Name: glutamine flux imaging using genetically encoded sensors
Uploaded: 2014-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH 1R21NS064412, NSF מענק 1,052,048 וJeffress זיכרון אמון מענק J-908.

1. לדוגמא הכנה הערה: במקרים רבים ניסויי זלוף לשטוף את חלק משמעותי של תאים, מה שיכול להיות בעיה מתסכלת. אמנם לא הכרחי עבור כל שורות תאים, משטחי זכוכית כיסוי ציפוי עם פולי-L-ליזין (להוסיף 1.0 ml/25 2 סנטימטר של פתרון 0.01% על פני השטח, דגירה&gt; 5 דקות, לשטוף פעמיים עם מים כיתה תרבית תאים, ויבשים ב ארון הבטיחות הביולוגי) משפר את הידבקות תא. כמו כן, להיות מודע לרמת הבטיחות הביולוגית (מנהלת הליגה) של הקו הסלולרי בשימוש, ופעל על פי נוהל העבודה הרגיל שאושר על ידי משרד בריאות ובטיחות הסביבתי המקומי. בניסוי זה, תאי cos7 שימשו עקב פעילות תחבורת גלוטמין אנדוגני נמוכה (ראה איור 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הזרע cos7 ב ~ confluency 70-80% בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) + 10% נסיוב עגל קוסמי ו100 U / ml פניצילין / סטרפטומיצין, או על coverslips זכוכית סטרילית 25 מ&quot;מ מונח בתרבות 6 היטבצלחת או שקופיות זכוכית תחתונה 8 היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 100% ל24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את מצע הגידול לDMEM +10% בסרום קוסמי עגל (ללא אנטיביוטיקה), על פי הפרוטוקול של היצרן. לגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בלחות 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.4 מ&quot;ג כל אחת של ה-DNA פלסמיד קידוד חיישן גלוטמין (pcDNA3.1, נשא חיישן FLIPQTV3.0 תחת CMV אמרגן 10) וASCT2 mCherry מתויג 10-50 סרום ללא מדיה מיליליטר (Opti-ממ) ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מגיב transfection 50 מיליליטר סרום ללא מדיה. לדגור על RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שני פתרונות המכילים DNA (שלב 1.3) ומגיב transfection (שלב 1.4) ו דגירה עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף את מגיב transfection על גבי התאים ומערבבים בעדינות על ידי נדנדה הקאמרית. דגירה של 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, להחליף הבינוני עד DMEM + 10% עגל סרום קוסמישל פניצילין / סטרפטומיצין (CCS) + 100 יחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם צילמו 48-72 לאחר transfection שעה. </li></ol> 2. ניסוי זלוף הערה: לתאי cos7 השתמשו בניסוי זה, תקשורת זלוף והקאמרי הוחזקו על RT וסביבת CO 2 ריכוז. עם זאת, יש להשתמש אם התאים בשימוש דורשים טמפרטורה גבוהה יותר ו-CO 2 שליטת ריכוז להישרדות, במה מיקרוסקופ מחוממת ו / או תא סביבתי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן AF חיץ זלוף (ראה רשימה של חומרים). צרף ברזים למיניהם ל50 מיליליטר מזרקים, לסגור את הברזים למינים ולאחר מכן למלא אותם עם פתרונות זלוף. פתח את ברזלים לתקופה קצרה כדי למלא את החלל בראש בברזלים עם למאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על 8 ערוצים, מערכת זלוף הכבידה להאכיל עם עיפרון זלוף, ולאחר מכן בחר באפשרות &quot;מצב ידני&quot; תחת אפשרות בחירת פונקציה. הנח מיכל פסולת בעיפרון זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידנילהפעיל את הנמלים על ידי לחיצה על המספרים המתאימים ולמלא את tubings באמצעות 10 מזרק מיליליטר המכיל מים, ולאחר מכן לסגור את הנמל. ברגע שהיציאות מלאות במים, לקבוע את המזרקים המכילים מאגרי AF ביציאה 1-6 של מערכת זלוף, ולאחר מכן פתח את הברזים למיניהם. לפתוח את היציאות שוב כדי להחליף את המים בצינורות עם החוצצים. קצב הזרימה צריך להיות סביב 0.8 מיליליטר / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על ביטול פעם אחת בבקר זלוף לחזור לתפריט &quot;בחר פונקציה&quot;. לעבור לאפשרות &quot;תכנית ערוך&quot;, ולאחר מכן להקליד את פרוטוקול זלוף מפורט בטבלה 1. שמרו את תכנית זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התאים מחוץ לחממה. שטוף פעמיים עם חיץ זלוף, ולאחר מכן קבע את התאים על הבמה. חבר את מערכת זלוף לתא. אם נעשה שימוש בתא פתוח, הוקם משאבה נוספת שמסירה את פתרון זלוף מהחדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת Slidebook. התחל שקופית חדשה. הערה:ההליך הבא הוא ספציפי לתוכנת Slidebook, אלא גם תוכנות אחרות כגון MetaFluor וNis-Element יכולות לשמש לסוג של הדמיה שתוארה כאן. באופן תיאורטי ניתן לבצע ניסויים באמצעות כל תוכנה המאפשרת הדמיה בזמן כמובן, וניתן לנתח רצפי התמונה שלאחר ניסוי באמצעות תוכנה כגון ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) או פיג&#39;י (http:/ / Fiji.sc / פיג&#39;י). עם זאת, תוכנה המאפשרת ניטור של יחס acceptor / תורם בזמן אמת היא שימושית מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר השקופיות על הבמה מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מצא תאי שיתוף מבטא את החיישן וASCT-mCherry באמצעות מערכות סינון מתאימות (ראה רשימה של חומרים) תחת פונקצית &quot;פוקוס&quot;. התאם רווח על ידי לחיצה על לשונית &quot;מצלמה&quot; ומחליק את פס השקף תחת &quot;רווח&quot;. כמו כן, להתאים את הגדרת מסנן צפיפות הניטרלית מתפריט הנפתח מסנן צפיפות ניטראלי. הערה: אם קוביית המסנן אינה כוללת מסנן עין, אין להשתמש בחלקי העין מאז שוראור עירור T-גל מזיק לעיניים. השתמש במסך