Citometria de fosfofluxo intracelular de xenotransplantes derivados de pacientes com leucemia mielóide aguda

Aqui, um método baseado em citometria de fosfofluxo é descrito para analisar a sinalização a jusante das vias mTORC1, JAK/STAT5 e MAPK em células de leucemia mielóide humana aguda xenoenxertadas em camundongos e obtidas de aspirados de medula óssea. Os níveis de p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 e p-ERK1/2 são medidos simultaneamente usando um citômetro de fluxo espectral de última geração com alta sensibilidade.

Para se adaptar e resistir aos tratamentos aprovados, as células da leucemia mieloide aguda (LMA) ativam vias moleculares específicas que levam a alterações na expressão gênica, nos níveis e na atividade das proteínas. Neste protocolo, uma abordagem é relatada para explorar alvos fosforilados a jusante da sinalização oncogênica em LMA: p-STAT5 (Tyr694), p-4EBP1 (Thr37/46), p-RPS6 (Ser240/244) e p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204). Este método permite avaliar como essas vias - principais reguladores da manutenção da estaminalidade, evasão imunológica, síntese de proteínas e adaptação ao estresse oxidativo e metabólico - são moduladas por um ou mais compostos testados em células da medula óssea colhidas de camundongos vivos por aspiração antes e depois da fase de tratamento. Este método minimamente invasivo preserva a integridade celular e reduz o estresse em comparação com as técnicas de esmagamento ósseo, que podem induzir danos e potencialmente afetar os resultados experimentais. Para otimizar a coloração de anticorpos intracelulares para análise por citometria de fluxo, foi desenvolvido um protocolo usando fixação de paraformaldeído e permeabilização de metanol. Essa abordagem garante alta precisão de coloração e minimiza o ruído de fundo, permitindo a detecção confiável de marcadores de sinalização intracelular. Uma das principais vantagens deste protocolo é o desenvolvimento de um painel multiparamétrico de anticorpos, permitindo a avaliação simultânea das quatro vias dentro da mesma amostra. Usando um citômetro de fluxo espectral de última geração com alta sensibilidade, mudanças dinâmicas na ativação da via foram observadas dependendo das condições de tratamento em comparação com os níveis basais de pré-tratamento nos mesmos camundongos. Essa metodologia permite uma análise in vivo precisa da modulação da via de sinalização em amostras de medula óssea de xenoenxerto derivadas de pacientes sem a necessidade de eutanásia dos animais, fornecendo informações valiosas sobre os mecanismos adaptativos das células AML e pode orientar a avaliação de estratégias terapêuticas destinadas a direcionar essas vias para superar a resistência.

A leucemia mieloide aguda (LMA) é uma neoplasia hematológica agressiva caracterizada pelo acúmulo de células progenitoras mieloides imaturas na medula óssea e no sangue periférico. Isso interrompe a hematopoiese normal, levando a citopenia com risco de vida e complicações sistêmicas. Embora os avanços nos esquemas quimioterápicos, terapias-alvo e transplante de células-tronco hematopoiéticas tenham melhorado os resultados para alguns pacientes, em geral, as taxas de sobrevida em 5 anos permanecem em torno de 30%, com pior prognóstico em pacientes mais velhos ou com perfis genéticos adversos¹. Um desafio significativo no manejo da LMA é o surgimento frequente de resistência aos medicamentos, o que contribui para a recidiva e a falha do tratamento². Isso ressalta a importância de obter uma compreensão mais profunda dos mecanismos moleculares e celulares que impulsionam a progressão e a resistência terapêutica da LMA.

Para enfrentar esse desafio, um novo método é apresentado para aspirações de medula óssea acopladas à citometria de fosfofluxo intracelular multiplex, oferecendo uma ferramenta poderosa para investigar as vias de sinalização intracelular em modelos de xenoenxerto derivado de pacientes com LMA (PDX) (Figura 1A, B). Embora a aspiração de medula óssea em modelos PDX tenha sido descrita anteriormente³, esse protocolo foi otimizado para preservar células leucêmicas para análise de fosfofluxo. O objetivo geral deste método é fornecer um procedimento minimamente invasivo que seja aplicável longitudinalmente durante a progressão da leucemia e a resposta terapêutica com resolução de célula única. Ao permitir a amostragem repetida do mesmo animal, essa técnica oferece uma representação mais precisa da evolução da doença sob tratamento. A lógica por trás do desenvolvimento dessa técnica reside na necessidade de uma avaliação dinâmica e de alta resolução da sinalização intracelular em células AML. Os métodos tradicionais, como o Western blotting, requerem grande número de células, não têm resolução de célula única e multiplexação⁴. Em contraste, a citometria de fosfofluxo preserva a heterogeneidade celular e permite a detecção de múltiplas proteínas de sinalização fosforiladas em subpopulações leucêmicas distintas⁵, oferecendo informações importantes sobre a ativação da via em resposta aos tratamentos de LMA.

