recozimento é determinado com base nas temperaturas de fusão dos iniciadores. O tempo de extensão é otimizado para a DNA polimerase Phusion.

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Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Este estudo apresenta um procedimento experimental detalhado para medir a dinâmica de loop de DNA de cadeia dupla usando uma única molécula de fluorescência Resonance Energy Transfer (FRET). O protocolo também descreve como extrair a densidade de probabilidade looping chamado o factor de J.

Estudar DNA Looping por Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

studying-dna-looping-by-single-molecule-fret

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

15.3K visualizações.  Georgia Institute of Technology.  Este estudo apresenta um procedimento experimental detalhado para medir a dinâmica de loop de DNA de cadeia dupla usando uma única molécula de fluorescência Resonance Energy Transfer (FRET). O protocolo também descreve como extrair a densidade de probabilidade looping chamado o factor de J. 

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A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, glass coverslips are functionalized in a one-step reaction with silane-PEG-biotin. Flow cells are constructed by sandwiching an adhesive tape with pre-cut channels between a functionalized coverslip and a PDMS slab containing inlet and outlet holes. Multiple channels are integrated into one flow cell and the flow of reagents into each channel can be fully automated, which significantly increases the assay throughput and reduces hands-on time per assay. Inside each channel, biotin-&#955;-DNAs are immobilized on the surface and a laminar flow is applied to flow-stretch the DNAs. The DNA molecules are stretched to &#62;80% of their contour length and serve as spatially extended templates for studying the binding and transport activity of fluorescently labeled molecules. The trajectories of single molecules are tracked by time-lapse Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) imaging. Raw images are analyzed using streamlined custom single particle tracking software to automatically identify trajectories of single molecules diffusing along DNA and estimate their 1D diffusion constants.

This protocol demonstrates a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying one-dimensional (1D) diffusion of molecules along DNA.

Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Bioquímica

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription to take place in eukaryotic cells. The dynamics of nucleosomes provides access to the DNA by replication and transcription machineries, and critically contributes to the molecular mechanisms underlying chromatin functions. Single-molecule studies such as atomic force microscopy (AFM) imaging have contributed significantly to our current understanding of the role of nucleosome structure and dynamics. The current protocol describes the steps enabling high-resolution AFM imaging techniques to study the structural and dynamic properties of nucleosomes. The protocol is illustrated by AFM data obtained for the centromere nucleosomes in which H3 histone is replaced with its counterpart centromere protein A (CENP-A). The protocol starts with the assembly of mono-nucleosomes using a continuous dilution method. The preparation of the mica substrate functionalized with aminopropyl silatrane (APS-mica) that is used for the nucleosome imaging is critical for the AFM visualization of nucleosomes described and the procedure to prepare the substrate is provided. Nucleosomes deposited on the APS-mica surface are first imaged using static AFM, which captures a snapshot of the nucleosome population. From analyses of these images, such parameters as the size of DNA wrapped around the nucleosomes can be measured and this process is also detailed. The time-lapse AFM imaging procedure in the liquid is described for the high-speed time-lapse AFM that can capture several frames of nucleosome dynamics per second. Finally, the analysis of nucleosome dynamics enabling the quantitative characterization of the dynamic processes is described and illustrated.

Here, we present a protocol to characterize nucleosome particles at the single-molecule level using static and time-lapse atomic force microscopy (AFM) imaging techniques. The surface functionalization method described allows for the capture of the structure and dynamics of nucleosomes in high-resolution at the nanoscale.

Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Pinças magnéticas para a Medição do Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Bioengenharia

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas por pinça óptica

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. To investigate its mechanism, there are two essential technical requirements. First is single-nt resolution that can resolve normal translocation from frameshifting, during which the ribosome moves by other than 3 nt. The second is the capability to probe both the entrance and exit sides of mRNA in order to elucidate the whole picture of translocation. We report the dual DNA ruler assay that is based on the critical dissociation forces of DNA-mRNA duplexes, obtained by force-induced remnant magnetization spectroscopy (FIRMS).&#160; With 2-4 pN force resolution, the dual ruler assay is sufficient to distinguish different translocation steps. By implementing a long linker on the probing DNAs, they can reach the mRNA on the opposite side of the ribosome, so that the mRNA position can be determined for both sides. Therefore, the dual ruler assay is uniquely suited to investigate the ribosome translocation, and nucleic acid motion in general. We show representative results which indicated a looped mRNA conformation and resolved normal translocation from frameshifting.

Dual DNA ruler assay is developed to determine the mRNA position during ribosome translocation, which relies on the dissociation forces of the formed DNA-mRNA duplexes. With single-nucleotide resolution and capability of reaching both ends of mRNA, it can provide mechanistic insights for ribosome translocation and probe other nucleic acid displacements.

Réguas duplas do ADN para estudar o mecanismo da translocação ribosome com a definição do único-nucleotide

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

R-Loop Analysis by Dot-Blot

The three-stranded nucleic acid structure, R-loop, is increasingly recognized for its role in gene regulation. Initially, R-loops were thought to be the by-products of transcription; but recent findings of fewer R-loops in diseased cells made it clear that R-loops have functional roles in a variety of human cells. Next, it is critical to understand the roles of R-loops and how cells balance their abundance. A challenge in the field is the quantitation of R-loops since much of the work relies on the S9.6 monoclonal antibody whose specificity for RNA-DNA hybrids has been questioned. Here, we use dot-blots with the S9.6 antibody to quantify R-loops and show the sensitivity and specificity of this assay with RNase H, RNase T1, and RNase III that cleave RNA-DNA hybrids, single-stranded RNA, and double-stranded RNA, respectively. This method is highly reproducible, uses general laboratory equipment and reagents, and provides results within two days. This assay can be used in research and clinical settings to quantify R-loops and assess the effect of mutations in genes such as senataxin on R-loop abundance.

This protocol details a simple method that quantifies R-loop, a three-stranded nucleic acid structure that comprises of an RNA-DNA hybrid and a displaced DNA strand.

The three-stranded nucleic acid structure, R-loop, is increasingly recognized for its role in gene regulation. Initially, R-loops were thought to be the ...

Genética

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.

Pinças ópticas para estudar interações RNA-proteína no regulamento de tradução

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

Imagem de molécula única de condensados EWS-FLI1 montados no DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

<meta charset="utf8"></head><body>Reconstituição de nucleossomos in situ para estudos de molécula única

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Reconstituição eficiente de nucleossomos para técnicas de molécula única

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

Estudar DNA Looping por Single-Molecule FRET

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Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

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Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

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