המחשב כדי למצוא את התאים במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות של תאים with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (מסננים שצוינו ברשימה של חומרים). לחץ על &quot;לכידת תמונה&quot;, ולאחר מכן בחלון הרכישה, לציין את המסננים שהולכים להיות בשימוש. לחץ על לחצן &quot;בדיקה&quot; כדי להתאים את זמן חשיפה על ידי הקלדת זמן חשיפה הרצויה בתיבה ליד הגדרות מסננים. הערה: כל שלושה הערוצים צריכים להיות חשופים לאותו האורך. בעת כוונון הפרמטרים ההדמיה, לקחת את שינוי סריג יעילות הצפוי ולקפל להגדיל בחשבון: לדוגמא, אם את יעילות סריג צפויה לעלות פי 2 במהלך הניסוי, צריכים להיות מותאמים פרמטרים הדמיהכך שעוצמתם Acceptor לשעבר תורם במצב המנוחה צריכה להיות &lt;50% מהערך המקסימאלי שניתן להקליט על ידי המכשיר, כך שהערוץ שאינו הופך להיות רווי במהלך הניסוי. אות מהתאים שכותרתו צריכה להיות לפחות גבוהה יותר פי שלוש מזה שבאזור הרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור של עניין באמצעות כלי אזורים בתוכנה. לחלופין, ניתן להשתמש בתוכנת פונקציה כדי לבחור פיקסלים מעל עוצמה מסוימת, ולאחר מכן הוסבה לאזורים. כדי לעשות זאת, לחץ על מסיכה - מגזרי, ואז להעביר את סרגל הגלילה כדי להדגיש את האזורים הרצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;זמן לשגות&quot; בתיבת הסוג ללכוד, ולאחר מכן לציין את המרווח (10 שניות בניסוי הזה) ונקודות זמן לניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור באזור ללא כל תאי ניאון. אזור זה משמש לחיסור רקע. לחץ לחיצה ימנית באזור נמשך, ולאחר מכן להגדיר אותו כרקע. הערה: באופן אידיאלי, תאים שאיןיש להשתמש לא מבטאים את החיישנים כמו זו של אזור הרקע לחשבון עבור שני autofluorescence ותפרחת הרקע זוהתה על ידי המצלמה. אם אין תאים כאלה זמינים בשדה ראיה, יש להשתמש לפחות באזור ללא תאים כדי להסביר את הקרינה הרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התכנית הרצויה תחת &quot;בחר פונקציה - הפעלת תוכניות&quot; אפשרות. לעבור לתכנית הצילה (ראה שלב 2.3), ולאחר מכן פגע ENTER בבקר זלוף. עכשיו התכנית נטענת, ולהכות על מקש כלשהו יפעיל את זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא זלוף וניסוי ההדמיה להתחיל באותו הזמן על ידי לחיצה על כפתור &quot;התחל&quot; בחלון הלכידה באותו הזמן כמו לחיצה על מקש בבקר זלוף. הערה: מומלץ להקליט timepoint בי הפתרונות הוחלפו (זה יכול להיעשות באמצעות &quot;אורים&quot; פונקציה, נמצאים בתוך כרטיסיית הרכישה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את אותה USI פרוטוקול זלוףng תאים לבטא חיישן שצפוי להיות או רווי או לא מאוגד תחת תנאי הניסוי. הערה: כאן, FLIPQTV3.0_1.5μ, שהוא רווי בתנאי הניסוי, משמש כביקורת, איור 6 ניסויי שליטה כזו נחוצים כדי לוודא ששינוי סריג יעילות הוא כתוצאה מהשינוי בפועל במצע ולא. כתוצאה מהשינוי בפרמטרים אחרים כגון pH הסלולרי. </li></ol> 3. ניתוח שלאחר ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק אם להיסחף מדגם אירע במהלך הניסוי. צייר אזורים של העניין (ROI) זה על התמונה שצולמה בtimepoint 0, ולאחר מכן להעביר את סרגל הגלילה בחלק העליון של חלון ההדמיה ולבדוק אם התאים נפולת של ROIs בתמונות שצולמו מאוחר יותר בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כן, אז להשתמש בפונקצית המעקב כדי לתקן את הסחף על ידי ראשון, יצירת מסכות סביב התאים על ידי בחירת מסכה - מגזרי, ולאחר מכן להחליק את השורה שמציינת את הפסקת לגדולותhlight האזורים המכילים תאים. עקוב אחר האזורים על ידי לחיצה מסכה - מעקב אחר חלקיקים - מעקב אחר חלקיקי יסוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש לצייר ROIs ואזור רקע בעת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את העצמה הממוצעת של ROIs במהלך הניסוי. לחץ סטטיסטיקה - יצוא - נתוני היחס / timelapse. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר סריג יעילות וכימות של ריכוז מצע אינה הכרחיים, עלילה כמובן יחס העצמה (Acceptor לשעבר תורם, / em התורם לשעבר תורם) כשלוח של הדינמיקה של המצע הזמן. כדי לקבוע את ריכוז cytosolic, לחשב את מקסימלי ומינימאלי שינוי יחס (כלומר, שבירווה והעדר המצע, בהתאמה), Δr מקסימום - דקות Δr, על ידי רגרסיה לא לינארית של Δratio (Δr) עם המשוואה הבאה: x Δr = [S] / (d + K [S]) (Δr <sub&gt; מקסימום - דקות Δr) + Δr דקות שבו [S] הוא ריכוז המצע בcytosol. שימוש Δr מקסימום - ערכי Δr דקות הושגו, הרוויה (S) של החיישן בΔr נתון מחושב כ S = (Δr - Δr דקות) / (Δr מקסימום - דקות Δr) S נוסף ניתן להמיר את ריכוז המצע [S] באמצעות המשוואה הבאה: S = [S] / (d + K [S]) הערה: עוצמת ערוץ em Acceptor לשעבר Acceptor צריכה להיות גם זמם לבחון אם תנאי הניסוי השפיעו על הקרינה של acceptor ישירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר להיסחף בסיסי בשל צילום הלבנה הוא ציין, לבצע תיקון בסיס. כדי לעשות זאת, עלילה העוצמות של תורם acceptor לאורך זמן (איור 5 א). ואז לזהות את הנקודות הזמן משמש להבסיס דואר, על פי העיכוב במערכת זלוף ופעילות ההובלה של תא המסוים (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הולם polynominal שמגדירה את נקודת ההתחלה. לאחר מכן, לנרמל את עוצמת הגלם מtimepoint לבסיס (איור 5 ג). לחשב את יחס העצמה (Acceptor לשעבר תורם, / em התורם לשעבר תורם) מעוצמות תורם acceptor המנורמלת. </li></ol>

