Name: glutamine flux imaging using genetically encoded sensors
Uploaded: 2014-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere 1R21NS064412, concessione NSF 1.052.048 e Jeffress Memorial Trust concessione J-908.

1. Preparazione del campione Nota: In molti casi gli esperimenti di perfusione lavare via una porzione significativa di cellule, che può diventare un problema frustrante. Sebbene non necessario per tutte le linee cellulari, superfici di vetro coperchio rivestimento con poli-L-lisina (aggiungere 1,0 ml/25 cm 2 di soluzione 0,01% in superficie, incubare&gt; 5 min, lavare due volte con acqua di grado coltura cellulare, e secco l&#39;armadio biosicurezza) migliora l&#39;adesione cellulare. Inoltre, essere consapevoli del livello di biosicurezza (BSL) della linea cellulare utilizzata, e seguire la procedura operativa standard approvato dall&#39;ufficio di salute e sicurezza ambientale locale. In questo esperimento, le cellule COS7 stati usati a causa della bassa attività di trasporto glutammina endogena (vedi Figura 4). <ol><li> Seme cellule COS7 a ~ 70-80% di confluenza in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + siero di vitello cosmica 10% e 100 U / ml di penicillina / streptomicina, sia su sterili 25 millimetri vetrini coprioggetto posti in coltura da 6 pozzettipiatto o 8 pozzetti vetrini con fondo di vetro. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità per 24 ore. </li><li> Scambiare il mezzo di crescita per DMEM siero di vitello cosmici +10% (antibiotici), secondo il protocollo del produttore. Grow O / N a 37 ° C, 5% CO 2 al 100% di umidità. </li><li> Aggiungere 0,4 mg ciascuna di DNA plasmidico codificante il sensore glutammina (pcDNA3.1, portando sensore FLIPQTV3.0 sotto promotore CMV 10) e il ASCT2 mCherry-tag 10 a 50 ml terreni privi di siero (OPTI-MEM) e mescolare delicatamente. </li><li> Aggiungere 1 ml di reagente di trasfezione a 50 ml terreni privi di siero. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Mescolare le due soluzioni contenenti DNA (fase 1.3) e reagente di trasfezione (passo 1.4) e incubare per 20 min. </li><li> Aggiungere delicatamente il reagente di trasfezione sulla parte superiore delle cellule e mescolare delicatamente a dondolo camera. Incubare per 24 ore a 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità. </li><li> Dopo 24 ore, scambiare il mezzo di DMEM + 10% Cosmic Calf Serum(CCS) + 100 unità di penicillina / streptomicina. </li><li> Le cellule vengono esposte 48-72 ore dopo la trasfezione. </li></ol> 2. Esperimento perfusione Nota: Per le cellule COS7 utilizzati in questo esperimento, i media di perfusione e la camera sono stati mantenuti a temperatura ambiente e la concentrazione di CO 2. Tuttavia, se le cellule in uso richiedono una temperatura più alta e CO 2 di controllo della concentrazione per la sopravvivenza, palco microscopio riscaldamento e / o una camera ambientale dovrebbe essere usato. <ol><li> Preparare perfusione tampone AF (Vedere elenco dei materiali). Fissare rubinetti a 50 ml siringhe, chiudere i rubinetti poi riempirli con le soluzioni di perfusione. Aprire il rubinetto per un breve periodo ad occupare lo spazio di testa del rubinetto con il tampone. </li><li> Accendere il 8 canali, sistema di perfusione a gravità con una matita perfusione, e quindi selezionare &quot;Modalità manuale&quot; sotto Selezionare l&#39;opzione Function. Posizionare un contenitore di rifiuti sotto la matita perfusione. </li><li> Manualmenteattivare le porte premendo i numeri corrispondenti e riempire i tubi con siringa da 10 ml contenente acqua, e poi chiudere la porta. Una volta che le porte sono riempite con acqua, impostare le siringhe contenenti tamponi AF sulla porta 1-6 del sistema di perfusione, e quindi aprire i rubinetti. Aprire nuovamente le porte per sostituire l&#39;acqua nel tubo con gli ammortizzatori. La portata deve essere di circa 0,8 ml / min. </li><li> Premere annullare una volta sul controller perfusione per tornare al menu &quot;Select Function&quot;. Alterna l&#39;opzione &quot;Modifica Programmi&quot;, quindi digitare nel protocollo di perfusione indicato nella Tabella 1. Salvare il programma di perfusione. </li><li> Prendete le cellule fuori dell&#39;incubatore. Lavare due volte con il buffer di perfusione, e quindi impostare le celle sul palco. Collegare il sistema di perfusione alla camera. Se viene utilizzata una camera aperta, impostare un&#39;altra pompa che rimuove la soluzione di perfusione dalla camera. </li><li> Aprire il software Slidebook. Inizia una nuova diapositiva. Nota: L&#39;seguente procedura è specifica per software Slidebook, ma altri software come MetaFluor e Nis-elemento può essere utilizzato anche per il tipo di rappresentazione qui descritto. Teoricamente esperimenti possono essere eseguiti utilizzando qualsiasi software che permette l&#39;imaging time-course, e le sequenze di immagini possono essere analizzati post-sperimentale utilizzando software come ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) o Fiji (http:/ / fiji.sc / Fiji). Tuttavia, il software che consente il monitoraggio in tempo reale di rapporto accettore / donatore è molto utile. </li><li> Montare il vetrino sul palco microscopio a fluorescenza. Trova le cellule co-esprimono il sensore e ASCT-mCherry utilizzando appositi set di filtri (vedi elenco dei materiali) con la funzione &quot;FOCUS&quot;. Regolare il guadagno facendo clic sulla scheda &quot;Camera&quot; e facendo scorrere la barra di scorrimento sotto &quot;guadagno&quot;. Inoltre, regolare l&#39;impostazione filtro a densità neutra dal menu a discesa filtro a densità neutra. Nota: Se il cubo del filtro non include un filtro occhio, non usare i pezzi oculari da Short-lunghezza d&#39;onda di luce di eccitazione è dannoso per gli occhi. Usare lo schermo del computer per individuare le celle invece. </li><li> Acquisire immagini di cellule with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (I filtri sono specificati nell&#39;Elenco dei materiali). Fare clic su &quot;Acquisizione Immagine&quot;, quindi