No centro da biologia da LMA estão as vias de sinalização que regulam a proliferação celular, a sobrevivência e a adaptação metabólica, incluindo a Proteína Quinase Ativada por Mitógeno (MAPK), o Alvo Mecanístico do Complexo de Rapamicina 1 (mTORC1) e as vias de sinalização Janus Quinase / Transdutor de Sinal e Ativador da Transcrição 5 (JAK / STAT5). Além de seus papéis na proliferação e sobrevivência de células leucêmicas, essas vias também estão criticamente envolvidas em processos oncogênicos importantes, como manutenção da estaminalidade, evasão imunológica e adaptação ao estresse oxidativo e metabólico⁴. Além de promover o crescimento e a sobrevivência celular, a conversa cruzada entre essas vias orquestra processos críticos, como transcrição, tradução e metabolismo celular, permitindo que as células AML sustentem seu crescimento e resistam a sinais apoptóticos, mesmo diante de intervenções terapêuticas ^6,7 (Figura 1A).

A via MAPK, que inclui efetores-chave como p-ERK1/2 (quinase regulada por sinal extracelular 1/2), desempenha um papel crucial na integração de sinais extracelulares, como fatores de crescimento e citocinas, para regular a proliferação e sobrevivência celular. A ativação de ERK1/2 ocorre através da cascata RAS (Sarcoma de Rato)-RAF (Fibrossarcoma Acelerado Rapidamente)-MEK (MAPK/ERK Kinase)-ERK, onde RAS-GTP recruta RAF, levando à fosforilação sequencial de MEK1/2 e depois ERK1/2 em Thr202/Tyr204. Uma vez fosforilada, a ERK1/2 dimeriza e transloca para o núcleo, onde fosforila fatores de transcrição como MYC (homólogo oncogene viral da mielocitomatose), ELK1 (proteína ETS Like-1) e AP-1 (proteína ativadora-1), promovendo proliferação celular, bloqueio de diferenciação e sobrevida⁸. Na LMA, mutações em FLT3 (tirosina quinase 3 semelhante a fms), RAS ou KIT freqüentemente resultam em ativação constitutiva de ERK ^9,10 (Figura 1A).

Mutações em FLT3, RAS ou KIT também causam a regulação positiva da sinalização mTORC1, que permite o crescimento de LMA e resistência terapêutica, apoiando processos oncogênicos, como religação metabólica, modulação da síntese de proteínas, biogênese de ribossomos e autofagia¹¹. Através da regulação da tradução do mRNA, o mTORC1 facilita a produção de proteínas oncogênicas e outros fatores essenciais para a progressão da LMA. Um grupo-chave de substratos mTORC1 inclui 4E-BPs (proteínas de ligação ao fator de iniciação eucariótica 4E). Em seu estado hipofosforilado, os 4E-BPs se ligam ao eIF4E (fator de iniciação eucariótica 4E), inibindo a tradução dependente da tampa. A fosforilação de 4E-BP1 em Thr37/46 por mTORC1 causa a liberação de eIF4E, permitindo o início da tradução para mRNAs oncogênicos chave, como MYC, CCND1 (ciclina D1) e MCL-1 (leucemia de células mielóides 1), promovendo assim a proliferação leucêmica e a sobrevida ^8,12. Além disso, a fosforilação de RPS6 em Ser240/244, mediada por S6K1 (proteína ribossômica S6 quinase beta-1) a jusante de mTORC1, aumenta a biogênese do ribossomo e a tradução de mRNA, aumentando a síntese de proteínas necessárias para adaptação metabólica, resistência ao estresse e rápida proliferação ^8,13. Notavelmente, a atividade do mTORC1 está intimamente ligada à adaptação metabólica, uma estratégia crítica de sobrevivência empregada por células AML sob estresse terapêutico 13,14,15 (Figura 1A).

