Name: a simple, robust, and high throughput single molecule flow stretching assay implementation for studying transport of molecules along dna
Uploaded: 2017-10-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
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Agradecemos a Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick e Evangelos Gatzogiannis para obter ajuda com a configuração inicial de instrumentação e testes. Agradecemos ainda mais Tony Kulesa para ajuda significativa escrita e avaliando a única partícula personalizada, software de rastreamento. Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização e um prémio de carreira na Interface científica (para PCB) da Fundação Wellcome Burroughs.

1. preparação da biotina-λ-DNA Nota: moléculas de DNA-biotina-λ são preparadas por ligando um biotina-etiquetadas do oligonucleotide, 5 &#39;-AGGTCGCCGCCC(A) 20 - biotina - 3 &#39; para Λ-DNA moléculas 20.
<ol><li>Biotina 0,1 mM de preparar rotulado oligo em tampão TE.</li>
	<li>Estoque de λ-DNA de 0,5 mg/mL de calor a 65 ° C por 60 s e mergulho no gelo molhado logo. 
	Nota: Retardamento de rápido resfriamento reduz λ-DNA concatemerization.</li>
	<li>Pipetar 100 µ l da solução de λ-DNA em um tubo de microcentrifugadora.</li>
	<li>Adicionar 1 µ l do oligo 0,1 mM em 9 µ l de tampão TE.</li>
	<li>Adicionar 2 µ l da solução de oligo ao microcentrifuga tubo contendo o DNA de λ. Homogeneiza. 
	Nota: Oligo está presente em aproximadamente um 12-fold excesso molar durante o fim de λ-DNA complementar.</li>
	<li>Aquecer a mistura de λ-DNA/oligo a 65 ° C por 60 s.</li>
	<li>Esfriar lentamente a mistura à temperatura ambiente. 
	Nota: Este passo permite que o oligo recozer a extremidade λ-DNA complementar.</li>
	<li>Coloque a mistura sobre o gelo. Adicionar 11 µ l de tampão de reação T4 DNA ligase (concentração de buffer final 1 x). Misture suavemente. Em seguida, adicione 2 µ l (800 unidades) da enzima de T4 DNA ligase. Misture suavemente.</li>
	<li>Incubar a mistura durante 2 h a 16 ° C, ou durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Purificar o produto utilizando tubos de filtro centrífugo com um limite de peso molecular nominal de 100 kDa. Especificamente, transfira a mistura do passo 1.9 em um tubo de filtro centrífugo e centrifugação a 14.000 x g por 5 min, lavar duas vezes com tampão de TE 400 µ l e recolher o produto purificado. 
	Nota: Os como-purificado biotina-λ-DNAs em tampão TE são estáveis a-20 ° C por até um ano.</li>
</ol> 2. Lamela functionalization Nota: as lamelas de vidro são acrescidas por reagir com silano-PEG-biotina. Este protocolo de reação de uma etapa é mais simples e mais confiável em nossa experiência que a reação de duas etapas padrão protocolo 20. Lamela functionalization com silano-PEG-biotina cria locais obrigatórios para streptavidin e minimiza o DNA inespecífico e adsorção de proteínas à superfície lamela.
<ol><li>Sonicate cinco lamelas de n º 1 em etanol a 95% no interior de uma coloração jar por 10 min e depois enxaguar com água ultrapura por três vezes. 
	Nota: A quinta lamela fornece um sobressalente em caso de ruptura.</li>
	<li>Encher o frasco de coloração com 1m KOH, proceda à sonicação durante 10 min e depois enxaguar com água ultrapura três vezes.</li>
	<li>Repetir duas vezes o ciclo de 2.1-2.2.</li>
	<li>Secar as lamelas sob fluxo de gás limpo e seco N 2.</li>
	<li>Além disso, limpe e seque as lamelas aplicando tratamento de plasma de ar à pressão de 900 mTorr 5 min.</li>
	<li>Incubar as lamelas com 25 mg/mL silano-peg-biotina dissolvido em etanol a 95% em temperatura ambiente por 2 h. especificamente, solução de silano-peg-biotina 50 µ l entre duas lamelas limpa e secas de sanduíche e incubar a lamela &#34; sanduíches &#34; dentro de uma caixa de ponta de pipeta fechado com cerca de 10 mL de água na parte inferior (não em contato com as lamelas) para minimizar a evaporação do solvente.</li>
	<li>Lavar em excesso PEG moléculas com água ultrapura e seco o PEG revestido lamelas sob limpo seco fluxo de gás de 2 N. 
	Nota: As lamelas funcionalizadas podem ser armazenadas três dias em condições ambientes.</li>
</ol> 3. Construção da célula de fluxo Nota: células de fluxo são construídas pela imprensa uma fita dupla-adesivo com canais pre-cut entre um PEG acrescida da lamela e uma laje PDMS contendo orifícios de entrada e saída. Vários canais estão integrados por célula de fluxo.
<ol><li>Projetar canais de fluxo em um software de CAD e cortar os canais (a largura, profundidade e comprimento de cada canais são 1, 0,13 e 12 mm, respectivamente) em uma fita adesiva dupla usando um cortador de fita (normalmente oito canais estão integrado por célula de fluxo). Remover resíduos de fita para formar os canais de fluxo.</li>