nella finestra di acquisizione, specificare i filtri che stanno per essere utilizzati. Fare clic sul pulsante &quot;TEST&quot; per regolare il tempo di esposizione digitando il tempo di esposizione desiderato nella casella accanto alle impostazioni del filtro. Nota: Tutti e tre i canali devono essere esposti per la stessa lunghezza. Quando si regolano i parametri di imaging, prendere il cambiamento efficienza FRET previsto e piega aumentare in considerazione: per esempio, se l&#39;efficienza FRET si prevede di salire due volte durante l&#39;esperimento, i parametri di imaging devono essere regolatiin modo che l&#39;intensità di donatori ex Acceptor em Allo stato di riposo deve essere &lt;50% del valore massimo che può essere registrato dallo strumento, in modo che il canale non si saturi durante l&#39;esperimento. Segnale dalle cellule marcate dovrebbe essere almeno tre volte superiore a quello della regione di sfondo. </li><li> Prelievo di una regione di interesse utilizzando lo strumento regioni del software. In alternativa, una funzione software per selezionare i pixel sopra certa intensità può essere utilizzato, e quindi convertito in regioni. Per effettuare questa operazione, fare clic su Maschera - Segment, quindi spostare la barra di scorrimento per evidenziare le aree desiderate. </li><li> Selezionare &quot;time lapse&quot; nella casella Tipo di acquisizione, quindi specificare l&#39;intervallo (10 sec in questo esperimento) e punti di tempo per l&#39;esperimento. </li><li> Disegnare una regione in uno spazio senza alcuna cellule fluorescenti. Questa area è utilizzata per la sottrazione del fondo. Fare clic destro regione disegnata, e quindi impostare come sfondo. Nota: Idealmente, le cellule che non sonot esprimendo i sensori deve essere utilizzata come area di sfondo in considerazione sia la autofluorescenza e la fioritura sfondo rilevato dalla fotocamera. Se le suddette cellule sono disponibili nel campo visivo, almeno una regione senza le celle deve essere utilizzato per spiegare la fluorescenza di fondo. </li><li> Selezionare il programma desiderato sotto &quot;Select Function - Eseguire programmi&quot; l&#39;opzione. Alternare al programma memorizzato (vedere la fase 2.3), e poi ha colpito INVIO sul controller perfusione. Ora il programma viene caricato, e premendo un tasto qualsiasi inizierà la perfusione. </li><li> Garantire perfusione e l&#39;esperimento di imaging avviare Allo stesso tempo facendo clic sul pulsante &quot;Start&quot; nella finestra di acquisizione al tempo stesso come la pressione di un tasto sul controller perfusione. Nota: Si consiglia di registrare il tempo di valutazione in cui sono state scambiate le soluzioni (questo può essere fatto utilizzando funzione &quot;Note&quot;, che si trova all&#39;interno della scheda di acquisizione). </li><li> Eseguire la stessa perfusione protocollo USIng cellule esprimenti un sensore che dovrebbe essere saturi o non associati a condizione sperimentale. Nota: Qui, FLIPQTV3.0_1.5μ, che è saturo condizione sperimentale, viene usato come controllo, Figura 6 Tali esperimenti di controllo sono necessari per confermare che il cambiamento efficienza FRET è dovuta alla variazione effettiva del substrato e non. a causa del cambiamento di altri parametri quali pH cellulare. </li></ol> 3. Post-esperimento di analisi <ol><li> Esaminare se si è verificato deriva campione durante l&#39;esperimento. Disegnare regioni di interesse (ROI) s sull&#39;immagine scattata a timepoint 0, quindi spostare la barra di scorrimento nella parte superiore della finestra di imaging e verificare se le cellule cadono le ROI nelle immagini scattate nel corso della sperimentazione. </li><li> Se sì, allora utilizzare la funzione di tracking per correggere la deriva in primo luogo, la creazione di maschere intorno alle cellule selezionando Mask - Segment, quindi far scorrere la linea che specifica il taglio di HIGhlight le regioni contenente cellule. Traccia le regioni cliccando Mask - tracciamento di particelle - il monitoraggio di base delle particelle. </li><li> Ri-disegnare il ROI e lo sfondo regione quando necessario. </li><li> Esportare l&#39;intensità media dei ROI nel corso dell&#39;esperimento. Fare clic su Statistiche - Esporta - Dati Rapporto / timelapse. </li><li> Quando l&#39;efficienza FRET e la quantificazione della concentrazione del substrato non è necessario, tracciare l&#39;andamento temporale del rapporto di intensità (Donor ex Acceptor em, / donatori ex donatori em) come proxy della dinamica del substrato. Per determinare la concentrazione citosolica, calcolare il massimo e minimo cambiamento rapporto (ossia alla saturazione e assenza del substrato, rispettivamente), Ar max - Ar min, mediante regressione non lineare di Δratio (Ar) con la seguente equazione: Ar = [S] / (K d + [S]) x (Ar <sub&gt; max - min Ar) + Ar min dove [S] è la concentrazione del substrato nel citosol. Utilizzando i Ar max - min valori Ar ottenuti, la saturazione (S) del sensore in un dato Ar è calcolato come S = (Ar - Ar min) / (Ar max - min Ar) S può inoltre essere convertito in concentrazione del substrato [S] con la seguente equazione: S = [S] / (K d + [S]) Nota: l&#39;intensità del canale em Acceptor ex Acceptor dovrebbe essere anche tracciato di esaminare se la condizione sperimentale influenzato la fluorescenza del accettore direttamente. </li><li> Quando si osserva una deriva della linea di base a causa di fotometabolismo, eseguire una correzione al basale. Per fare questo, tracciare le intensità di donatore e accettore nel tempo (Figura 5A). Poi identificare i punti temporali utilizzati per ªe basale, secondo il ritardo nel sistema di perfusione e l&#39;attività di trasporto del particolare cellula (Figura 5B). </li><li> Calcolare un raccordo polinomio che meglio descrive la linea di base. Poi, normalizzare l&#39;intensità grezzo da ogni tempo di valutazione al basale (Figura 5C). Calcolare il rapporto di intensità (Donor ex Acceptor em, / donatori ex donatori em) dalle intensità donatore e accettore normalizzati. </li></ol>

