Name: glutamine flux imaging using genetically encoded sensors
Uploaded: 2014-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder 1R21NS064412, concessão NSF 1052048 e Jeffress Memorial Trust concessão J-908.

1. Exemplo de Preparação Nota: Em muitos casos, experimentos de perfusão lavar uma parte significativa de células, o que pode se tornar um problema frustrante. Embora não seja necessário para todas as linhas celulares, as superfícies de vidro com tampa de revestimento de poli-L-Lisina (adicionar 1,0 ml/25 cm2 de solução de 0,01% para a superfície, incubar&gt; 5 min, lavar duas vezes com água de grau de cultura de células, e seco em a cabine de segurança biológica) aumenta a adesão celular. Além disso, estar ciente do nível de biossegurança (BSL) da linha celular utilizada, e siga o procedimento operacional padrão aprovado pelo escritório local de saúde e segurança ambiental. Neste experimento, as células COS 7 foram utilizadas devido à baixa atividade de transporte de glutamina endógena (veja a Figura 4). <ol><li> As células COS7 semente em ~ 70-80% de confluência em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) + 10% de soro de vitelo cósmica e 100 U / ml de penicilina / estreptomicina, ou em lamelas de vidro estéreis 25 milímetros colocadas na cultura de 6 poçosprato ou 8 poços lâminas com fundo de vidro. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2, com 100% de humidade durante 24 horas. </li><li> Trocar o meio de crescimento para DMEM +10% de soro de vitelo cósmica (sem antibióticos), de acordo com o protocolo do fabricante. Grow O / N a 37 ° C, 5% de CO 2 a 100% de humidade. </li><li> Adicionar 0,4 mg de cada ADN de plasmídeo que codifica o sensor de glutamina (pcDNA3.1, carregando o sensor FLIPQTV3.0 sob promotor de CMV 10) e o ASCT2 mCherry marcado com 10 a 50 ml de meio isento de soro (meio OPTI-MEM) e misturar suavemente. </li><li> Adicionar 1 ml de reagente de transfecção de 50 ml de meio isento de soro. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Misturar as duas soluções contendo ADN (passo 1.3) e reagente de transfecção (passo 1.4) e incubar durante 20 min. </li><li> Adicionar cuidadosamente o reagente de transfecção em cima das células e misturar gentilmente pelo balanço da câmara. Incubar durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO 2, com 100% de humidade. </li><li> Após 24 horas, trocar o meio de DMEM + 10% Cosmic Calf Serum(CCS) + 100 unidades de penicilina / estreptomicina. </li><li> As células são fotografadas 48-72 horas pós-transfecção. </li></ol> 2. Experiment Perfusão Nota: Para as células COS7 utilizadas nesta experiência, e os meios de perfusão foram câmara mantida a temperatura ambiente e ambiente concentração de CO 2. No entanto, se as células a ser utilizadas requerem temperatura mais elevada e de CO 2 de controlo de concentração para a sobrevivência, estágio de microscópio aquecida e / ou uma câmara ambiental deve ser usado. <ol><li> Prepare perfusão AF tampão (Veja a lista de materiais). Anexar torneiras a 50 ml seringas, feche as torneiras depois preenchê-los com as soluções para perfusão. Abrir a torneira de passagem, por um breve período de preencher o espaço de cabeça na torneira com o tampão. </li><li> Ligue a 8 canais, sistema de perfusão de alimentação por gravidade com um lápis de perfusão, e em seguida, selecione &quot;Modo Manual&quot; em Selecione a opção de função. Coloque um recipiente de resíduos sob o lápis de perfusão. </li><li> Manualmenteativar as portas, pressionando os números correspondentes e encher os tubos com 10 ml seringa contendo água e feche a porta. Uma vez que os portos estão cheios de água, definir as seringas contendo buffers AF na porta 1-6 de sistema de perfusão e, em seguida, abra as torneiras. Abrir as portas novamente para substituir a água na tubagem, com os tampões. O caudal deve ser de cerca de 0,8 ml / min. </li><li> Imprensa cancelar uma vez no controlador de perfusão para voltar ao menu &quot;Select Function&quot;. Alternar a opção &quot;Edit Program&quot;, em seguida, digite o protocolo de perfusão indicado na Tabela 1. Salve o programa de perfusão. </li><li> Tome as células fora da incubadora. Lavar duas vezes com o tampão de perfusão, e em seguida, defina as células no palco. Ligue o sistema de perfusão para a câmara. Se uma câmara aberta é usada, configurar outra bomba que remove a solução de perfusão da câmara. </li><li> Abra o software Slidebook. Iniciar um novo slide. Nota: Oprocedimento seguinte é específico para o software Slidebook, mas o outro software, como MetaFluor e Nis-elemento também pode ser utilizado para o tipo de imagem descrito aqui. Teoricamente experimentos podem ser realizados utilizando qualquer software que permite imagens curso de tempo, e as sequências de imagens podem ser analisados ​​pós-experimentalmente usando softwares como o ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ou Fiji (http:/ / fiji.sc / Fiji). No entanto, o software que permite o acompanhamento em tempo real da relação doador / receptor é altamente útil. </li><li> Montar o slide para o palco microscópio fluorescente. Encontrar as células co-expressando o sensor e ASCT-mCherry utilizando filtros adequados (veja a lista de materiais), sob a função &quot;FOCUS&quot;. Ajuste o ganho clicando na guia &quot;Câmara&quot; e deslizar a barra deslizante em &quot;ganho&quot;. Além disso, ajustar a configuração de filtro de densidade neutra a partir do menu drop-down filtro de densidade neutra. Nota: Se o cubo de filtro não inclui um filtro de olho, não use os pedaços de olho desde shorT-comprimento de onda de luz de excitação é prejudicial para os olhos. Use a tela do computador para encontrar as células em seu lugar. </li><li> Adquirir imagens de células with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Filtros são especificados na Lista de