	<li>Tornar-se lajes PDMS, misture 45 g de PDMS com 5 g de reagente de reticulação (o suficiente para fazer doze 5 mm espessura SPDM lajes que podem ser armazenadas indefinidamente sob condições ambientais) usando uma batedeira, despeje a mistura em dois pratos de Petri de 10 cm e deixa o pratos para dentro de uma câmara de vácuo até essencialmente todas bolhas de ar sumiram foram (manualmente remover bolhas de ar se qualquer permanecem quando os pratos são removidos da câmara de vácuo). Depois transferir os pratos em um forno de 80 ° C até PDMS solidifica (cerca de 2h).</li>
	<li>Cortar uma laje de PDMS que corresponde ao tamanho da fita adesiva dupla com canais pre-cut. Casca de proteção um filme fora a fita adesiva de dupla e aderir o filme com uma face plana da laje PDMS. Os buracos e saídas de ar sobre a laje PDMS usando um furador de biopsia com uma agulha de calibre 23.</li>
	<li>Descasque o segundo filme de proteção fora a fita adesiva de dupla e aderir o assembly de PDMS-fita para a superfície funcionalizado da lamela (certifique-se que a lamela é plana. Veja uma foto de uma célula de fluxo totalmente montados na Figura 1a).</li>
</ol> 4. TIRF Imaging Nota: biotina-λ-DNAs estão amarrados a uma superfície de canal de fluxo e fluxo laminar é aplicado ao fluxo de esticar as moléculas de DNA ( Figura 1b). O &#62; 80% esticada servir de moléculas de DNA como modelos espacialmente estendidos para observar a atividade de ligação e transporte de moléculas fluorescente etiquetadas. As trajetórias de moléculas simples são controladas por lapso de tempo de imagem TIRF ( Figura 1 c &#38; e).
<ol><li>Correção da célula de fluxo em um microscópio estágio e carga pre-libertos em branco buffer (fosfato de sódio de 10 mM, 2 mM de NaCl, 50 µM EDTA, etanol de 20 mM, 5% (v/v) glicerol, 0,01% Tween-20, 1% (v/v) β-Mercaptoetanol, pH 7,4), 0,2 mg/mL de solução de estreptavidina, 1 mg / mL de solução de albumina de soro bovino (BSA) e solução de DNA-biotina-λ 100 pM em quatro reservatórios que cada um tem uma tubulação de Tygon conectado a um valor de solenoide e outra tubulação de Tygon ligado ao tubo ESPIADA por sleeving da tubulação de Tygon sobre o menor (de tubos PEEK impede o refluxo dos reagentes). Desgaseificar pequenos volumes de buffer por exposição durante a noite a vácuo ou menor exposição ao vácuo com agitação (até que as bolhas não são mais visíveis).</li>
	<li>Inserir o tubo PEEK do reservatório tampão em branco no furo de uma entrada da célula de fluxo. Encha o canal, fluindo no buffer em branco e insira três outros tubos PEEK nos orifícios de entrada a pressão do ar impulsionado o fluxo de cada reagente é controlada por válvulas de solenoide e totalmente automatizada através de um script de computador. Tenha cuidado para não induzir a formação de bolhas de ar no canal.</li>
	<li>Conectar uma tubulação de Tygon com um curto tubo PEEK do orifício da tomada para um contentor de resíduos. A tubagem de PEEK curta na saída ajuda a suprimir a formação de bolhas de ar durante a infusão, mantendo a pressão positiva dentro do canal.</li>
	<li>Tethering biotina-λ-DNA moléculas a uma superfície de canal de fluxo.
	<ol><li>Fluxo de 0,2 mg/mL solução de estreptavidina, incubar durante 5 min e então fluir no buffer em branco para lavar o streptavidin desacoplado.</li>
		<li>Fluxo em solução de 1 mg/mL BSA, incubar por 1 min e então fluir no buffer em branco para lavar a BSA desacoplada. 
		Nota: Suprime a BSA mais DNA e adsorção de amostra para a superfície.</li>
		<li>Fluxo em solução de DNA-biotina-λ 100 pM, incubar durante 10 minutos e então fluir no buffer em branco para lavar os DNAs desacoplados. 
		Nota: Depois que o DNA está vinculado à superfície, evitar fluxos rápidos para evitar danificar as moléculas de DNA amarradas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para verificar a qualidade da lamela funcionalizada, fluxo no DNA coloração tintura como Sytox laranja nas condições de ensaio a ser usado (Leia abaixo 4.6) e começar a fluorescência de imagem iluminação de laser em 532 nm. 
	Nota: A qualidade da lamela funcionalizada é geralmente boa e a densidade das moléculas de DNA de fluxo esticada será alta. É essencial ter bastante elevada densidade de moléculas de DNA de fluxo esticada para que a ligação de DNA e eventos de difusão de deslizamento/1D podem ser observados.</li>
	<li>Fine tune o ângulo TIRF para conseguir o melhor sinal à relação de ruído de imagens de moléculas de DNA esticadas ( Figura 1D).</li>
	<li>Para gravar as trajetórias de moléculas simples se movendo ao longo do DNA, repita os passos 4.2-4.4 dentro de um novo canal (sem DNA coloração tintura) e, em seguida, infundir previamente desgaseificado sub-nanomolar fluoróforo rotulado de moléculas em uma taxa de fluxo elevada suficiente usando uma bomba de seringa e recolher imagens de fluorescência de lapso de tempo, com uma taxa de quadros de 100 Hz. 