<ol>
	<li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hepatic+ammonia+metabolism:+the+intercellular+glutamine+cycle.">Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle.</a> Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).</li><li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).</li><li>Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Nutrition. 18, 301-303 (2002).</li><li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).</li><li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Seq:+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA+sequencing+method,+reveals+non-genetic+gene-expression+heterogeneity.">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14, R31 (2013).</li><li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+Ca(2+)+ions+in+dendritic+spines.">The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+with+fluorescent+biosensors.">Quantitative imaging with fluorescent biosensors.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).</li><li>Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encodable+fluorescent+biosensors+for+tracking+signaling+dynamics+in+living+cells.">Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells.</a> Chemical reviews. , 111-3666 (2011).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).</li><li>Gruenwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+glutamine+transporter+activities+in+living+cells+using+genetically+encoded+glutamine+sensors.">Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors.</a> PLoS One. 7, e38591 (2012).</li><li>Chaudhuri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protonophore-+and+pH-insensitive+glucose+and+sucrose+accumulation+detected+by+FRET+nanosensors+in+Arabidopsis+root+tips.">Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips.</a> Plant Journal. 56, 948-962 (2008).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li><li>Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+Screen+Identifies+Letm1+as+a+Mitochondrial+Ca2+/H++Antiporter.">Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter.</a> Science. , 326-147 (2009).</li><li>Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+cell+glutamine+synthetase+rapidly+impairs+the+retinal+response+to+light.">Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light.</a> Glia. 30, 64-73 (2000).</li><li>Rothstein, J. D., Tabakoff, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Striatal+Glutamate+Release+after+Glutamine-Synthetase+Inhibition.">Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition.</a> J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).</li><li>Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+amino+acid+transporter+SNAT3+by+insulin+in+hepatocytes.">Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes.</a> J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).</li><li>Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serine/threonine+kinases+SGK1,+3+and+PKB+stimulate+the+amino+acid+transporter+ASCT2.">The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2.</a> Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).</li><li>Br&#246;er, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+astroglial+ASCT2+amino+acid+transporter+as+a+mediator+of+glutamine+efflux.">The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux.</a> J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).</li><li>Wallace, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2++sensor.">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li><li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors:+what+are+we+really+measuring.">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li><li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells.">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712 (2013).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer:+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator.">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).</li><li>Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity:+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening.">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114 (2011).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li><li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells.">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li></ol>

אין מה לחשוף.