Material). Clique em &quot;Captura de Imagem&quot; e, em seguida, na janela de aquisição, especificar os filtros que vão ser usados. Clique no botão &quot;TEST&quot; para ajustar o tempo de exposição, digitando o tempo de exposição desejado na caixa ao lado das configurações do filtro. Nota: Todos os três canais necessitam de ser exposto durante o mesmo período. Ao ajustar os parâmetros de imagem, pegue a variação da eficiência FRET esperado e dobre aumentar em conta: por exemplo, se a eficiência FRET está prevista para ir até 2 vezes durante o experimento, os parâmetros de imagem deve ser ajustadade modo que a intensidade do Dador Aceitador ex in no estado de repouso deve ser &lt;50% do valor máximo que pode ser gravada pelo instrumento, de modo que o canal se torne não saturado durante a experiência. Sinal a partir das células marcadas devem ser, pelo menos, três vezes mais elevada do que na região do fundo. </li><li> Desenhe uma região de interesse utilizando a ferramenta regiões do software. Alternativamente, uma função de software para seleccionar os pixels acima determinada intensidade pode ser utilizado, e, em seguida, convertido em regiões. Para fazer isso, clique em Mask - Segmento, em seguida, mova a barra deslizante para destacar as áreas desejadas. </li><li> Selecione &quot;lapso de tempo&quot; na caixa tipo de captura, em seguida, especificar o intervalo (10 seg neste experimento) e pontos de tempo para o experimento. </li><li> Desenhe uma região em uma área sem quaisquer células fluorescentes. Esta área é usado para subtracção do fundo. Botão direito do mouse na região traçada, em seguida, configurá-lo como um fundo. Nota: Idealmente, as células que não estãot expressando os sensores devem ser utilizados como a região de fundo para ter em conta tanto a autofluorescência e a fluorescência de fundo detectado pela câmara. Na ausência de tais células estão disponíveis no campo de visão, pelo menos, uma região sem as células devem ser usados ​​para explicar a fluorescência de fundo. </li><li> Selecione o programa desejado em &quot;Select Function - executar programas&quot; opção. Alternar para o programa salva (veja o passo 2.3), e em seguida pressione ENTER no controlador de perfusão. Agora o programa é carregado, e bater qualquer tecla irá iniciar a perfusão. </li><li> Certifique-se de perfusão e da experiência de imagem começar ao mesmo tempo, clicando no botão &quot;Iniciar&quot; na janela de captura ao mesmo tempo que pressionar uma tecla no controlador de perfusão. Nota: Recomenda-se a registrar o ponto no tempo em que as soluções foram trocadas (o que pode ser feito usando o &quot;notas&quot; de função, encontrados dentro do guia de aquisição). </li><li> Execute o mesmo protocolo de perfusão using células que expressam um sensor que está prevista para ser saturados ou não ligada sob a condição experimental. Nota: Aqui, FLIPQTV3.0_1.5μ, que é saturado com a condição experimental, é usado como um controlo, a Figura 6 Tais experiências de controlo são necessários para confirmar que a variação da eficiência de TERF é devido à alteração real no substrato e não. devido à mudança de outros parâmetros tais como pH celular. </li></ol> 3. Análise pós-experimento <ol><li> Examine se a amostra deriva ocorreu durante o experimento. Desenhe regiões de interesse (ROI) é sobre a imagem tirada em timepoint 0, em seguida, mova a barra deslizante na parte superior da janela de imagem e verifique se as células saem das ROIs em imagens tiradas no final do experimento. </li><li> Se sim, então use a função de rastreamento para corrigir a deriva, em primeiro lugar, a criação de máscaras em torno das células selecionando Mask - Segmento, em seguida, deslize a linha que especifica o ponto de corte para highlight as regiões que contêm as células. Acompanhe as regiões clicando Mask - rastreamento de partículas - rastreamento de partículas Basic. </li><li> Re-desenhar o ROI e região fundo quando necessário. </li><li> Exportar a intensidade média das ROI ao longo do curso da experiência. Clique Estatísticas - Exportação - Dados Razão / timelapse. </li><li> Quando a eficiência de FRET e quantificação da concentração do substrato não é necessário, traçar o curso de tempo da relação da intensidade (ex Dador Aceitador in, / Doadores Doadores ex in) como um proxy de a dinâmica do substrato. Para determinar a concentração citosólica, calcular o máximo e o mínimo de alterações proporção (isto é, na ausência de saturação e do substrato, respectivamente), Δr max - Δr min, por meio de regressão não-linear de Δratio (Δr) com a seguinte equação: Δr = [S] / (K d + [S]) x (Δr <sub&gt; max - Δr min) + Δr min onde [S] é a concentração do substrato no citosol. Usando os Δr max - mínimo de valores obtidos Δr, saturação (S) do sensor a uma dada Δr é calculado como S = (Δr - Δr min) / (Δr max - min Δr) S podem ainda ser convertidos em concentração de substrato [S] usando a seguinte equação: S = [S] / (K d + [S]) Nota: a intensidade da Acceptor ex Acceptor canal los deve ser também conspiraram para examinar se a condição experimental influenciado a fluorescência do receptor diretamente. </li><li> Quando um desvio da linha de base devido ao foto-branqueamento é observada, realizar uma correção de linha de base. Para fazer isso, traçar as intensidades de doador e receptor ao longo do tempo (Figura 5A). Em seguida, identificar os pontos temporais utilizadas para poe linha de base, de acordo com o atraso no sistema de perfusão e a actividade de transporte da célula em particular (Figura 5B). </li><li> Calcule um encaixe de polinômio que melhor descreve a linha de base. Em seguida, normalizar a intensidade em bruto de cada ponto de tempo para a linha de base (Figura 5C). Calcular a relação de intensidade (Donor ex Acceptor em, / Donor ex Donor em) do doador e receptor intensidades normalizadas. </li></ol>