	Nota: Uma taxa de fluxo equivalente a um número de Weissenberg (Wi: o produto adimensional de muito tempo polímero relaxamento - aproximadamente 0.2 s λ-DNA - e a taxa de cisalhamento - a mudança na velocidade de fluxo com a distância da superfície da lamela) de 500 dentro do canal é recomendado para a imagem latente de molécula com uma taxa de quadros de 100 Hz 21.
	<ol><li>Recolher 10.000 frames em um campo de visão (FOV) para produzir um filme e coletar filmes semelhantes de vários FOVs (normalmente 10), por exemplo. 
		Nota: A densidade de partículas única em um FOV deve ser nem muito alto - que irá complicar a análise de dados, tornando a atribuição do objeto através de quadros ambíguas, nem muito baixos - susceptíveis de conduzir à baixa ocorrência de eventos única molécula de DNA.</li>
		<li>Otimizar a intensidade de iluminação para que as moléculas vinculadas à superfície lamela são rapidamente foto-branqueada para suprimir o fundo enquanto moléculas difusão no DNA não são clareadas também rapidamente para que podem ser detectadas trajetórias mais. 
		Nota: Normalmente usamos densidade de potência 200-800 W/cm 2 o FOV.</li>
	</ol></li> <li>No final da etapa 4.6, infundir coloração tintura de DNA para confirmar que as moléculas de DNA ainda podem ser alongada fluxo.</li>
	<li>Executar ambas as amostras de controlo positivo e negativo. 
	Nota: Um bom controle positivo é um tetrapeptide, diversos (TMR)-KRRR (TMR é acoplado à amina N-terminal) que tem uma média constante de difusão 1D de 10,5 ± 0,7 (erro padrão) M (bp 2/s) em pH neutro 11. Um bom controle negativo é para medir amostras etiquetadas de interesse no buffer de ensaio em um canal que não tem nenhum DNA amarrado, onde deve ser detectada nenhuma atividade de difusão no ADN.</li>
</ol> 5. Análise de dados: Nota: uma única partícula personalizada, software de rastreamento é usada para identificar as trajetórias de moléculas simples difusão ao longo do DNA e estimar constantes de difusão. Este software primeiro determina as posições de centroide de partículas única com exatidão elevada, identifica partículas presas na superfície de lamela e vincula as partículas em quadros diferentes para formar as trajetórias de lapso de tempo. Dessas trajetórias, estimam-se as constantes de difusão 1D.
<ol><li>Para iniciar a análise de dados, um script software aberto (ver tabela de materiais) e vá para o diretório de uma única partícula software de rastreamento. Abra o script chamado &#34; largedataprocess3.m &#34;. Um parâmetro importante a ser definido é o valor de limiar para a deteção de partícula única.</li>
	<li>Para determinar o valor de limiar ideal, execute o &#34; Determine_threshold_value.m &#34; script. Este script irá indicar como o valor de limiar afeta a deteção de partícula única. Depois de determinar o valor de limiar ideal, execute o &#34; largedataprocess3.m &#34; script</li>
	<li>Após a conclusão de uma única partícula acompanhamento análise, filtrar as trajetórias crus executando o &#34; Trajectory_filtering.m &#34; script. Uma Interface de usuário gráfica (GUI) é construído em Visualizar o passo filtragem.</li>
	Painel de <li>sobre o GUI, definir o deslocamento mínimo ao longo do DNA, MinXDisp, para 2 pixels; definir o máximo deslocamento transversal ao ADN, MaxYDisp, para 2 pixels; definir o número mínimo de quadros, minFrames, a 10; definir o número mínimo de Estados de triplet, minTriplets, 10; definir a constante de difusão mínima ao longo do DNA, D_par, para 0; definir a constante de difusão estimada máxima transversal ao ADN, D_trans, para 10m (bp 2) S -1; Defina o parâmetro mínimo estatística, Chi 2 stat, para -5; definir o rácio mínimo de deslocamento ao longo do DNA para aquela transversal ao DNA, MinX/Y, 2. 
	Nota: Todas as trajetórias crus que passam estes parâmetros de filtragem estão listadas na tabela 1, e aqueles que não estão listados na tabela 3.</li>
	<li>Clique em uma trajetória número na tabela 1, a trajetória será deslocada em gráficos 1 &#38; 2. Clique sobre o &#34; Play &#34; botão para reproduzir as imagens de fluorescência cru. Clique sobre o &#34; Add_to_Table2 &#34; para identificar a trajetória como uma única molécula deslizando a trajetória. No final, todas as trajetórias adicionadas ao Table2 serão salvo quando fechar o GUI.</li>
	<li>Para calcular as constantes de difusão média, execute o script &#34; Calculate_mean_diffusion_constant.m &#34;. Estima-se a constante de difusão média do conjunto de trajetórias que tenho passado todas as etapas de filtragem e foram adicionados à tabela 2.</li>
</ol>