ההצלחה של ניסויי הדמיה תלויה בגורמים קריטיים כמה. אחד הגורמים הללו הוא הזיקה של חיישנים המשמשת, כפי שפורט לעיל. ריכוז מוחלט של המצע בתא subcellular של עניין, עם זאת, הוא לעתים קרובות לא ידוע. לכן אנו ממליצים לנסות חיישנים מרובים עם זיקות מעד למצוא אחד שפועל תחת תנאי ניסוי הרצויים הטוב ביותר. לדוגמא, במקרה שלנו אנחנו transfected תאי cos7 עם חיישני גלוטמין עם 1.5μ, 100μ, 2 מ &#39;, ו8m (איור 3 ומידע לא מוצגים). גורם חשוב נוסף הוא רמת הביטוי של חלבוני חיישן. רמת הביטוי הנדרש לזיהוי משתנה בין, ניסויים, לדוגמא, כאשר אירוע קצר מועד (למשל פוטנציאל פעולה יחיד,) צריכה להיות שנצפה רמת ביטוי גבוהה יותר יכולה להיות 19 צורך. לכן, ברוב המקרים, לרמה הנדרשת צריכה להיות empirically נקבע. אם היעד קיים בריכוז נמוך מאוד בתא, הפרעות של תהליכי אנדוגני בשל למקד דלדול יכולות להיות בעיה 20. Assay עצמאי להעריך אפשרות כזו, אם קיימת, ולכן רצוי. בניסויים שמוצגים במאמר זה, ביטוי חלבון מונע על ידי אמרגן CMV נמצא להיות מספק. במצבים שבם יזמים עם פעילויות הרבה יותר חלשות צריכים להיות בשימוש, התאמות כדי להגדיל את עוצמות האות עשויות להיות נחוצות. לדוגמא, פשרה בין עוצמת האות וצילום הלבנה במהלך החשיפה צריכה להגיע. בנוסף לזמן חשיפה ארוך יותר, ניתן לשנות גורמים כדוגמת הבהירות של fluorophores, השינוי בעוצמה מקסימאלי של החיישן, binning, והרגישויות של מצלמת CCD כדי לשפר את עוצמת האות. כאשר לא חלה שינוי יחס הוא ציין תחת תנאי הניסוי למרות ששני הקריטריונים הנ&quot;ל צפוייםלהיות נפגש, זה אפשרי, כי הומאוסטזיס הסלולרי למטבוליט או יון שניתן הוא חזק מספיק כדי להסוות את פעילות התחבורה (ראה סעיף התוצאה). במקרים כאלה, שורות תאים עם פעילויות ביוכימיות שונות ייתכן שתידרשנה כרקע כדי לזהות פעולות טרנספורטר 10, 21. בעוד חיישנים אלה יאפשר אחד כדי לעקוב אחר דינמיקת ריכוז של המצע ברזולוציה spatiotemporal גבוהה הרבה יותר מהשיטות המבוסס על מיצוי, קביעת הריכוז מוחלט דורשת עוד צעדים ושיקולים ניסיוניים. בדרך כלל, ריכוז מצע מחושב בהנחה שהזיקה של החיישן, מחושבת בדרך כלל על ידי titrating חלבון חיישן מטוהר, היא ללא שינוי כאשר באו לידי ביטוי בתא. הריכוז מחושב באמצעות איזותרמה הקישור היחיד הבא, [S] = x ד K (r - r דקות) / (r &lt;/ Em&gt; מקסימום - r) [S] הוא ריכוז המצע, ד K הוא הניתוק קבוע שנקבע במבחנה, r הוא יחס acceptor / התורם נצפה בtimepoint נתון, r דקות היא יחס acceptor / תורם כאשר חיישנים הם בצורת apo, ומקסימום r הוא יחס acceptor / תורם כאשר כל החיישנים חייבים המצע. דקות R ומקסימום r מושפעים מפרמטרים כגון ריכוז של חיישנים, הגדרות הדמיה המשמשות ואת ההרכב של milleu הסלולרי, ולכן צריך להימדד באתר . כדי לקבוע דקות r וערכי מקסימום r, תנאי ניסוי המאפשר שינוי של ריכוז מצע תאיים הופך להכרחי. לדוגמא, יונופורים סלקטיבית (למשל, ionomycin לCa 2 +) 22 או מגיב ניקוב כגון דיgitonin 23 יכול לשמש כדי לאזן ריכוז מצע תאיים עם הריכוז החיצוני. אחת המגבלות בסוג של ניסויים הוכיחו בפרוטוקול זה הוא התפוקה הנמוכה; הניתוח מוגבל בניתוח מטבוליט אחד במספר (&lt;10) קטן יחסית של תאים. התקדמות טכנולוגית נעשות, עם זאת, כדי להתגבר על מגבלות כאלה. לדוגמא, עם ההתקדמות באוטומטית, גבוה הקרנת תוכן, ניתן כיום להשתמש בחיישני מקודדים גנטי בשילובים עם מולקולה קטנה או ספריית RNAi; תאים המבטאים biosensor ניתן לגדל בפורמט תפוקה גבוהה (למשל, 96 - או 384 גם), ואז ניתן לטפל בבארות בודדות עם או siRNA או כימיקלים וצלמו. ניסויים כאלה לאפשר זיהוי של מבני siRNA או כימיקלים המשבשים את התהליך הביולוגי שיכול להיות שנצפה על ידי biosensor 24 25. אחר inclu מראש האחרון המרגשdes הפיתוח של זרימת זמן נפתר microfluidic cytometer, המאפשרת זיהוי תפוקה גבוהה של שינוי סריג יעילות ברמה תאית 26. התקדמות טכנית כגון תסייע תגליות של מועמדי תרופה חדשים ורכיבים חדשים בתהליכים ביולוגיים.