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Não há nada a divulgar.

O sucesso dos experimentos com imagens depende de alguns fatores críticos. Um desses factores é a afinidade dos sensores utilizados, como discutido acima. Concentração absoluta do substrato no compartimento subcelular de interesse, no entanto, é muitas vezes desconhecida. Portanto, recomendamos tentar vários sensores com afinidades escalonados para encontrar o que funciona melhor sob a condição experimental desejado. Por exemplo, no nosso caso, as células COS7 transfectadas com sensores de glutamina com 1.5μ, 100μ, 2m, e 8m (Figura 3 e dados não mostrados). Outro fator importante é o nível de proteínas do sensor expressão. O nível de expressão é necessária para a detecção varia entre, as experiências, por exemplo, quando um evento de curta duração (por exemplo, o potencial de acção único) tem de ser observado um nível de expressão mais elevada poderá tornar-se necessário 19. Portanto, na maioria dos casos, o nível exigido tem de ser empirically determinada. Se o destino existe em concentrações muito baixas na célula, perturbação dos processos endógenos, devido ao esgotamento alvo pode se tornar um problema 20. Um ensaio independente para avaliar essa possibilidade, se disponível, é, portanto, desejável. Nas experiências apresentadas neste artigo, a expressão da proteína conduzido por promotor de CMV foi considerada suficiente. Em situações em que os promotores com actividades muito mais fracos precisam ser utilizados, os ajustes para aumentar a intensidade do sinal poderá tornar-se necessário. Por exemplo, um compromisso entre a intensidade do sinal e de foto-branqueamento durante a exposição precisa para ser atingido. Além de um tempo de exposição, como factores, tais como o brilho dos fluoróforos, a mudança de intensidade máxima do sensor, binning, e as sensibilidades de câmara CCD podem ser alteradas para melhorar a intensidade do sinal. Quando nenhuma alteração na proporção é observada sob a condição experimental, apesar de os dois critérios acima referidos são susceptíveis deser cumprida, é possível que a homeostase celular para o metabolito ou ião dada é suficientemente forte para mascarar a actividade de transporte (ver a secção de resultados). Em tais casos, as linhas de células com diferentes actividades bioquímicas, pode ser necessária como um fundo para detectar as actividades de transportador 10, 21. Embora estes sensores permitem controlar a dinâmica de concentração do substrato a uma resolução muito maior espaço-temporal do que os métodos à base de extracção, a determinação da concentração absoluta requer passos adicionais e considerações experimentais. Normalmente, a concentração do substrato é calculado no pressuposto de que a afinidade do sensor, geralmente calculadas por titulação da proteína purificada do sensor, é inalterado quando expressos na célula. A concentração é calculado através da seguinte ligação isotérmica único, [S] = K d x (r - r min) / (r &lt;/ Em&gt; max - r) [S] é a concentração de substrato, K d é a constante de dissociação determinada in vitro, r é a razão aceitador / dador observados num dado instante de tempo, r min é o rácio aceitador / dador quando os sensores estão na forma apo e rmax é a razão aceitador / dador quando todos os sensores são ligados ao substrato. Rmin e Rmax são influenciados por parâmetros tais como a concentração de sensores, configurações de imagem utilizados e a composição do milleu celular, e, portanto, necessitam de ser medidos in situ . Para determinar r valores mínimo e máximo de r, as condições experimentais, que permite a modificação da concentração de substrato intracelular torna-se necessário. Por exemplo, os ionóforos selectivos (por exemplo, ionomicina durante Ca 2 +) 22 ou um reagente de perfuração tal como digitonin 23 pode ser usado para equilibrar a concentração de substrato com a concentração intracelular externo. Uma das limitações do tipo de experiências demonstradas neste protocolo é a baixa taxa de transferência; a análise se limita a analisar um metabólito em um relativamente pequeno (&lt;10) número de células. Os avanços tecnológicos estão sendo feitos, no entanto, para superar tais limitações. Por exemplo, com o avanço na automatizado, no rastreio de alto conteúdo, é agora possível usar sensores geneticamente codificados em combinações com molécula pequena ou biblioteca de RNAi; As células que expressam um biossensor pode ser cultivada em um formato de alto rendimento (por exemplo, 96 - ou 384 cavidades), em seguida, os poços individuais podem ser tratados com produtos químicos ou siRNA e fotografada. Estas experiências permitem a identificação de construções de siRNA ou produtos químicos que perturbam o processo biológico que pode ser observada com o biossensor 24 25. Outra recente inclusão avanço emocionantedes o desenvolvimento de um fluxo de microfluidos resolvida no tempo citómetro, que permite a detecção de alto rendimento de FRET variação da eficiência a um nível celular 26. Tais avanços técnicos ajudará descobertas de novos fármacos e novos componentes em processos biológicos.