A via JAK/STAT5 é outro eixo de sinalização crucial na LMA, particularmente nos casos com mutações que afetam receptores de citocinas ou mediadores de sinalização como JAK2, FLT3 e CALR (calreticulina)^16,17. O STAT5 é ativado em resposta à sinalização de citocinas por meio de receptores como FLT3 e JAK2. Após a ligação do ligante, Janus quinases associadas (JAKs) fosforilam STAT5 em Tyr694. O STAT5 fosforilado dimeriza e se transloca para o núcleo, onde se liga a sequências específicas de DNA para regular a transcrição de genes envolvidos na sobrevivência, proliferação e diferenciação celular⁸. Na LMA, a ativação constitutiva de STAT5, muitas vezes devido a mutações em FLT3 ou JAK2, leva à expressão persistente de genes que promovem a leucemogênese¹⁸ (Figura 1A).

Além de suas contribuições individuais, essas vias convergem para regular a transcrição e a tradução, moldando o proteoma das células AML de maneiras que promovem a sobrevivência e a resistência. Em particular, a tradução de mRNA está emergindo como um fator-chave na fisiopatologia da LMA, pois permite a rápida produção de proteínas oncogênicas e fatores de resposta ao estresse que permitem que as células da LMA se adaptem aos desafios ambientais e evitem os efeitos das terapias direcionadas. A desregulação da maquinaria de tradução, como fatores de iniciação eucarióticos (eIFs) ou proteínas ribossômicas, tem sido implicada na resistência terapêutica e mau prognóstico na LMA¹⁹. Uma investigação detalhada dos papéis das vias MAPK, mTORC1 e JAK/STAT5 na regulação transcricional e translacional é essencial para obter uma compreensão abrangente dos mecanismos moleculares subjacentes à progressão e resistência à LMA. Tais insights são críticos para identificar novos biomarcadores de resposta ao tratamento e projetar novas estratégias terapêuticas que visam essas vias para superar a resistência. Este artigo fornece um protocolo projetado especificamente para investigar essas redes de sinalização em modelos de xenoenxerto derivado de pacientes com LMA (PDX).

Uma das principais vantagens deste protocolo é a integração da aspiração da medula óssea com a citometria de fosfofluxo intracelular, permitindo uma avaliação dinâmica e minimamente invasiva da ativação da via de sinalização em modelos de xenoenxerto derivado de pacientes com LMA (PDX). Isso é particularmente valioso para monitorar o status de ativação de vias-chave, como MAPK, mTORC1 e JAK/STAT5 em resposta a terapias direcionadas. A combinação dessas técnicas permite a aquisição de uma compreensão abrangente e de alta resolução da biologia da LMA, auxiliando no desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes.

Os experimentos a seguir foram realizados com a aprovação do Comitê de Cuidados com Animais da Universidade McGill (CIHR PJT-186019) e do Conselho de Revisão Institucional do Hospital Geral Judaico (11-047). Neste protocolo, camundongos machos NOD-scid IL2Rg^null-3/GM/SF (NSGS), com idade entre 8 semanas e 6 meses e pesando 20-30 g, foram previamente transplantados com células AML derivadas de pacientes humanos. Os detalhes dos reagentes e do equipamento usado neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Aspiração de medula óssea

CUIDADO: As precauções de segurança em torno do uso de agulhas devem ser seguidas.