בשל התקדמות מרשימה בטכנולוגיות המאפשרת בדיקה של transcriptome וproteome ברמה תאית, זה הפך כעת ברור כי ביוכימיה והשטף של מטבוליטים ויונים וכתוצאה מכך הם מאוד תאים מסוג ספציפי. לדוגמא, בכבד של היונקים, השפלה גלוטמין רציפה וסינתזה מתבצעות בו זמנית על ידי תאי periportal ותאי perivenous בהתאמה, האכלת אמוניום למעגל האוריאה בסוג התא לשעבר תוך צריכת אמוניה עודפת ב1-3 האחרון. במקרים מסוימים, את ההטרוגניות ביוכימיים משמעותית הוא זוהה גם ב&quot; סוג תא &quot;יחיד 4, 5. בנוסף לסגולי מרחבית כגון, הרמות תאיות של מטבוליטים ויונים הן מאוד דינמיות (למשל, מולקולות איתות כגון Ca 2 + ונוקלאוטידים מחזוריים). דפוסי spatiotemporal של מטבוליטים ויונים לעתים קרובות משחקים תפקיד קריטי בהעברת אותות. Monitoring דינמיקה הסלולר של מטבוליטים ויונים, לעומת זאת, מהווה אתגר ייחודי. במקרים רבים השינוי בריכוזים הם מהירים וחולפים, שהודגם על ידי המקרה של מולקולות איתות כגון Ca 2 +, אשר דועך בתוך ~ 20 אלפיות שניים בקוצים הדנדריטים 6. בנוסף, מידור של מסלולים ביוכימיים בתוך ובין התאים עושה את זה קשה לכמת את הדינמיקה של מטבוליטים ויונים באמצעות מיצוי וכרומטוגרפיה עמודה / טכניקות ספקטרומטריית מסה. חיישני מקודד גנטי למולקולות ביולוגיות המשמשים כיום באופן נרחב בשל הרזולוציה spatiotemporal הגבוהה המאפשרת הנסיין ללמוד דינמיקה קצרת מועד ו / או ממודרת מולקולרית (הנסקרת ב 7, 8). בערך ניתן לחלק את חיישני מקודדים גנטי אלה לשתי קטגוריות; חיישנים מבוססי עוצמה וחיישני ratiometic. חיישנים מבוססי עוצמה בדרך כלל מורכבים של תחום מחייב ושפעתחלבון orescent (FPS), והמומס מחייב לתחום המחייב משנים את עוצמת הניאון. חיישני Ratiometic, לעומת זאת, מנצלים לעתים קרובות העברת פוסטר התהודה אנרגיה (סריג) בין שני FPS המתפקדים כזוג סריג. חיישנים אלה כוללים תחום מחייב ושתי תמונות בשניה, והמומס המחייב גורם שינוי בסריג יעילות בין שתי תמונות בשניה. מספר גדול של חיישנים למטבוליטים ויונים חשובים מבחינה ביולוגית פותחו בעשור האחרון 8, 9. אחת האפשרות מרגשת המוצע על ידי חיישני מקודדים גנטי כזה הוא השימוש שלהם בניתוח ברזולוציה הגבוהה של תהליכי הובלת קרום, שלא היה קל בעבר כדי לזהות ברמה התאית. חיישני מקודדים גנטי להקל על הניתוח של מנגנוני הובלה כגון סגוליות מצע וpH תלות 10, 11. יתר על כן, בשילוב עם מיל הגנטיources כגון הספרייה של RNAi בונה לאורגניזמים מודל, ניתן כיום לבצע חיפושי הגנום לתהליכי הובלת רומן באמצעות חיישנים מקודדים גנטי. ואכן, שימוש בעופרת חיישן מקודד גנטי לגילוי של מובילי uncharacterized בעבר במקרים רבים 12, 13. לאחרונה, המעבדה שלנו פיתחה סדרה של חיישן מבוסס סריג לגלוטמין. אנחנו הוכיחו כי רמות גלוטמין הסלולרי ניתן דמיינו באמצעות חיישני גלוטמין סריג כזה 10. חיישנים אלה כוללים תורם סריג (mTFP1) מוכנס לתוך חלבון גלוטמין מחייב חיידקי glnH, וacceptor סריג (ונוס) בC-Termini של glnH (איור 1). סריג יעילות של חיישנים אלה להקטין על הכריכה של גלוטמין, וכתוצאה מכך הירידה של יחס עוצמת acceptor / תורם. ויסות עדינה של תהליכי הובלת גלוטמין היא חשובה בתהליכים ביולוגיים כגון neurotransm14 ission, 15 והתחזוקה של מחזור אוריאה בכבד 1, 16, 17. כאן אנו מראים את המתודולוגיה של ניתוח פעילות תחבורה עם חיישני סריג לגלוטמין, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום ההגדרה. המטרה של ניסויים המוצגים כאן הן לזהות פעילויות טרנספורטר בתא בודד ולבחון את הספציפיות מצע של טרנספורטר הביע transiently.

<table><tbody><tr><td>Inverted fluorescent microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81F-3-5</td><td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate.</td></tr><tr><td>Excitation filter (mTFP1)</td><td>Omega Optical</td><td>3RD450-460</td><td>Band width 450-460 nm</td></tr><tr><td>Excitation filter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET500/20</td><td>Band width 490-510 nm</td></tr><tr><td>Emission filter (mTFP1)</td><td>Chroma</td><td>HQ495/30m</td><td>Band width 475-505 nm</td></tr><tr><td>Emission filter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET535/30m</td><td>Band width 520-550 nm</td></tr><tr><td>Dichroic mirror (FRET channels)</td><td>Chroma</td><td>470dcxr</td><td>Long pass, 470 nm cut off</td></tr><tr><td>Dichroic mirror (YFP channel)</td><td>Chroma</td><td>89002bs</td><td>Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm</td></tr><tr><td>mCherry filter set</td><td>Chroma</td><td>49008</td><td>Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Olympus</td><td>U-LH100L-3-5</td><td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Qimaging</td><td>Rolera-MGi EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Apochromatic fluorescence objective</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion system, ValveBank II</td><td>AutoMate Scientific</td><td>[01-08]</td><td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td></tr><tr><td>Laminar-flow chambers</td><td>C&amp;amp;L Instruments</td><td>VC-MPC-TW</td><td>Other larminar-flow chambers would also work.</td></tr><tr><td>Chambered slide</td><td>Lab-Tek</td><td>154534</td><td>For open-chamber experiments</td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Thermo Scientific</td><td>74-046-12131</td><td>For open-chamber experiments</td></tr><tr><td>Software supporting ratiometric measurements</td><td>Intellegenent Imaging Innovation</td><td>Slidebook 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow biosafety cabinet</td><td>ESCO</td><td>LA-3A2</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-255-25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s MEM (DMEM)</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic calf serum</td><td>Hyclone</td><td>SH3008703</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td>Used with Lipofectamine 2000</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine solution</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>25 mm circular glass cover slips</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-545-102</td><td>In case VC-MPC-TW is used</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Other transfection reagents can also be used.</td></tr><tr><td>Solution A (Hank&#039;s buffer)</td><td></td><td></td><td>9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td></tr><tr><td>Solution B</td><td></td><td></td><td>Solution A + 0.04 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution C</td><td></td><td></td><td>Solution A + 0.2 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution D</td><td></td><td></td><td>Solution A + 1 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution E</td><td></td><td></td><td>Solution A + 5 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution F</td><td></td><td></td><td>Solution A + 5 mM Ala</td></tr></tbody></table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