Devido ao notável progresso em tecnologias que permite o exame do transcriptoma e proteoma em um nível celular, que agora se tornou claro que a bioquímica eo fluxo resultante de metabólitos e íons são altamente celular do tipo específico. Por exemplo, no fígado dos mamíferos, a degradação da glutamina sequencial e síntese são realizadas simultaneamente por células periportais e células perivenosa respectivamente, alimentando de amónio para o ciclo da ureia no primeiro tipo de células, consumindo o excesso de amoníaco no último 1-3. Em alguns casos, a heterogeneidade bioquímica significativa é detectada até mesmo num único &quot;tipo de célula&quot; 4, 5. Em adição a esta especificidade espacial, os níveis de metabolitos celulares e iões são altamente dinâmico (por exemplo, moléculas de sinalização, tais como Ca 2 + e os nucleótidos cíclicos). Os padrões espaço-temporais de metabólitos e íons muitas vezes desempenham papéis críticos na transdução de sinal. MCOMPANHAMENTO dinâmica celular de metabólitos e íons, no entanto, representam desafio único. Em muitos casos, a alteração nas concentrações são rápida e transiente, exemplificada pelo caso de as moléculas de sinalização, tais como Ca 2 +, que se decompõe no ~ 20 ms em espinhas dendríticas 6. Além disso, a compartimentação das vias bioquímicas dentro e entre as células, torna difícil de quantificar a dinâmica de metabolitos e iões utilizando extracção e cromatografia em coluna / técnicas de espectrometria de massa. Sensores codificados geneticamente para moléculas biológicas são agora amplamente utilizados, devido à alta resolução espaço-temporal que permite ao pesquisador a estudar a dinâmica molecular de curta duração e / ou compartimentada (revisada em 7, 8). Estes sensores codificados geneticamente podem ser divididos em duas categorias; Os sensores baseados em intensidade e sensores ratiometic. Os sensores baseados intensidade consistem tipicamente de um domínio de ligação e um gripeproteína orescent (PQ), e a ligação ao domínio de ligação ao soluto muda a intensidade de fluorescência. Sensores Ratiometic, por outro lado, muitas vezes, beneficiar de Transferência de Energia de Ressonância Foster (FRET) entre dois PQ que funcionam como um par de FRET. Estes sensores consistem de um domínio de ligação e dois PQ, e a ligação de soluto induz a alteração na eficiência da TERF entre as duas PQ. Um grande número de sensores para os metabolitos e os iões biologicamente importantes foram desenvolvidos na década passada 8, 9. Um dos excitante possibilidade oferecida por tais sensores geneticamente codificados é a sua utilização na análise de alta-resolução dos processos de transporte de membrana, o que anteriormente não foi fácil de detectar, ao nível celular. Sensores geneticamente codificados facilitar a análise dos mecanismos de transporte, como a especificidade de substrato e dependência do pH 10, 11. Além disso, em combinação com os res genéticosONTES como a biblioteca de RNAi constrói para organismos modelo, agora é possível realizar pesquisas do genoma para processos de transporte inovadoras utilizando sensores codificados geneticamente. Com efeito, a utilização de microrganismos geneticamente codificado sensor de chumbo para a descoberta de transportadores anteriormente não caracterizadas em vários casos, 12, 13. Recentemente, o nosso laboratório tem desenvolvido uma série de sensores baseados em FRET para a glutamina. Demonstrámos que os níveis de glutamina celular pode ser visualizada utilizando tais sensores FRET glutamina 10. Estes sensores consistem de um dador FRET (mTFP1) inserido numa proteína de ligação a glutamina bacteriana glnH, e um aceitador FRET (Vénus) na extremidade C-terminais de glnH (Figura 1). FRET eficiência destes sensores diminuir após a ligação de glutamina, o que resulta na diminuição da relação da intensidade de aceitador / dador. Boa regulação de processos de transporte de glutamina é importante nos processos biológicos, tais como neurotransmissão 14, 15 e a manutenção do ciclo da ureia no fígado 1, 16, 17. Aqui nós mostramos a metodologia de análise de actividades de transporte com sensores Fret para glutamina, usando uma grande-campo microscópio de fluorescência set-up. O objectivo das experiências mostradas aqui são para detectar actividades de transportador numa única célula e para examinar a especificidade do substrato de um transportador transitoriamente expressa.