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	<li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hepatic+ammonia+metabolism:+the+intercellular+glutamine+cycle.">Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle.</a> Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).</li><li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).</li><li>Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Nutrition. 18, 301-303 (2002).</li><li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).</li><li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Seq:+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA+sequencing+method,+reveals+non-genetic+gene-expression+heterogeneity.">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14, R31 (2013).</li><li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+Ca(2+)+ions+in+dendritic+spines.">The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+with+fluorescent+biosensors.">Quantitative imaging with fluorescent biosensors.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).</li><li>Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encodable+fluorescent+biosensors+for+tracking+signaling+dynamics+in+living+cells.">Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells.</a> Chemical reviews. , 111-3666 (2011).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).</li><li>Gruenwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+glutamine+transporter+activities+in+living+cells+using+genetically+encoded+glutamine+sensors.">Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors.</a> PLoS One. 7, e38591 (2012).</li><li>Chaudhuri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protonophore-+and+pH-insensitive+glucose+and+sucrose+accumulation+detected+by+FRET+nanosensors+in+Arabidopsis+root+tips.">Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips.</a> Plant Journal. 56, 948-962 (2008).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li><li>Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+Screen+Identifies+Letm1+as+a+Mitochondrial+Ca2+/H++Antiporter.">Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter.</a> Science. , 326-147 (2009).</li><li>Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+cell+glutamine+synthetase+rapidly+impairs+the+retinal+response+to+light.">Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light.</a> Glia. 30, 64-73 (2000).</li><li>Rothstein, J. D., Tabakoff, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Striatal+Glutamate+Release+after+Glutamine-Synthetase+Inhibition.">Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition.</a> J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).</li><li>Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+amino+acid+transporter+SNAT3+by+insulin+in+hepatocytes.">Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes.</a> J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).</li><li>Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serine/threonine+kinases+SGK1,+3+and+PKB+stimulate+the+amino+acid+transporter+ASCT2.">The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2.</a> Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).</li><li>Br&#246;er, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+astroglial+ASCT2+amino+acid+transporter+as+a+mediator+of+glutamine+efflux.">The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux.</a> J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).</li><li>Wallace, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2++sensor.">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li><li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors:+what+are+we+really+measuring.">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li><li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells.">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712 (2013).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer:+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator.">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).</li><li>Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity:+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening.">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114 (2011).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li><li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells.">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li></ol>

Non c&#39;è nulla da rivelare.