חיישני מקודדים גנטי מאפשרים ניטור בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות ברזולוציה subcellular. מגוון עצום של חיישנים כאלה למולקולות ביולוגיות הפך זמין בשנים האחרונות 15, שחלקם הפך לכלי חיוני המשמשים באופן שיגרתי במעבדות רבות. אחד היישומים המרגשים של חיישני מקודדים גנטי הוא השימוש בחיישנים אלה בחקירת תהליכי הובלה תאיות. מאפיינים של מובילים כגון קינטיקה וספציפיות מצע יכולים להיחקר ברמה תאית, המספקים אפשרויות לניתוחי תאים מסוג מסוימים של פעילות הובלה. במאמר זה, נדגים כיצד ניתן לצפות דינמיקת טרנספורטר באמצעות חיישן גלוטמין מקודד גנטי לדוגמא ירושלים. עיצוב ניסיוני, פרטים טכניים של ההגדרות הניסיוניות, ושיקולים לניתוחים שלאחר ניסוי יידונו.

ניסויים בזמן קורס טיפוסיים מיוצגים באיור 2. בניסויים אלו, סריג חיישני גלוטמין עם זיקות של 8 מ&quot;מ (FLIPQTV3.0_8m, איור 2 א ו -2) ו100 מיקרומטר (FlipQTV3.0_100 μ C ו-D) היו שיתוף הביע עם ASCT2 חובה מחליף חומצת אמין 18 בתאי cos7 10. זרם של גלוטמין הוא זוהה כשינוי ביחסי עוצמת הקרינה בין התורם (mTFP1) וacceptor (ונוס) (איור 2 א ו 2 ג). בזרימת של גלוטמין בנוכחות מצע אחר (עלא) הוא הוכיח גם באופן ברור בניסויים אלה. עם שני החיישנים, עוצמות ניאון מנורמלות לשנות הדדית (כלומר, עוצמת התורם עולה כעוצמת acceptor יורדת, איור 2 ו 2 ד) בנוכחותו של מצע, אשר מצביעות על כך ששינוי היחס שנצפה הוא אכן לא בשלo השינוי בסריג יעילות. ניסויים אלה מראים כי ריכוזי גלוטמין בתאים אלה משתנים באופן דינמי מאוד תחת תנאי הניסוי; מהטווח הגילוי של 100 חיישן מיקרומטר לריכוז קרוב לרוויה במשך 8 חיישן מ&quot;מ. ספציפיות מצע של מובילים גם ניתן לבחון באמצעות חיישנים, הפגינו באיור 3. בניסויים אלו התאים היו טעונים מראש עם גלוטמין, ולאחר מכן חומצות אמינו שונות נוספו לperfusate תאי לבחון האם חומצות אמינו אלה יכולים לגרום לזרימת גלוטמין. כצפוי, מצעי ASCT2 (עלא, Ser, Cys, Thr, D-סרין) בזרימת מושרה גלוטמין (איור 3), ואילו חומצות אמינו שאינו מצע (Pro,, ליס) לא עשו זאת (איור 3), המאמת עם מחקרים קודמים 18. בדרך כלל, סגוליות מצע נמדד במבחני תחרות באמצעות מצע שכותרתו איזוטופ רדיו מעורבב עם מצע מתחרה, שהוא די מייגע ודורש אוכלוסייה של תאים ששווים המבטאת את טרנספורטר כדי להיחקר. הדמיה אופטית שהודגמה כאן מציעה גישה חלופית. כאשר אין שינויי סריג יעילות הם נצפו על תוספת של המצע, מכמה סיבות יכולה להיחשב. סיבה אפשרית אחת היא יכולת הספיגה הנמוכה עבור המצע שנבדק ו / או פעילות גבוהה של אנזימים השומרים על הריכוז בתאים. לדוגמא, שינוי ריכוז גלוטמין היה מינימאלי בתאי cos7 שאינו מבטאים טרנספורטר ASCT2 בתנאי שנבדק, למרות שאת שורות התאים יכולים לגדול בתקשורת באופן ברור שבגלוטמין במקור החנקן העיקרי (איור 4). בנוסף, אם הזיקה של החיישן היא גם גבוהה מדי או נמוכה מדי בהשוואה לריכוז תאית, רוב חלבוני החיישן יישאר constitutively מאוגד או לא מאוגד, בהתאמה; ולכן אין שינוי סריג יעילות יהיה דetected. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. תצורה של חיישן גלוטמין סריג. הפתוח (ציאן) (א) וסגרה קונפורמציה (צהובה) של glnH, גלוטמין חלבון מחייב מE.coli. המצב שבו mTFP1 מוכנס מסומן בצבע מגנטה. ייצוגי סכמטי (B) של חיישני FLIPQTV_3.0. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. במדידות vivo גלוטמין באמצעות FLIPQ-TV3.0_8m וחיישנים 100μ. (א) יחס venus/mTFP1 של תאי cos7 שיתוף להביע חיישן FLIPQ-TV3.0_8m וASCT2-mCherry. mCherry תג שימש לזיהוי התאים המבטאים את התחבורהאה בלי להתערב ערוצי פליטת mTFP1 או ונוס. התאים היו perfused עם החיץ של האנק HEPES שנאגר (pH 7.35). נקודתי זמן כאשר גלוטמין תאי (אדום) ואלנין (כחול) התווסף לתקשורת זלוף הם ציינו תיבות מעל הגרף. קווים מלאים ומקווקוים מייצגים את שני תאים בודדים שנמדדו באותו הניסוי. (ב &#39;) בעוצמות של תורם (mTFP1) וacceptor ערוצים (ונוס) בניסוי שמוצג ב( א&#39;). הערכים תוקנו לphotobleaching ומנורמל לתחילת המחקר. (ג) ו (ד &#39;) ניסוי דומה כמו ב( א) ו (ב), הופיע עם תאי cos7 מבטאים את חיישן FLIPQ-TV3.0_100μ. (איור שונה מ10). <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. ביעור לא גלוטמין הסלולריhrough טרנספורטר ASCT2 בנוכחות חומצות אמינו חיצוניים, דמיינו באמצעות חיישן FLIPQ-TV3.0_8m. () גלוטמין Cytosolic מיוצא על ידי התוספת של עלא תאי, Ser, Cys, Thr, ו-D-ser. תוספת נקודתי זמן כאשר גלוטמין תאי (תיבות אדומות) או חומצות אמינו אחרות (קופסות כחולות) נוספו לתקשורת זלוף הם ציינו תיבות מעל הגרף. (B) של Pro, יס, (קופסות