<table><tbody><tr><td>Inverted fluorescent microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81F-3-5</td><td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate.</td></tr><tr><td>Excitation filter (mTFP1)</td><td>Omega Optical</td><td>3RD450-460</td><td>Band width 450-460 nm</td></tr><tr><td>Excitation filter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET500/20</td><td>Band width 490-510 nm</td></tr><tr><td>Emission filter (mTFP1)</td><td>Chroma</td><td>HQ495/30m</td><td>Band width 475-505 nm</td></tr><tr><td>Emission filter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET535/30m</td><td>Band width 520-550 nm</td></tr><tr><td>Dichroic mirror (FRET channels)</td><td>Chroma</td><td>470dcxr</td><td>Long pass, 470 nm cut off</td></tr><tr><td>Dichroic mirror (YFP channel)</td><td>Chroma</td><td>89002bs</td><td>Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm</td></tr><tr><td>mCherry filter set</td><td>Chroma</td><td>49008</td><td>Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Olympus</td><td>U-LH100L-3-5</td><td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Qimaging</td><td>Rolera-MGi EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Apochromatic fluorescence objective</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion system, ValveBank II</td><td>AutoMate Scientific</td><td>[01-08]</td><td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td></tr><tr><td>Laminar-flow chambers</td><td>C&amp;amp;L Instruments</td><td>VC-MPC-TW</td><td>Other larminar-flow chambers would also work.</td></tr><tr><td>Chambered slide</td><td>Lab-Tek</td><td>154534</td><td>For open-chamber experiments</td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Thermo Scientific</td><td>74-046-12131</td><td>For open-chamber experiments</td></tr><tr><td>Software supporting ratiometric measurements</td><td>Intellegenent Imaging Innovation</td><td>Slidebook 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow biosafety cabinet</td><td>ESCO</td><td>LA-3A2</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-255-25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s MEM (DMEM)</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic calf serum</td><td>Hyclone</td><td>SH3008703</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td>Used with Lipofectamine 2000</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine solution</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>25 mm circular glass cover slips</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-545-102</td><td>In case VC-MPC-TW is used</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Other transfection reagents can also be used.</td></tr><tr><td>Solution A (Hank&#039;s buffer)</td><td></td><td></td><td>9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td></tr><tr><td>Solution B</td><td></td><td></td><td>Solution A + 0.04 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution C</td><td></td><td></td><td>Solution A + 0.2 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution D</td><td></td><td></td><td>Solution A + 1 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution E</td><td></td><td></td><td>Solution A + 5 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution F</td><td></td><td></td><td>Solution A + 5 mM Ala</td></tr></tbody></table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