<ol>
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O Instituto Broad pode eleger para pedidos de patentes de arquivo que incluem aspectos do trabalho aqui apresentado.

Quando se muda de protocolo em duas etapas tradicionais lamela functionalization reação a um protocolo de reação de uma etapa, notamos que a confiabilidade da lamela functionalization é significativamente melhorada. Como o tempo total de hands-on para a preparação da lamela é menos de 30 min, recomendamos preparar lamelas frescas cada imagem única molécula do dia é planejado. Para minimizar a deterioração de silano-PEG-biotina, o reagente deve ser aliquotadas e armazenado sob gás seco de2 N a-20 ° C, após o recebimento. Aqui não usamos PEG moléculas que produzem -COO– ou -CH3 grupos terminais que foram usados no passado20. As cargas negativas dos grupos -COO– e os grupos de3 -CH hidrofóbicas foram utilizadas para evitar a adsorção não específica de moléculas de DNA e proteína específica amostras para a superfície, respectivamente. Observamos muito baixa adsorção de superfície por amostras de peptídeos pequenos na superfície PEG totalmente terminada com biotina, enquanto silano-PEG-COOH e/ou silano-PEG-CH3 pode ser útil para os ensaios de certas amostras de proteína ou ensaio em condições (tais como pH &#60; 7.5) promova interações DNA-superfície.
A mudança de células de fluxo de slide de vidro para fluxo PDMS células acelera a construção de célula de fluxo e permite a fácil integração de múltiplos canais. Nós muitas vezes engenheiro oito canais por célula de fluxo para habilitar oito experimentos independentes por lamela funcionalizado. Para aumentar ainda mais a taxa de transferência por lamela, poderia ser usado ainda maior número de canais de microfabricadas.
É aconselhável para evitar a formação de bolhas de ar dentro do canal a qualquer momento após o enchimento inicial. Geralmente, as bolhas de ar não causa perda de DNAs amarrados (embora isso seja possível), mas prefiro dificultarem o fluxo e possivelmente causar DNAs se ater a lamela. Tampão de desgaseificação e a adição de quantidades pequenas de surfactante são normalmente eficazes na prevenção da formação de bolhas dentro do tubo e o fluxo de canal. Em casos onde as bolhas de ar são introduzidas para o tubo, tente eliminar as bolhas sob um fluxo lento e certifique-se de que eles não flui através da região onde o DNAs são amarrados.
Um software de análise de dados simplificada e eficiente é fundamental, devido à enorme quantidade de dados gerados. Normalmente coletamos 700.000 imagens de alta resolução de medições na pilha de um fluxo, que pode ser processada usando nossa única partícula personalizada, software de rastreamento dentro de um dia em um computador desktop com um quad-core processador e 32 Gb de memória. A taxa de falsos positivos de detecção de trajetórias de difusão 1D pelo software (passo 5.5) é dependente de amostra e pode ser bastante baixa tendo em conta que: 1) a densidade de partículas única no FOV é baixa o suficiente para que haja ambiguidade pouco ligando as partículas através de quadros ( amostras da proteína, em geral, são mais propensas a adsorção não específica para a lamela do que amostras de peptídeo, e assim, o buffer e a densidade de potência para cada proteína precisa ser otimizado da amostra); 2) o sinal à relação de ruído de partículas única é alto o suficiente para que a probabilidade de falso-identificação de partículas é baixa. Ainda assim, o software pode cometer erros ocasionais, e recomendamos a inspeção manual dos dados usando o fornecido GUI para avaliar o desempenho do software. Em um aplicativo é particularmente sensível à detecção de trajetória de falso-positivos, parâmetros de processo, incluindo o valor de limiar, minFrames, minTriplets e Chi2stat podem ser definidos de forma mais rigorosa à custa de menor sensibilidade para vinculação de verdade eventos e potencialmente maior viés estatístico na identificação da trajetória. Aqui partilhamos e descrever nossa única partícula que segue o software com a esperança de ajudar a padronizar os métodos de análise de dados e estimular a discussão sobre as práticas recomendadas.
Em nosso protocolo, que requer fluxo contínuo durante a imagem para manter o estado esticado das moléculas de DNA de modelo, o fluxo de fluido poderia influenciar o transporte de algumas proteínas ao longo de modelos de DNA se eles difundem através de um mecanismo de salto ou se a hidrodinâmica raio do fluoróforo etiquetado é grande22,23. Enquanto tal preconceito pode ser medido e corrigido na maioria dos conjuntos de dados, o transporte de proteínas rotulado com um fluoróforo pequeno e difusão por um mecanismo de deslizamento não é tipicamente tendencioso em medida detectável pelo fluxo2,4, 24. Notavelmente, o impacto da velocidade de fluxo no transporte de proteínas ao longo do DNA tem sido usado para estudar os mecanismos de difusão ao longo do DNA23de proteína. A estreitamente relacionados a abordagem alternativa, que permite medições na ausência de fluxo utiliza modelos de DNA com biotina em ambos termini que transitoriamente são esticados em fluxo e amarrados pelas duas extremidades para a lamela tal que as moléculas de DNA permanecem em um configuração estendida quando o fluxo é desligado25,26,,27,28. A abordagem de duplo-baraço tem a vantagem de permitir que os experimentos de fluxo livre transporte mas requer modificação de ambas as extremidades das moléculas de DNA do modelo, controle de fluxo de cuidado durante o tethering e caracterizando as distâncias entre os dois locais amarrados. Além disso, deve ser avaliado o impacto das tensões heterogêneas e dinâmica conformacional de DNA através de moléculas de DNA no ensaio de single-molécula.
No total, além de estudar a difusão 1D de moléculas ao longo do DNA, o ensaio relatada como única molécula pode beneficiar muitas em vitro bioquímicos e biofísicos estudos a nível de molécula incluindo DNA alvo de processos de busca por proteínas, actividades enzimáticas no DNA e muito mais.
Solução de problemas
Problema 1: Os canais de fluxo de vazamento.
Solução: em primeiro lugar, certifique-se de que o design dos canais de fluxo permite que a margem de pelo menos 1,5 mm para vedação em torno e entre canais; e então, durante a montagem da célula de fluxo, certifique-se que as superfícies de contato entre a lamela, a fita adesiva de dupla e a laje PDMS são plana, seca e livre de detritos, que a pressão aplicada para formar o selo é uniforme, e que a operação de vedação é realizada em temperatura ambiente.
Problema 2: A densidade de DNAs amarrados é muito baixa.
Solução: Este problema surge quando a PEG functionalization eficiência é baixa ou as moléculas de DNA não são acrescidas com biotina. De nossa experiência, a densidade do DNA amarrado deve ser elevada para &#62; 90% das lamelas preparado de fresco ou armazenados adequadamente silano-PEG-biotina reagente. Em casos quando a densidade do DNA amarrado é baixa com um lote comprovado de biotina-λ-DNA, tente aumentar as concentrações de silano-PEG-biotina durante functionalization PEG e concentrações de streptavidin e biotina-λ-DNA durante DNA amarrar. Se isto falhar, substitua os reagentes PEG e estreptavidina.
Problema 3: DNAs furar a lamela umd não pode ser esticado por fluxo.
Solução: Este problema também pode surgir quando a eficiência de functionalization PEG é baixa e é agravada pela pH baixo do ensaio. Tente fluindo em BSA mais ou elevar o pH (por exemplo, a 8.0) para ajudar a suprimir a adsorção de DNA à superfície (passo 4.3.2). Se a adsorção do DNA é um problema persistente sob uma condição de ensaio específico, tente incluindo acima de 90% silano-PEG-COOH durante functionalization PEG.
Notas de análise de dados:
Nós usamos personalizada única partícula software de rastreamento para identificar trajetórias de moléculas simples difusão ao longo do DNA, de que suas constantes de difusão 1D, D1 são estimados. Para melhorar a análise de dados, implementamos o algoritmo simetria radial18 para localização de partículas e o estimador baseado em covariância19 para estimar constantes de difusão 1D, que aceleraram dramaticamente a análise dos dados sem comprometer a precisão. Nós validado anteriormente o software personalizado, analisando dados simulados11. As principais etapas são descritas abaixo.
Identificação de partículas:
Esta etapa é para a detecção e segmentação de partículas - manchas de difração limitada - de fundo. Primeiro, espacialmente passa-banda filtrar as imagens para aumentar o sinal de partículas no 3-5 escala de pixel (que corresponde ao tamanho da função de ponto-propagação em nosso sistema) e depois com base na intensidade de limiar (ver roteiro: spt2_SD_sandbox.m).
Atribuição de centroide
Segmentar a imagem apenas localiza as moléculas a nível de pixel de resolução espacial. Para localizar moléculas de precisão muito maior, empregam a simetria Radial do algoritmo de resolução super18 imagens filtradas como acima. (Este método é baseado em um cálculo analítico e assim vastamente reduz a carga computacional em comparação com outros métodos populares de alta precisão como encaixe Gaussian 2D (ver roteiro: spt2_SD_sandbox.m).)
Partícula de rastreamento:
Para acompanhar a trajetória de uma partícula através do tempo, devemos re-identificar as mesmas partículas que se movem entre os quadros. Consideramos os estágios de iniciação, piscando e rescisão ser componentes de uma trajetória. Podemos restringir o enlace de partículas na atuais quadros que figuram nos quadros anteriores pelo deslocamento máximo permitido por quadro. Em casos onde as ligações múltiplas são possíveis, o algoritmo de Jonker-Volgenant é usado para produzir conjuntos de enlace globalmente ideal (ver roteiro: traceTraj4_kx.3.m).
Estimativa de D1:
Para estimar os valores de D1 de trajetórias, usamos o estimador baseado em covariância (CVE)19. Baseado em um cálculo analítico, este método é mais computacionalmente eficiente e estatisticamente rigorosos do que outros métodos tais como regressão dos deslocamentos quadrados médios comumente utilizados (ver roteiro: runspt5_SD.m).
Trajetória de filtragem:
Algumas trajetórias contenham artefatos como ligação de moléculas de superfície-limite e devem ser removidas. Implementamos diversas características tais como mínimo deslocamento paralelo ao DNA, máximo deslocamento transversal ao DNA, comprimento mínimo de trajetória, o número mínimo de posições triplet consecutivos detectado e pontuação de probabilidade mínima (ver Xiong et al11 para definição) que podem ser filtrados para isolar um conjunto minimamente tendencioso de trajetórias susceptíveis de representar moléculas difusão no ADN (ver roteiro: sptViewFig2_update3x.m).