השחורות) שלו אינה משנה את ריכוז גלוטמין cytosolic , ואילו התוספת של עלא (תיבות כחולות) מקדמת את היצוא של גלוטמין. קווים מלאים ומקווקוים מייצגים את שני תאים בודדים שנמדדו באותו הניסוי. כל חומצות אמינו נוספו ב5 ריכוזים חיצוניים מ&quot;מ. (איור פורסם במקור ב10). <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig4highres.jpg" width="500" /> דואר איור 4. יחס venus/mTFP1 של תאי cos7xpressing חיישן FLIPQ-TV3.0_8m () וחיישן 100μ (ב &#39;). התאים היו perfused עם החיץ של האנק HEPES שנאגר. נקודתי זמן כאשר גלוטמין תאי (5 מ&quot;מ) התווסף לתקשורת זלוף הם ציינו תיבות אדומות מעל הגרף. קווים מלאים ומקווקוים מייצגים את שני תאים בודדים שנמדדו באותו הניסוי. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. תיקון לphotobleaching. () עוצמות גלם משני תאים מיוצגים באיור 2 א ו 2 ג. (B) Datapoints שנבחרו לחישוב ערכי הבסיס. קימורים הולם Polynominal מוצגים באיור. (C) עוצמות של ערוצים שמוצגים ב, מנורמל נגד הבסיס מחושב בB. בסיס הנתונים המשמשים בנתון זה הוא IDEntical לזה שמוצג באיור 2 א ו 2 ג. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6. במדידות vivo גלוטמין באמצעות חיישן FLIPQ-TV3.0_1.5m. (א) יחס venus/mTFP1 של תאי cos7 שיתוף להביע חיישן FLIPQ-TV3.0_1.5m וASCT2-mCherry. תג mCherry שימש לזיהוי התאים המבטאים את טרנספורטר בלי להתערב ערוצי פליטת mTFP1 או ונוס. התאים היו perfused עם החיץ של האנק HEPES שנאגר (pH 7.35). נקודתי זמן כאשר גלוטמין תאי (אדום) ואלנין (כחול) התווסף לתקשורת זלוף הם ציינו תיבות מעל הגרף. קווים מלאים ומקווקוים מייצגים את שני תאים בודדים שנמדדו באותו הניסוי. (ב &#39;) בעוצמות של תורם (mTFP1) וacceptor ערוצים (ונוס)בניסוי שמוצג ב( א &#39;). הערכים תוקנו לphotobleaching ומנורמל לתחילת המחקר. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="474" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> זמן (דקות) </td><td> פתרון </td><td> פתרון ב &#39; </td><td> הפתרון C </td><td> הפתרון D </td><td> פתרון E </td><td> הפתרון F </td></tr><tr><td> 0 </td><td> שסתום על </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> שסתום את </td><td> שסתום על </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> שסתום על </td><td> שסתום את </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> שסתום את </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שסתום על </td></tr><tr><td> 8 </td><td> שסתום על </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שסתום את </td></tr&gt; <tr><td> 10 </td><td> שסתום את </td><td></td><td> שסתום על </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> שסתום על </td><td></td><td> שסתום את </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14 </td><td> שסתום את </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שסתום על </td></tr><tr><td> 16 </td><td> שסתום על </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שסתום את </td></tr><tr><td> 18 </td><td> שסתום את </td><td></td><td></td><td> שסתום על </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20 </td><td> שסתום על </td><td></td><td></td><td> שסתום את </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 22 </td><td> שסתום את </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שסתום על </td></tr><tr><td> 24 </td><td> שסתום על </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שסתום את </td></tr&gt; <tr><td> 26 </td><td> שסתום את </td><td></td><td></td><td></td><td> שסתום על </td><td></td></tr><tr><td> 28 </td><td> שסתום על </td><td></td><td></td><td></td><td> שסתום את </td><td></td></tr><tr><td> 30 </td><td> שסתום את </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שסתום על </td></tr><tr><td> 32 </td><td> שסתום על </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> שסתום את </td></tr><tr><td> 34 </td><td> שסתום את </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> . טבלה 1 דוגמא לפרוטוקול זלוף השתמש בניסוי זה פתרון:. מלח 9.7 גרם האנק (H1387), 0.35 גרם NaHCO 3, 5.96 HEPES גרם ל-pH 1 ליטר מותאם ל7.35 עם NaOH פתרון ב &#39;:. פתרון + 0.04 מ&quot;מ Gln הפתרון C:.. פתרון + 0.2 מ&quot;מ Gln solutיון D:. פתרון + 1 מ&quot;מ Gln פתרון E:. פתרון + 5 מ&quot;מ Gln הפתרון F: פתרון + 5 מ&quot;מ אלבמה