Sensores geneticamente codificados permitir o monitoramento em tempo real de moléculas biológicas em uma resolução subcelular. Uma enorme variedade de tais sensores para moléculas biológicas tornou-se disponível nos últimos 15 anos, algumas das quais se tornaram ferramentas indispensáveis, que são utilizados rotineiramente em muitos laboratórios. Uma das aplicações interessantes de sensores geneticamente codificados é a utilização destes sensores para investigar os processos de transporte celular. Propriedades de transportadores, tais como a cinética e especificidades de substrato pode ser investigada a um nível celular, oferecendo possibilidades para análises específicas do tipo de célula de actividades de transporte. Neste artigo, vamos demonstrar como a dinâmica do transportador pode ser observado usando sensor de glutamina geneticamente codificado como um exemplo. O delineamento experimental, os detalhes técnicos das configurações experimentais, e considerações para análises pós-experimentais serão discutidos.

Experiências típicas de curso-tempo estão representados na Figura 2. Nestas experiências, FRET sensores de glutamina com afinidades de 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, Figura 2A e 2B) e 100 uM (FlipQTV3.0_100 μ C e D) foram co-expressos com uma aplicabilidade ASCT2 permutador de aminoácido 18 em células COS7 10. Influxo de glutamina é detectado como uma alteração em razões de intensidade de fluorescência entre o doador (mTFP1) e o receptor (Vénus) (Figura 2A e 2C). O efluxo de glutamina na presença de um outro substrato (Ala) é também claramente demonstrado nestas experiências. Com ambos os sensores, intensidades fluorescentes normalizadas mudar mutuamente (isto é, a intensidade do dador passa-se como a intensidade aceitador vai para baixo, Figura 2B e 2D), na presença de substrato, o que sugere que a mudança de relação observadas são de facto, devido to a mudança na eficiência de FRET. Estas experiências mostram que as concentrações de glutamina nestas células flutuar muito dinamicamente sob a condição experimental; a partir da faixa de sensor de detecção de 100 uM para a concentração próxima da saturação para o sensor 8 mM. Especificidades de substrato de transportadores também podem ser examinadas por meio de sensores, demonstrado na Figura 3. Nestas experiências, as células foram pré-carregadas com glutamina, e, em seguida, vários aminoácidos foram adicionados ao perfusato extracelular para examinar se os aminoácidos podem induzir o efluxo de glutamina. Como esperado, substratos ASCT2 (Ala, Ser, Cys, Thr, D-serina) induzida efluxo de glutamina (Fig. 3A), enquanto que os aminoácidos não-substrato (Pro, His, Lys) não (Fig. 3B), corroborando com Estudos anteriores 18. Normalmente, a especificidade do substrato é medida por ensaios de competição, usando um substrato marcado com isótopos de rádio misturado com substrato competir, O que é bastante trabalhoso e requer uma população de células que estão uniformemente expressando o transportador a ser estudado. Imageamento óptico exemplificado aqui oferece uma abordagem alternativa. Quando não há mudanças de eficiência FRET são observados após a adição do substrato, várias razões podem ser considerados. Uma razão possível é a baixa capacidade de absorção para o substrato a ser testado e / ou altas actividades de enzimas que mantêm a concentração nas células. Por exemplo, a alteração da concentração de glutamina foi mínima em células COS7 que não expressam ASCT2 transportador sob a condição testada, mesmo que esta linha de células pode crescer claramente nos meios de comunicação, em que a glutamina na fonte de azoto principal (Figura 4). Além disso, se a afinidade do sensor é demasiado elevado ou demasiado baixo quando comparado com a concentração intracelular, a maior parte das proteínas do sensor permanecerá constitutivamente ligado ou não ligado, respectivamente; portanto, nenhuma alteração FRET eficiência vai ser detected. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Configuração de um sensor de FRET glutamina. (A) Open (ciano) e fechada (amarelo) conformação de glnH, ligação glutamina proteína de E.coli. A posição em que se insere mTFP1 é marcado em magenta. (B) representações esquemáticas de sensores FLIPQTV_3.0. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Medidas in vivo utilizando glutamina-FLIPQ TV3.0_8m e sensores 100μ. (A) O rácio venus/mTFP1 de células COS7 que co-expressam o sensor FLIPQ-TV3.0_8m e ASCT2-mCherry. mCherry tag foi utilizado para identificar as células que expressam o transporteer, sem interferir nos canais de emissão mTFP1 ou Vênus. As células foram perfundidos com tampão de HEPES-tamponado de Hank (pH 7,35). Timepoints quando glutamina extracelular (vermelho) e alanina (azul) foi adicionado ao meio de perfusão são indicados como caixas acima do gráfico. As linhas a cheio e tracejadas representam duas células individuais medidos na mesma experiência. (B) As intensidades de dador (mTFP1) e aceitadores (Vénus) canais na experiência mostrada em (A). Os valores foram corrigidos para a fotodegradação e normalizadas para a linha de base. (C) e (D) Uma experiência semelhante à de (A) e (B), realizada com células COS7 que expressam o sensor FLIPQ-TV3.0_100μ. (Figura modificado a partir de 10). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Eliminação de glutamina celular ttravés do transportador ASCT2 na presença de aminoácidos externos, visualizado utilizando o sensor FLIPQ-TV3.0_8m. (A) citosólico glutamina é exportada pela adição de Ala extracelular, Ser, Cys, Thr, e D-ser. Timepoints quando glutamina extracelular (caixas vermelhas) ou outros aminoácidos (caixas azuis) foram adicionados aos meios de comunicação de perfusão são indicados como caixas acima do gráfico. (B) Adição de Pro, Lys, Suas (caixas-pretas) não altera a concentração de glutamina citosólica , ao passo que a adição de Ala (caixas azuis) promove a exportação de glutamina. As linhas contínuas e tracejadas representam duas células individuais medidos no mesmo experimento. Todos os aminoácidos foram adicionados a cinco concentrações externas mM. (Figura foi originalmente publicado em 10). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Venus/mTFP1 A proporção de células COS7 expressing sensor de FLIPQ-TV3.0_8m (A) e do sensor 100μ (B). As células foram perfundidos com tampão de Hank tamponada com HEPES. Timepoints quando glutamina extracelular (5 mM) foi adicionada ao meio de perfusão são indicados como caixas vermelhas acima do gráfico. As linhas contínuas e tracejadas representam duas células individuais medidos no mesmo experimento. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Corrigindo para a fotodegradação. (A) intensidades brutos de duas células representadas na Figura 2A e 2C. (B) Datapoints que foram selecionados para o cálculo das linhas de base. As curvas de ajuste polinomial são mostrados na figura. (C) As intensidades de canais mostradas em A, normalizada contra a linha de base calculada na B. O conjunto de dados utilizado nesta figura é identical à mostrada na Figura 2A e 2C. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Medidas in vivo utilizando o sensor de glutamina FLIPQ-TV3.0_1.5m. (A) O rácio venus/mTFP1 de células COS7 que co-expressam o sensor FLIPQ-TV3.0_1.5m e ASCT2-mCherry. mCherry tag foi utilizado para identificar as células que expressam o transportador sem interferir os canais de emissão mTFP1 ou Vénus. As células foram perfundidos com tampão de HEPES-tamponado de Hank (pH 7,35). Timepoints quando glutamina extracelular (vermelho) e alanina (azul) foi adicionado ao meio de perfusão são indicados como caixas acima do gráfico. As linhas contínuas e tracejadas representam duas células individuais medidos no mesmo experimento. (B) As intensidades de doador (mTFP1) e receptor de canais (Vênus)na experiência mostrada em (A). Os valores foram corrigidos para a fotodegradação e normalizada para a linha de base. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="474"><tbody><tr><td> Tempo (min) </td><td> Solução A </td><td> Solução B </td><td> Solução C </td><td> Solução D </td><td> Solução E </td><td> Solução F </td></tr><tr><td> 0 </td><td> válvula em </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> válvula off </td><td> válvula em </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> válvula em </td><td> válvula off </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> válvula off </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> válvula em </td></tr><tr><td> 8 </td><td> válvula em </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> válvula off </td></tr&gt; <tr><td> 10 </td><td> válvula off </td><td></td><td> válvula em </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> válvula em </td><td></td><td> válvula off </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14 </td><td> válvula off </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> válvula em </td></tr><tr><td> 16 </td><td> válvula em </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> válvula off </td></tr><tr><td> 18 </td><td> válvula off </td><td></td><td></td><td> válvula em </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20 </td><td> válvula em </td><td></td><td></td><td> válvula off </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 22 </td><td> válvula off </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> válvula em </td></tr><tr><td> 24 </td><td> válvula em </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> válvula off </td></tr&gt; <tr><td> 26 </td><td> válvula off </td><td></td><td></td><td></td><td> válvula em </td><td></td></tr><tr><td> 28 </td><td> válvula em </td><td></td><td></td><td></td><td> válvula off </td><td></td></tr><tr><td> 30 </td><td> válvula off </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> válvula em </td></tr><tr><td> 32 </td><td> válvula em </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> válvula off </td></tr><tr><td> 34 </td><td> válvula off </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> . Tabela 1 Exemplo do protocolo de perfusão utilizado nesta experiência Solução A:. 9,7 g de sal de Hank (H1387), 0,35 g de NaHCO3, 5,96 g de HEPES a 1 L pH ajustado para 7,35 com NaOH Solução B:. Solução A + 0,04 mM Gln Solução C:.. Solução A + Gln 0,2 mM Solutião D:. Solução A + Gln 1 mM Solução E:. Solução A + 5 mM de Gln Solução F: Solução A + 5 mM Ala

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Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Este artigo irá demonstrar como monitorar a dinâmica de glutamina em células vivas usando FRET. Sensores geneticamente codificados permitir o monitoramento em tempo real de moléculas biológicas em uma resolução subcelular. O delineamento experimental, os detalhes técnicos das configurações experimentais, e considerações para análises pós-experimentais serão discutidos para sensores de glutamina codificados geneticamente.