Um problema de longa data em biologia é proteínas como endógenas que atuam em específicas sites no genoma podem localizar seus alvos de DNA rápido o suficiente para o organismo sobreviver e responder de forma eficaz ao seu ambiente. Estudos nos últimos quarenta anos proposto e em grande medida de apoio a hipótese de que a cinética de DNA alvo busca por uma proteína pode ser acelerada por facilitou a difusão, em que a proteína alterna entre difusão 3D a granel e difusão 1D (incluindo deslizamento e pulando processos) ao longo do DNA1. Agora sabe-se que muitas proteínas envolvidas na regulação gênica, metabolismo de ácidos nucleicos e outros processos são capazes de deslizar em DNA2,3,4,5,,67 ,8,9. Além disso, estudos recentes relataram que mesmo pequenos peptídeos podem vincular e deslize no DNA, com a capacidade de transportar uma carga; por exemplo, uma molécula de proteína ou PCR primer, ao longo de DNA10,11,12,13,14.
Nos últimos 15 anos, o ensaio de alongamento de fluxo única molécula foi amplamente utilizado para estudar a ligação e a difusão de moléculas ao longo de15,2,DNA16. Neste tipo de ensaio, moléculas de DNA dupla-hélice biotinylated são imobilizadas para a superfície e um fluxo laminar é aplicado ao fluxo de esticar o DNA. O &#62; 80% esticada DNAs servir como modelos espacialmente estendidos para estudar a atividade de ligação e transporte de moléculas rotulado com fluorophores onde as trajetórias de moléculas simples ao longo do DNA são controladas pela imagem latente de fluorescência de lapso de tempo. Na nossa implementação, otimizada para reprodutibilidade e facilidade de uso, este ensaio consiste em cinco etapas principais: preparação de biotina-λ-DNA, lamela functionalization, construção de célula de fluxo, imagem latente de fluorescência e análise de dados. Em anteriores protocolos17, as lamelas de vidro foram acrescidas pela primeira reação com (3-aminopropil) triethoxysilane (APTES) e, em seguida, com reagentes de amina reativos polietileno glicol (PEG) (por exemplo, NHS-PEG-biotina) para formar uma camada de PEG que resiste adsorção não específica de componentes de ensaio à superfície da lamela. A qualidade de lamelas funcionalizadas dependia em grande parte a qualidade dos reagentes de PEG e condições de reação em cada etapa. Nosso protocolo descreve um protocolo simplificado functionalization e construção de célula de fluxo multiplex que exige nenhum adesivo líquido ou tempo de cura sobre as células de fluxo do dia são montados. Também descrevemos uma simplificada e robusto de dados análise procedimento11 que elimina etapas computacionais regressão através da aplicação de um método de simetria radial de centroide localização18 e uma difusão baseados em covariância estimador constante19.
Aqui, nós relatamos um simples, robusto, e a única molécula alto throughput fluxo alongamento implementação de ensaio com significativas melhorias feitas em lamela functionalization, construção de célula de fluxo e análise de dados. Em particular, desenvolvemos um protocolo functionalization lamela de uma etapa, em que as lamelas de limpo e secas reagem diretamente com silano-PEG-biotina. Este protocolo simplifica a preparação da lamela e melhora a confiabilidade da qualidade de superfícies funcionais em comparação com o protocolo de reação padrão em duas fases. Nós descrevemos o uso de então-acrescida de lamelas com células de fluxo PDMS multi-canal que permitem conexões de tubulação robusto ser feita sem cola. Estas células de fluxo mais incluem vários controlado por computador entradas para cada câmara de fluxo que permitem o fluxo de reagente automatizado para reduzir o tempo de prático durante a instalação e ensaio maior throughput.