Il successo di esperimenti di imaging dipende da alcuni fattori critici. Uno di questi fattori è l&#39;affinità di sensori utilizzati, come discusso sopra. Concentrazione assoluta del substrato nel compartimento subcellulare di interesse, tuttavia, è spesso sconosciuta. Pertanto si consiglia di provare diversi sensori con affinità sfalsati per trovare quello che funziona meglio sotto la condizione sperimentale desiderato. Ad esempio, nel nostro caso abbiamo trasfettato cellule COS7 con sensori di glutammina con 1.5μ, 100μ, 2m e 8m (Figura 3 e dati non mostrati). Un altro fattore importante è il livello di espressione di proteine ​​sensori. Il livello di espressione richiesto per il rilevamento varia, esperimenti, ad esempio, quando un breve evento (ad esempio, potenziale d&#39;azione singola) bisogna osservare un livello di espressione superiore potrebbe diventare necessario 19. Pertanto, nella maggior parte dei casi, il livello richiesto deve essere empirically determinato. Se il bersaglio esiste in concentrazione molto bassa nella cella, perturbazione dei processi endogeni causa dell&#39;esaurimento bersaglio può diventare un problema 20. Un test indipendente per valutare tale possibilità, se disponibile, è quindi desiderabile. Negli esperimenti mostrati in questo articolo, l&#39;espressione della proteina guidato dal promotore CMV è risultato sufficiente. In situazioni in cui devono essere utilizzati promotori con attività molto più deboli, adeguamenti per aumentare l&#39;intensità del segnale potrebbero rendersi necessari. Ad esempio, compromesso tra l&#39;intensità del segnale e fotometabolismo durante l&#39;esposizione deve essere raggiunto. Oltre al tempo di esposizione, fattori come ad esempio la luminosità dei fluorofori, cambiamento intensità massima del sensore, binning, e la sensibilità di telecamera CCD possono essere modificate per aumentare l&#39;intensità del segnale. Quando nessuna variazione di rapporto si osserva nella condizione sperimentale anche se i suddetti due criteri sono suscettibili diessere soddisfatte, è possibile che l&#39;omeostasi cellulare per il metabolita o ione dato è sufficiente a mascherare la forte attività di trasporto (vedere la sezione risultato). In tali casi, linee cellulari con differenti attività biochimiche potrebbero essere necessari come sfondo per rilevare le attività del trasportatore 10, 21. Mentre questi sensori permettono di monitorare le dinamiche di concentrazione del substrato a risoluzione spazio-temporale molto superiore rispetto ai metodi basati estrazione-, determinazione della concentrazione assoluta richiede ulteriori misure sperimentali e considerazioni. Solitamente, concentrazione del substrato è calcolata sul presupposto che l&#39;affinità del sensore, di solito calcolata per titolazione proteina purificata sensore, è invariata quando espresso nella cellula. La concentrazione è calcolata utilizzando la seguente singolo isoterma di legame, [S] = K d x (r - r min) / (r &lt;/ Em&gt; max - r) [S] è la concentrazione del substrato, K d è la costante di dissociazione determinato in vitro, r è il rapporto accettore / donatore osservata in un dato tempo di valutazione, r min è il rapporto accettore / donatore quando i sensori sono in forma apo, e r max è il rapporto accettore / donatore quando tutti i sensori sono legati al substrato. R min e r max sono influenzati da parametri quali la concentrazione di sensori, impostazioni di imaging utilizzate e la composizione del Milleu cellulare, e quindi necessitano di essere misurati in situ . Per determinare r valori massimi r min e, condizioni sperimentali che consente la modifica della concentrazione intracellulare substrato diventa necessario. Ad esempio, ionofori selettivi (ad esempio, ionomicina per Ca 2 +) 22 o un reagente perforante come digitonin 23 può essere utilizzato per equilibrare concentrazione del substrato intracellulare con la concentrazione esterna. Una delle limitazioni nel tipo di esperimenti hanno dimostrato in questo protocollo è la bassa produttività; l&#39;analisi si limita ad analizzare un metabolita in un&#39;area relativamente piccola (&lt;10) il numero di cellule. I progressi tecnologici sono stati fatti, tuttavia, superare tali limitazioni. Ad esempio, con l&#39;anticipo in automatico, screening ad alto contenuto, è ora possibile utilizzare sensori geneticamente codificati in combinazioni con piccola molecola o biblioteca RNAi; cellule esprimenti un biosensore possono essere coltivate in un formato ad alta velocità (ad esempio, 96 - o 384 pozzetti), poi singoli pozzetti possono essere trattati con siRNA o prodotti chimici e ripreso. Tali esperimenti permettono l&#39;identificazione dei costrutti siRNA o sostanze chimiche che inficiano il processo biologico che può essere osservato dal biosensore 24 25. Un&#39;altra emozionante recente inclusione anticipodes lo sviluppo di un flusso microfluidica risolta nel tempo citometro, che consente di localizzare alto-capacità di FRET cambiamento efficienza a livello cellulare 26. Tali progressi tecnici aiuteranno scoperte di nuovi farmaci candidati e nuovi componenti in processi biologici.