Glutamina Flux imagem usando sensores codificados geneticamente

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K visualizações.  Virginia Tech.  Este artigo irá demonstrar como monitorar a dinâmica de glutamina em células vivas usando FRET. Sensores geneticamente codificados permitir o monitoramento em tempo real de moléculas biológicas em uma resolução subcelular. O delineamento experimental, os detalhes técnicos das configurações experimentais, e considerações para análises pós-experimentais serão discutidos para sensores de glutamina codificados geneticamente. 

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Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

Abordagens para avaliação de estresse oxidativo toxicológico usando sensores Fluorogenic geneticamente codificado de imagem

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Pesquisa do câncer

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

FIBS habilitado Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Bioengenharia

Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental transitions in plants. Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) is the first F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)-based biosensor that allows monitoring of cellular GA levels in vivo. By measuring a fluorescence emission ratio of nuclear localized-GPS1 (nlsGPS1), spatiotemporal mapping of endogenously and exogenously supplied GA gradients in different tissue types is feasible at a cellular scale. This protocol will describe how to image nlsGPS1 emission ratios in three example experiments: steady-state, before-and-after exogenous gibberellin A4 (GA4) treatments, and over a treatment time-course. We also provide methods to analyze nlsGPS1 emission ratios using both Fiji and a commercial three-dimensional (3-D) micrograph visualization and analysis software and explain the limitations and likely pitfalls of using nlsGPS1 to quantify gibberellin levels.

Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) is the first F&#246;rster resonance energy transfer-based biosensor for measuring the cellular levels of gibberellin phytohormones with a high spatiotemporal resolution. This protocol reports on the method to visualize and quantify cellular gibberellin levels using the genetically encoded nlsGPS1 biosensor in Arabidopsis hypocotyls and root tips.

Níveis de Giberelina celular visualização usando a energia de ressonância de Förster NlsGPS1 transferir Biosensor (FRET)

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental ...

Biologia do Desenvolvimento

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Medição quantitativa do GLUT4 translocação para a membrana plasmática por citometria de fluxo

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biologia

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Neurociência

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

Um ensaio de cálcio de alta produtividade-flux para estudar os receptores NMDA com sensibilidade de glicina/D-serina e glutamato

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical manifestations include weight loss, dyslipidemia, and hypermetabolism; however, it remains unclear how these relate to motor neuron degeneration. Using a Drosophila model of TDP-43 proteinopathy that recapitulates several features of ALS including cytoplasmic inclusions, locomotor dysfunction, and reduced lifespan, we recently identified broad ranging metabolic deficits. Among these, glycolysis was found to be upregulated and genetic interaction experiments provided evidence for a compensatory neuroprotective mechanism. Indeed, despite upregulation of phosphofructokinase, the rate limiting enzyme in glycolysis, an increase in glycolysis using dietary and genetic manipulations was shown to mitigate locomotor dysfunction and increased lifespan in fly models of TDP-43 proteinopathy. To further investigate the effect on TDP-43 proteinopathy on glycolytic flux in motor neurons, a previously reported genetically encoded, FRET-based sensor, FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, was used. This sensor is comprised of a bacterial glucose-sensing domain and cyan and yellow fluorescent proteins as the FRET pair. Upon glucose binding, the sensor undergoes a conformational change allowing FRET to occur. Using FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, glucose uptake was found to be significantly increased in motor neurons expressing TDP-43G298S, an ALS causing variant. Here, we show how to measure glucose uptake, ex vivo, in larval ventral nerve cord preparations expressing the glucose sensor FLII12Pglu-700&#181;&#948;6 in the context of TDP-43 proteinopathy. This approach can be used to measure glucose uptake and assess glycolytic flux in different cell types or in the context of various mutations causing ALS and related neurodegenerative disorders.

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Glucose uptake is increased in Drosophila motor neurons affected by TAR DNA binding protein (TDP-43) proteinopathy, as indicated by a FRET-based, genetically encoded glucose sensor.

Medição da captação de glicose em modelos de Drosophila de Proteinopatia TDP-43

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

Imagem ao vivo do Estado De Glutathione Mitocondrial Redox em Neurônios Primários usando um Indicador Ratiométrico

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.