<table><tbody><tr><td>Biotin labeled oligo, 5&amp;rsquo;-AGGTCGCCGCCC(A)&lt;sub&gt;20&lt;/sub&gt;-biotin-3&amp;rsquo;</td><td>IDT</td><td>Custom oligo synthesis</td><td>Standard desalting purification is sufficient</td></tr><tr><td>&amp;lambda;-DNA</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>N3011S</td><td>Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase and ligation reaction buffer</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510008</td><td></td></tr><tr><td>No. 1 glass coverslips</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Pure ethanol</td><td>VWR</td><td>89125-186</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide pellets</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner, model No. PDC-32G</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silane-peg-biotin</td><td>Nanocs</td><td>PG2-BNSL-5k</td><td>Store at -20&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C in dry nitrogen gas</td></tr><tr><td>A CAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD</td><td></td></tr><tr><td>Double-adhesive tape</td><td>Adhesive Applications</td><td>8512-2-DP/DL</td><td></td></tr><tr><td>Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP</td><td>Graphtec America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS and crosslink reagent kit</td><td>R.S. Hughes</td><td>RTV615 CLEAR 010</td><td></td></tr><tr><td>Degassing chamber, model No. F42010-0000</td><td>BEL-ART Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mixer, model No. ARV-310</td><td>Thinky</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm</td><td>Harris Uni-Cores</td><td></td><td>This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size</td></tr><tr><td>Tygon tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06420-02</td><td>0.020&quot; ID, 0.060&quot;OD</td></tr><tr><td>Peek tubing</td><td>Western Analytical</td><td>PK007-031-Y</td><td>0.007&quot; ID, 0.031&quot;OD</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>N7021S</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Sytox orange nucleic acid stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Ti-E Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment</td></tr><tr><td>100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CMOS camera</td><td>Hammamatsu</td><td>Orca Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Semrock</td><td>FF560/659-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-577/690-25</td><td></td></tr><tr><td>532 nm laser</td><td>Rayscience Innovation Limited, Shanghai</td><td>OEMLL-FN-532nm-C</td><td>Select wavelength to correspond to stain of choice</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Chemxy</td><td>Fusion 200</td><td></td></tr><tr><td>TMR-KRRR, &gt;=85% purity</td><td>MIT Biopolymer lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pVIc-Cy3B, HPLC purified</td><td>A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Script programming software</td><td>MathWorks</td><td>Matlab</td><td></td></tr><tr><td>* see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a simple, robust, and high throughput single molecule flow stretching assay implementation for studying transport of molecules along dna