A causa di notevoli progressi nelle tecnologie che consente l&#39;esame del trascrittoma e proteoma a livello cellulare, ora è diventato chiaro che la biochimica e la conseguente flusso di metaboliti e ioni sono altamente tipo cellulare specifico. Ad esempio, nel fegato di mammiferi, degradazione glutammina sequenziale e sintesi vengono effettuate simultaneamente dalle cellule periportale e cellule perivenose rispettivamente, alimentando ammonio al ciclo dell&#39;urea nel primo tipo di cellula consumando eccesso di ammoniaca in quest&#39;ultimo 1-3. In alcuni casi, una significativa eterogeneità biochimica viene rilevato anche in un unico &quot;tipo cellulare&quot; 4, 5. Oltre a questa particolarità spaziale, i livelli cellulari di metaboliti e ioni sono altamente dinamici (per esempio, molecole di segnalazione come Ca 2 + e nucleotidi ciclici). I modelli spazio-temporali dei metaboliti e ioni giocano spesso un ruolo critico nella trasduzione del segnale. MONITORAGGIO dinamiche cellulari di metaboliti e ioni, tuttavia, pongono sfida unica. In molti casi la variazione delle concentrazioni sono rapido e transitorio, esemplificato dal caso di molecole di segnalazione come Ca 2 +, che decade entro ~ 20 msec in spine dendritiche 6. Inoltre, compartimentazione di vie biochimiche all&#39;interno e tra le cellule rende difficile quantificare le dinamiche di metaboliti e ioni con estrazione e cromatografia su colonna / tecniche di spettrometria di massa. Sensori geneticamente codificate molecole biologiche sono ora ampiamente utilizzati a causa della alta risoluzione spazio-temporale che permette lo sperimentatore di studiare dinamica molecolare di breve durata e / o compartimenti (recensiti 7, 8). Questi sensori geneticamente codificati possono grossolanamente essere suddivisi in due categorie; sensori basati sull&#39;intensità e sensori ratiometic. Sensori basati intensità, in genere costituiti da un dominio di legame e l&#39;influenzaproteina orescent (PQ), e il legame al dominio di legame soluto cambia l&#39;intensità fluorescente. Sensori Ratiometic, d&#39;altra parte, spesso sfruttano Foster Resonance Energy Transfer (FRET) tra due PQ che fungono da coppia FRET. Questi sensori sono costituiti da un dominio di legame e due PQ, e il legame soluto induce la variazione di efficienza FRET tra i due PQ. Un gran numero di sensori per biologicamente importanti metaboliti e ioni sono stati sviluppati negli ultimi dieci anni 8, 9. Una delle eccitante possibilità offerta da tali sensori geneticamente codificati è il loro uso nell&#39;analisi ad alta risoluzione di processi di trasporto di membrana, che in precedenza non era facile individuare a livello cellulare. Sensori geneticamente codificati facilitano l&#39;analisi dei meccanismi di trasporto come specificità di substrato e pH dipendenza 10, 11. Inoltre, in combinazione con i res geneticheONTI come la biblioteca di RNAi costruisce per organismi modello, è ora possibile effettuare ricerche genome-wide per i processi di trasporto innovativi che utilizzano sensori geneticamente codificati. Infatti, l&#39;uso di organismi geneticamente codificato cavo del sensore alla scoperta dei trasportatori in precedenza non caratterizzate in più casi 12, 13. Recentemente, il nostro laboratorio ha sviluppato una serie di sensori basati su FRET per la glutammina. Abbiamo dimostrato che i livelli di glutammina cellulare può essere osservata con tali sensori FRET glutammina 10. Questi sensori sono costituiti da un donatore FRET (mTFP1) inserito in un batterica proteina legante glutammina glnH, e un accettore FRET (venus) al C-terminali di glnH (Figura 1). FRET efficienza di questi sensori diminuire in seguito al legame di glutammina, con conseguente diminuzione del rapporto di intensità accettore / donatore. Belle regolazione dei processi di trasporto glutammina è importante nei processi biologici quali neurotransmissione 14, 15 e la manutenzione di ciclo dell&#39;urea nel fegato 1, 16, 17. Qui vi mostriamo la metodologia di analisi delle attività di trasporto con sensori FRET per la glutammina, con un ampio campo di microscopio a fluorescenza set-up. Lo scopo degli esperimenti mostrato qui di rilevare attività trasportatore in una singola cella ed esaminare specificità di substrato di un trasportatore transitoriamente espressa.

<table><tbody><tr><td>Inverted fluorescent microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81F-3-5</td><td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate.</td></tr><tr><td>Excitation filter (mTFP1)</td><td>Omega Optical</td><td>3RD450-460</td><td>Band width 450-460 nm</td></tr><tr><td>Excitation filter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET500/20</td><td>Band width 490-510 nm</td></tr><tr><td>Emission filter (mTFP1)</td><td>Chroma</td><td>HQ495/30m</td><td>Band width 475-505 nm</td></tr><tr><td>Emission filter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET535/30m</td><td>Band width 520-550 nm</td></tr><tr><td>Dichroic mirror (FRET channels)</td><td>Chroma</td><td>470dcxr</td><td>Long pass, 470 nm cut off</td></tr><tr><td>Dichroic mirror (YFP channel)</td><td>Chroma</td><td>89002bs</td><td>Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm</td></tr><tr><td>mCherry filter set</td><td>Chroma</td><td>49008</td><td>Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Olympus</td><td>U-LH100L-3-5</td><td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Qimaging</td><td>Rolera-MGi EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Apochromatic fluorescence objective</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion system, ValveBank II</td><td>AutoMate Scientific</td><td>[01-08]</td><td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td></tr><tr><td>Laminar-flow chambers</td><td>C&amp;amp;L Instruments</td><td>VC-MPC-TW</td><td>Other larminar-flow chambers would also work.</td></tr><tr><td>Chambered slide</td><td>Lab-Tek</td><td>154534</td><td>For open-chamber experiments</td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Thermo Scientific</td><td>74-046-12131</td><td>For open-chamber experiments</td></tr><tr><td>Software supporting ratiometric measurements</td><td>Intellegenent Imaging Innovation</td><td>Slidebook 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow biosafety cabinet</td><td>ESCO</td><td>LA-3A2</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-255-25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s MEM (DMEM)</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic calf serum</td><td>Hyclone</td><td>SH3008703</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td>Used with Lipofectamine 2000</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine solution</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>25 mm circular glass cover slips</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-545-102</td><td>In case VC-MPC-TW is used</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Other transfection reagents can also be used.</td></tr><tr><td>Solution A (Hank&#039;s buffer)</td><td></td><td></td><td>9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td></tr><tr><td>Solution B</td><td></td><td></td><td>Solution A + 0.04 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution C</td><td></td><td></td><td>Solution A + 0.2 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution D</td><td></td><td></td><td>Solution A + 1 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution E</td><td></td><td></td><td>Solution A + 5 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution F</td><td></td><td></td><td>Solution A + 5 mM Ala</td></tr></tbody></table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