Watch this Scientific Journal Video about Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors at JoVE.com

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

מאמר זה ידגים כיצד לעקוב אחר דינמיקת גלוטמין בתאים חיים באמצעות סריג. חיישני מקודדים גנטי מאפשרים ניטור בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות ברזולוציה subcellular. עיצוב ניסיוני, פרטים טכניים של ההגדרות הניסיוניות, ושיקולים לניתוחים שלאחר ניסוי יידונו לחיישני גלוטמין מקודד גנטי.

גלוטמין שטף הדמיה באמצעות חיישני מקודדים גנטיים

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

glutamine-flux-imaging-using-genetically-encoded-sensors

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K Views.  Virginia Tech.  מאמר זה ידגים כיצד לעקוב אחר דינמיקת גלוטמין בתאים חיים באמצעות סריג. חיישני מקודדים גנטי מאפשרים ניטור בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות ברזולוציה subcellular. עיצוב ניסיוני, פרטים טכניים של ההגדרות הניסיוניות, ושיקולים לניתוחים שלאחר ניסוי ייד?...

Video: Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

הדמיה גישות הערכות של רעילות לחץ חימצוני באמצעות חיישנים Fluorogenic מקודד גנטית

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Cancer Research

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental transitions in plants. Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) is the first F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)-based biosensor that allows monitoring of cellular GA levels in vivo. By measuring a fluorescence emission ratio of nuclear localized-GPS1 (nlsGPS1), spatiotemporal mapping of endogenously and exogenously supplied GA gradients in different tissue types is feasible at a cellular scale. This protocol will describe how to image nlsGPS1 emission ratios in three example experiments: steady-state, before-and-after exogenous gibberellin A4 (GA4) treatments, and over a treatment time-course. We also provide methods to analyze nlsGPS1 emission ratios using both Fiji and a commercial three-dimensional (3-D) micrograph visualization and analysis software and explain the limitations and likely pitfalls of using nlsGPS1 to quantify gibberellin levels.

Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) is the first F&#246;rster resonance energy transfer-based biosensor for measuring the cellular levels of gibberellin phytohormones with a high spatiotemporal resolution. This protocol reports on the method to visualize and quantify cellular gibberellin levels using the genetically encoded nlsGPS1 biosensor in Arabidopsis hypocotyls and root tips.

ג'יברלין הסלולר להמחיש רמות שימוש באנרגיה תהודה פורסטר NlsGPS1 העברה (סריג) ביוסנסור

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental ...

Developmental Biology

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biology

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Neuroscience

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

וזמינותו תפוקה גבוהה סידן השטף ללמוד קולטני NMDA עם רגישות גליצין/D-סרין, גלוטמט

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical manifestations include weight loss, dyslipidemia, and hypermetabolism; however, it remains unclear how these relate to motor neuron degeneration. Using a Drosophila model of TDP-43 proteinopathy that recapitulates several features of ALS including cytoplasmic inclusions, locomotor dysfunction, and reduced lifespan, we recently identified broad ranging metabolic deficits. Among these, glycolysis was found to be upregulated and genetic interaction experiments provided evidence for a compensatory neuroprotective mechanism. Indeed, despite upregulation of phosphofructokinase, the rate limiting enzyme in glycolysis, an increase in glycolysis using dietary and genetic manipulations was shown to mitigate locomotor dysfunction and increased lifespan in fly models of TDP-43 proteinopathy. To further investigate the effect on TDP-43 proteinopathy on glycolytic flux in motor neurons, a previously reported genetically encoded, FRET-based sensor, FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, was used. This sensor is comprised of a bacterial glucose-sensing domain and cyan and yellow fluorescent proteins as the FRET pair. Upon glucose binding, the sensor undergoes a conformational change allowing FRET to occur. Using FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, glucose uptake was found to be significantly increased in motor neurons expressing TDP-43G298S, an ALS causing variant. Here, we show how to measure glucose uptake, ex vivo, in larval ventral nerve cord preparations expressing the glucose sensor FLII12Pglu-700&#181;&#948;6 in the context of TDP-43 proteinopathy. This approach can be used to measure glucose uptake and assess glycolytic flux in different cell types or in the context of various mutations causing ALS and related neurodegenerative disorders.

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Glucose uptake is increased in Drosophila motor neurons affected by TAR DNA binding protein (TDP-43) proteinopathy, as indicated by a FRET-based, genetically encoded glucose sensor.

מדידת ספיגת גלוקוז במודלים של דרוסופילה של פרוטאינופתיה TDP-43

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

הדמיה חיה של מצב גלוטתיון גלוטתיון מיטוכונדריאלי בנוירונים ראשוניים באמצעות מחוון רצומטרי

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.