Descrevemos um ensaio de alongamento de fluxo única molécula simples, robusta e de alta taxa de transferência para estudar a difusão 1D de moléculas ao longo do DNA. Neste ensaio, as lamelas de vidro são acrescidas em uma reação de uma etapa com silano-PEG-biotina. Células de fluxo são construídas pela imprensa uma fita adesiva com canais pre-cortadas entre uma lamela funcionalizada e uma laje PDMS contendo orifícios de entrada e saída. Vários canais estão integrados na pilha de um fluxo e o fluxo dos reagentes em cada canal pode ser totalmente automatizado, que significativamente aumenta o throughput de ensaio e reduz o tempo de hands-on por ensaio. Dentro de cada canal, biotina-λ-DNAs são imobilizadas na superfície e um fluxo laminar é aplicado para fluxo-esticar os DNAs. As moléculas de DNA são esticadas para &#62; 80% do seu comprimento de contorno e servir como espacialmente estendidos modelos para estudar a atividade de ligação e transporte de moléculas fluorescente etiquetadas. As trajetórias de moléculas simples são controladas por lapso de tempo de imagem Total da fluorescência de reflexão interna (TIRF). Imagens RAW são analisadas usando simplificada personalizada única partícula que segue o software automaticamente identificar trajetórias de moléculas simples difusão ao longo do DNA e estimar suas constantes de difusão 1D.