I sensori geneticamente codificate permettono il monitoraggio in tempo reale delle molecole biologiche con una risoluzione subcellulare. Una enorme varietà di tali sensori per molecole biologiche si sono resi disponibili negli ultimi 15 anni, alcuni dei quali divenne strumenti indispensabili che vengono utilizzati di routine in molti laboratori. Una delle interessanti applicazioni di sensori geneticamente codificati è l&#39;uso di questi sensori nelle indagini processi di trasporto cellulari. Proprietà dei trasportatori come cinetica e specificità di substrato possono essere studiati a livello cellulare, fornendo possibilità di cellula di tipo analisi specifiche delle attività di trasporto. In questo articolo, vedremo dimostrare come la dinamica dei trasportatori possono essere osservate con sensore di glutammina geneticamente codificato come un esempio. Disegno sperimentale, i dettagli tecnici delle impostazioni sperimentali e considerazioni per le analisi post-sperimentali saranno discussi.

Tipici esperimenti time-corso sono rappresentati in Figura 2. In questi esperimenti, FRET sensori di glutammina con affinità di 8 mm (FLIPQTV3.0_8m, Figura 2A e 2B) e 100 micron (μ FlipQTV3.0_100 C e D) sono stati co-espressi con un obbligatorio scambiatore amminoacido ASCT2 18 in cellule COS7 10. Afflusso di glutammina viene rilevato come variazione rapporti di intensità di fluorescenza tra il donatore (mTFP1) e l&#39;accettore (venus) (Figura 2A e 2C). Efflusso di glutammina in presenza di un altro substrato (Ala) è chiaramente dimostrato anche in questi esperimenti. Con entrambi i sensori, intensità di fluorescenza normalizzate cambiano reciprocamente (cioè, l&#39;intensità donatore sale come l&#39;intensità accettore scende, Figura 2B e 2D) in presenza di substrato, che suggeriscono che il cambiamento rapporto osservato sono infatti dovuti to la variazione di efficienza FRET. Questi esperimenti mostrano che le concentrazioni di glutammina in queste cellule oscillano molto dinamicamente condizione sperimentale; dalla gamma di rilevamento di 100 micron sensore alla concentrazione di quasi saturazione del sensore mm 8. Specificità di substrato di trasportatori possono essere esaminati usando sensori, mostrato nella Figura 3. In questi esperimenti le cellule sono state pre-caricati con glutammina, e poi vari amminoacidi sono stati aggiunti al perfusato extracellulare esaminare se tali amminoacidi possono indurre glutammina efflusso. Come previsto, i substrati ASCT2 (Ala, Ser, Cys, Thr, D-serina) indotta efflusso glutammina (Fig. 3A), mentre gli amminoacidi non-substrato (Pro, Sua, Lys) non ha (Fig. 3B), corroborando con Studi precedenti 18. Solitamente, specificità di substrato viene misurata mediante saggi di competizione utilizzando un substrato marcati con isotopi Radio mescolato con substrato concorrenti, Che è piuttosto laborioso e richiede una popolazione di cellule che sono uniformemente esprimendo il trasportatore da studiare. Imaging ottico esemplificato qui offre un approccio alternativo. Quando non FRET efficienza modifiche sono osservate dopo l&#39;aggiunta del substrato, diverse ragioni potrebbero essere considerati. Una possibile ragione è la capacità di assorbimento basso per il substrato in prova e / o alte attività di enzimi che mantengono la concentrazione nelle cellule. Ad esempio, glutammina variazione di concentrazione era minimo in cellule COS7 che non esprimono ASCT2 trasportatore sotto la condizione verificata, anche se questa linea cellulare può chiaramente crescere nel mezzo in cui glutammina nella fonte principale di azoto (Figura 4). Inoltre, se l&#39;affinità del sensore è troppo alta o troppo bassa rispetto alla concentrazione intracellulare, la maggior parte delle proteine ​​sensore resterà costitutivamente associato o non associato rispettivamente; quindi nessun cambiamento FRET efficienza sarà detected. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Configurazione di un sensore FRET glutammina. (A) Open (ciano) e chiuso (giallo) conformazione della glnH, glutammina legame con le proteine ​​da E.coli. La posizione in cui è inserito mTFP1 è segnato in magenta. (B) rappresentazione schematica di sensori FLIPQTV_3.0. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. In vivo misurazioni glutammina utilizzando FLIPQ-TV3.0_8m e sensori 100μ. (A) Il rapporto venus/mTFP1 di cellule COS7 co-esprimono sensore FLIPQ-TV3.0_8m e ASCT2-mCherry. mCherry tag è stato usato per identificare le cellule che esprimono il trasportoer senza interferire i canali di emissione mTFP1 o Venere. Le cellule sono state perfusi con tampone HEPES tamponata di Hank (pH 7,35). Timepoints quando glutammina extracellulare (rosso) e alanina (blu) è stato aggiunto al supporto perfusione sono indicati come scatole sopra il grafico. Linee continue e tratteggiate rappresentano due singole celle misurati nello stesso esperimento. (B) Le intensità di donatore (mTFP1) e accettore (Venere) canali nell&#39;esperimento in (A). I valori sono stati corretti per photobleaching e normalizzato al basale. (C) e (D) Un esperimento simile come in (A) e (B), eseguita con cellule COS7 esprimenti il sensore FLIPQ-TV3.0_100μ. (Figura modificata da 10). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Eliminazione di glutammina cellulare tttraverso il trasportatore ASCT2 in presenza di aminoacidi esterni, è visualizzato mediante il sensore FLIPQ-TV3.0_8m. (A) citosolico glutammina viene esportata dall&#39;aggiunta di extracellulare Ala, Ser, Cys, Thr, e D-ser. Gli intervalli quando glutammina extracellulare (caselle rosse) o di altri aminoacidi (scatole blu) sono stati aggiunti ai mezzi di perfusione vengono indicate come caselle sopra il grafico. (B) aggiunta di Pro, Lys, Sue (scatole nere) non altera la concentrazione di glutammina citosolica , mentre l&#39;aggiunta di Ala (scatole blu) promuove l&#39;esportazione di glutammina. Linee continue e tratteggiate rappresentano due singole celle misurati nello stesso esperimento. Tutti gli aminoacidi sono stati aggiunti a 5 mM concentrazioni esterne. (Figura è stato originariamente pubblicato in 10). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Il rapporto venus/mTFP1 di cellule COS7 expressing sensore FLIPQ-TV3.0_8m (A) e sensore 100μ (B). Le cellule sono stati perfusi con tampone di Hank HEPES-buffered. Timepoints quando glutammina extracellulare (5 mM) è stato aggiunto al supporto perfusione sono indicati come scatole rossi sopra il grafico. Linee continue e tratteggiate rappresentano due singole celle misurati nello stesso esperimento. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Correzione per photobleaching. (A) intensità prime provenienti da due celle rappresentate in Figura 2A e 2C. (B) Datapoints che sono stati selezionati per il calcolo delle linee di base. Adattamento delle curve polinomio sono mostrati in figura. (C) intensità dei canali visualizzati in A, normalizzato contro la base calcolata in B. Il set di dati utilizzato in questa figura è identical a quella mostrata nella Figura 2A e 2C. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51657/51657fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Misurazioni in vivo di glutammina con sensore FLIPQ-TV3.0_1.5m. (A) Il rapporto venus/mTFP1 di cellule COS7 co-esprimono sensore FLIPQ-TV3.0_1.5m e ASCT2-mCherry. tag mCherry è stato utilizzato per identificare le cellule che esprimono il trasportatore senza interferire i canali di emissione mTFP1 o Venere. Le cellule sono state perfusi con tampone HEPES tamponata di Hank (pH 7,35). Timepoints quando glutammina extracellulare (rosso) e alanina (blu) è stato aggiunto al supporto perfusione sono indicati come scatole sopra il grafico. Linee continue e tratteggiate rappresentano due celle singole misurati nello stesso esperimento. (B) Le intensità di donatore (mTFP1) e accettatore (venus) canalinell&#39;esperimento in (A). I valori sono stati corretti per photobleaching e normalizzato alla linea di base. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="474"><tbody><tr><td> Tempo (min) </td><td> Soluzione A </td><td> Soluzione B </td><td> Soluzione C </td><td> Soluzione D </td><td> Soluzione E </td><td> Soluzione F </td></tr><tr><td> 0 </td><td> valvola ON </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> valvola off </td><td> valvola ON </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> valvola ON </td><td> valvola off </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> valvola off </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> valvola ON </td></tr><tr><td> 8 </td><td> valvola ON </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> valvola off </td></tr&gt; <tr><td> 10 </td><td> valvola off </td><td></td><td> valvola ON </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> valvola ON </td><td></td><td> valvola off </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14 </td><td> valvola off </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> valvola ON </td></tr><tr><td> 16 </td><td> valvola ON </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> valvola off </td></tr><tr><td> 18 </td><td> valvola off </td><td></td><td></td><td> valvola ON </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20 </td><td> valvola ON </td><td></td><td></td><td> valvola off </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 22 </td><td> valvola off </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> valvola ON </td></tr><tr><td> 24 </td><td> valvola ON </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> valvola off </td></tr&gt; <tr><td> 26 </td><td> valvola off </td><td></td><td></td><td></td><td> valvola ON </td><td></td></tr><tr><td> 28 </td><td> valvola ON </td><td></td><td></td><td></td><td> valvola off </td><td></td></tr><tr><td> 30 </td><td> valvola off </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> valvola ON </td></tr><tr><td> 32 </td><td> valvola ON </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> valvola off </td></tr><tr><td> 34 </td><td> valvola off </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> . Tabella 1 Esempio di protocollo perfusione utilizzato in questo esperimento Soluzione A:. 9.7 g di sale HANK (H1387), 0,35 g NaHCO3, 5,96 g HEPES a 1 L pH regolato a 7,35 con NaOH Soluzione B:. Soluzione A + 0,04 mM Gln Soluzione C:.. Soluzione A + 0,2 Gln mM Solution D:. Soluzione A + 1 Gln mM Soluzione E:. Soluzione A + 5 Gln mM Soluzione F: Soluzione A + Ala 5 mM