Figura 2a mostra as trajetórias detectadas de pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B é conjugada com o resíduo de cisteína) moléculas de difusão no DNA em 2 mM NaCl de buffer no pH 6,5. A difusão de pVIc é bi-direcional e impulsionado pela energia térmica do ambiente. Dessas trajetórias, as constantes de difusão 1D (valores de D1) são estimadas para cada trajetória (ver o histograma na Figura 2b). O valor de D1 deste pVIc conjugado médio é calculado para ser 22,2 ± 0,9 (erro padrão) M (bp2/s) calculando a cada valor de D1 em trajetórias ponderadas pelo número de chamadas de posição consecutiva triplet contidos em cada trajetória.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig1.jpg"> 
Figura 1 : Aparelho para controlar o movimento de moléculas simples ao longo do DNA. a) um PDMS de oito canais microfluídicos microplaqueta adere a uma lamela funcionalizada à qual DNA pode ser amarrado (com moeda de quarto de EUA para escala); b) fluxo esquemático de célula zoom mostrando moléculas alongada fluxo λ-DNA; c) diagrama esquemático do sistema de microscópio e fluxo TIRF para alongamento do DNA; d) imagem TIRF de um fluxo alongada λ-DNA; e) imagem TIRF de pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B é conjugada com o resíduo de cisteína) moléculas acoplado a um fluxo alongada λ-DNA. Esta figura foi modificada com a permissão de2,12. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55923/55923fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig2.jpg"> 
Figura 2 : Difusão unidimensional de pVIc (GVQSLKRRRCF) ao longo do DNA. a). difusão de pVIc ao longo do fluxo esticada λ-DNAs (137 trajetórias) no buffer de 2 mM NaCl a pH 6,5. x(t) e y (t) são os deslocamentos ao longo e transversal para λ-DNA, respectivamente. Linhas horizontais pontilhadas indicam pontos faltando resultantes de tintura piscando. b). histograma da constante de difusão, D1 para pVIc difusão ao longo de λ-DNAs. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55923/55923fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

Este protocolo demonstra um ensaio de alongamento de fluxo única molécula simples, robusta e de alta taxa de transferência para estudar a difusão unidimensional (1D) moléculas ao longo do DNA.

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.1K visualizações.  Massachusetts Institute of Technology and Harvard Medical School. Este protocolo demonstra um ensaio de alongamento de fluxo única molécula simples, robusta e de alta taxa de transferência para estudar a difusão unidimensional (1D) moléculas ao longo do DNA.

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

Alongamento curtas seqüências de DNA com Pinça força constante óptico axial

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Bioengenharia

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Bioquímica

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biologia

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the averaging that takes place in bulk-phase studies. To achieve visualization, dual optical tweezers, where one trap is fixed and the other is mobile, are focused into one channel of a multi-stream microfluidic chamber positioned on the stage of an inverted fluorescence microscope. The optical tweezers trap single molecules of fluorescently labeled DNA and fluid flow through the chamber and past the trapped beads, stretches the DNA to B-form (under minimal force, i.e., 0 pN) with the nucleic acid being observed as a white string against a black background. DNA molecules are moved from one stream to the next, by translating the stage perpendicular to the flow to enable the initiation of reactions in a controlled manner. To achieve success, microfluidic devices with optically clear channels are mated to glass syringes held in place in a syringe pump. Optimal results use connectors permanently bonded to the flow cell, tubing that is mechanically rigid and chemically resistant, and which is connected to switching valves that eliminate bubbles that prohibit laminar flow.

Visual, single-molecule biochemistry studied through microfluidic chambers is greatly facilitated using glass barrel, gas-tight syringes, stable connections of tubing to flow cells, and elimination of bubbles by placing switching valves between the syringes and tubing. The protocol describes dual optical traps that enable visualization of DNA transactions and intermolecular interactions.

Uso de pinças ópticas duplas e microfluídicas para estudos de molécula única

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Desenrolamento de DNA mediado por CMG observado pelo crescimento do trato ssDNA-RPA

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Desvendando a dinâmica da replicação do DNA eucariótico por meio da visualização de uma única molécula

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Caracterizando mudanças conformais de molécula única fluxo de cisalhamento com microscopia de fluorescência

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Alongamento curtas seqüências de DNA com Pinça força constante óptico axial

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

Uso de pinças ópticas duplas e microfluídicas para estudos de molécula única

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

Caracterizando mudanças conformais de molécula única fluxo de cisalhamento com microscopia de fluorescência