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Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

In questo articolo verrà illustrato come monitorare le dinamiche di glutammina in cellule vive usando FRET. I sensori geneticamente codificate permettono il monitoraggio in tempo reale delle molecole biologiche con una risoluzione subcellulare. Disegno sperimentale, i dettagli tecnici delle impostazioni sperimentali e considerazioni per le analisi post-sperimentali saranno discussi per i sensori di glutammina geneticamente codificati.

La glutammina Flux Imaging Utilizzando sensori geneticamente codificato

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

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Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

Approcci alla valutazione dello Stress ossidativo tossicologici utilizzando geneticamente codificato Fluorogenic sensori di imaging

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

FIBS-enabled non invasiva Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Bioingegneria

Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental transitions in plants. Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) is the first F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)-based biosensor that allows monitoring of cellular GA levels in vivo. By measuring a fluorescence emission ratio of nuclear localized-GPS1 (nlsGPS1), spatiotemporal mapping of endogenously and exogenously supplied GA gradients in different tissue types is feasible at a cellular scale. This protocol will describe how to image nlsGPS1 emission ratios in three example experiments: steady-state, before-and-after exogenous gibberellin A4 (GA4) treatments, and over a treatment time-course. We also provide methods to analyze nlsGPS1 emission ratios using both Fiji and a commercial three-dimensional (3-D) micrograph visualization and analysis software and explain the limitations and likely pitfalls of using nlsGPS1 to quantify gibberellin levels.

Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) is the first F&#246;rster resonance energy transfer-based biosensor for measuring the cellular levels of gibberellin phytohormones with a high spatiotemporal resolution. This protocol reports on the method to visualize and quantify cellular gibberellin levels using the genetically encoded nlsGPS1 biosensor in Arabidopsis hypocotyls and root tips.

Visualizzazione livelli gibberellina cellulare utilizzando l'energia di risonanza di Förster NlsGPS1 Transfer (FRET) biosensore

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental ...

Biologia dello sviluppo

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Misurazione quantitativa della traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biologia

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Neuroscienze

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

Un'analisi di flusso di calcio High-throughput per studiare i recettori NMDA con sensibilità al glutammato e glicina/D-serina

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical manifestations include weight loss, dyslipidemia, and hypermetabolism; however, it remains unclear how these relate to motor neuron degeneration. Using a Drosophila model of TDP-43 proteinopathy that recapitulates several features of ALS including cytoplasmic inclusions, locomotor dysfunction, and reduced lifespan, we recently identified broad ranging metabolic deficits. Among these, glycolysis was found to be upregulated and genetic interaction experiments provided evidence for a compensatory neuroprotective mechanism. Indeed, despite upregulation of phosphofructokinase, the rate limiting enzyme in glycolysis, an increase in glycolysis using dietary and genetic manipulations was shown to mitigate locomotor dysfunction and increased lifespan in fly models of TDP-43 proteinopathy. To further investigate the effect on TDP-43 proteinopathy on glycolytic flux in motor neurons, a previously reported genetically encoded, FRET-based sensor, FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, was used. This sensor is comprised of a bacterial glucose-sensing domain and cyan and yellow fluorescent proteins as the FRET pair. Upon glucose binding, the sensor undergoes a conformational change allowing FRET to occur. Using FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, glucose uptake was found to be significantly increased in motor neurons expressing TDP-43G298S, an ALS causing variant. Here, we show how to measure glucose uptake, ex vivo, in larval ventral nerve cord preparations expressing the glucose sensor FLII12Pglu-700&#181;&#948;6 in the context of TDP-43 proteinopathy. This approach can be used to measure glucose uptake and assess glycolytic flux in different cell types or in the context of various mutations causing ALS and related neurodegenerative disorders.

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Glucose uptake is increased in Drosophila motor neurons affected by TAR DNA binding protein (TDP-43) proteinopathy, as indicated by a FRET-based, genetically encoded glucose sensor.

Misurazione dell'assorbimento di glucosio in modelli di Drosophila di proteinopatia TDP-43

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

Imaging dal vivo dello stato redox del glutatione mitocondriale nei neuroni primari utilizzando un indicatore raziometrico

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.