1. Analgesia perioperatória: 1-4 h antes da aspiração da medula óssea, injetar nos camundongos por via subcutânea (s.c.) 0,1 mg/kg de buprenorfina de liberação lenta. Isso garante analgesia por até 72 h após o procedimento.
2. Prepare a área cirúrgica sob a capela de fluxo laminar com uma almofada cirúrgica, aparador de cabelo, lâmpada de aquecimento e todo o material necessário para a aspiração da medula óssea (seringas de 25 G, tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 0,5 mL de PBS em gelo, swabs de isopropanol a 70%). Prenda o cone nasal para inalação de isoflurano usando fita adesiva (Figura 2A).
3. Prepare duas seringas de 25 G para cada aspirado, uma para punção óssea ("agulha seca") e outra cujo cubo tenha sido lavado com PBS para aspiração ("agulha lavada").
4. Anestesie o camundongo usando inalação de isoflurano fornecida por um vaporizador certificado, de acordo com as instruções do fabricante e orientações veterinárias. Os procedimentos locais podem variar. Para referência, este protocolo seguiu os procedimentos operacionais padrão da Universidade McGill para anestesia em camundongos²⁰.
5. Confirme a profundidade da anestesia por meio da falta de resposta ao beliscão do pé e ao relaxamento muscular. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento enquanto o animal estiver sob anestesia. Monitore continuamente a frequência respiratória durante a anestesia.
6. Raspe toda a perna onde a aspiração será realizada usando o aparador de cabelo. Desinfetar o local da aspiração (fêmur) com um coxim anti-séptico saturado com álcool isopropílico (Figura 2B).
7. Exponha a superfície articular do fêmur, onde está localizado o local da punção, dobrando o joelho e imobilizando a perna com a mão não dominante. Coloque o polegar na tíbia, o dedo indicador no fêmur e o dedo médio, estabilizando tudo no lado externo dos dois ossos (Figura 2C).
   NOTA: Garanta um posicionamento muito estável da perna usando a mão não dominante para evitar qualquer movimento da perna durante a aspiração que possa levar a falhas ou lesões. Se a imobilização da perna não for estável, reposicione a mão e tente novamente antes de qualquer punção.
8. Enquanto imobiliza com a mão não dominante, desinfete novamente a área do joelho com álcool isopropílico (Figura 2C) para afastar os pelos restantes e melhorar a visualização da estrutura óssea.
9. Use a primeira seringa seca de 25 G para criar um orifício na superfície articular femoral, posicionando-a no meio da articulação do fêmur e girando-a sem forçar (Figura 2D,E). Certifique-se de que a agulha da seringa está completamente alinhada (desvio de 0°) com o eixo longitudinal do fémur para entrar corretamente na medula.
   NOTA: Mantenha esse alinhamento para garantir uma entrada suave sem causar danos desnecessários aos tecidos circundantes. Quando a agulha entra no meio do osso femoral, uma ligeira diminuição na resistência indica penetração bem-sucedida na cavidade medular (Figura 2F). Evite aplicar força excessiva na agulha nesta etapa, pois isso pode causar perda do alinhamento correto, fratura ou trauma. Ao usar um movimento de perfuração rotatório, as chances são maiores de que a agulha siga o caminho de menor resistência e entre na cavidade femoral corretamente. Uma agulha posicionada corretamente dentro do fêmur deve permanecer na vertical mesmo quando a mão que a segura é removida.
10. Uma vez na medula, remova gradualmente a seringa girando ( Figura 2G ) e insira a segunda seringa lavada no orifício feito pela primeira agulha ( Figura 2H, I ).
    NOTA: Uma segunda seringa é usada porque a primeira é frequentemente bloqueada pelo osso durante a perfuração.
11. Aplique vácuo na seringa inserida no fêmur enquanto gira suavemente e retira gradualmente a seringa. Aproximadamente 10-20 μL de medula óssea devem ser visíveis dentro do cubo da seringa ( Figura 2J ).
    NOTA: Se necessário, avance suavemente a agulha dentro do osso para otimizar a extração da medula.
12. Transfira a medula óssea lavando o conteúdo da seringa no tubo de microcentrífuga resfriado contendo 500 μL de PBS (Figura 2K). Mantenha no gelo e prossiga para as etapas 2-3 o mais rápido possível.
13. Aplique uma leve pressão no local da punção por 30 s com um cotonete de isopropanol para estancar qualquer sangramento (Figura 2L).
14. Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação limpa aquecida com uma lâmpada de aquecimento. Monitore a respiração e a mobilidade até que o animal esteja acordado e totalmente recuperado antes de colocá-lo em gaiolas comunitárias com o resto dos camundongos. Verifique se há sinais de sangramento.

2. Coloração de marcadores vivos / mortos e de superfície

NOTA: Mantenha as células congeladas durante todo o procedimento. Preparar misturas principais de soluções de coloração de anticorpos (para as etapas 2.4 e 2.7) antes das etapas 2 e 3, mantendo-as protegidas da luz a 4 °C. Preparar uma nova solução de formaldeído a 1,6% (passo 3.1) e uma solução de metanol a 100% a -20 °C (passo 3.6).

1. Conte as células viáveis usando laranja de acridina / iodeto de propídio (AO / PI) com o contador de células²¹.
2. Transfira o volume apropriado para 1 milhão de células para um novo tubo de 1,5 mL. Se o volume não for suficiente, pegue todo o volume. Agrupe as células e alíquotas restantes em 3 tubos replicados (1 M cada) para coloração de controle de isotipo e 1 tubo para controle não corado.
3. Centrifugue as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Aspirar suavemente e eliminar o sobrenadante utilizando um sistema de aspiração a vácuo.
4. Adicione 200 μL por amostra de solução de coloração de células fluorescentes diluída a 1/100 em PBS para marcar as células mortas. Ressuspenda suavemente as células com a pipeta. Faça o mesmo com os tubos extras para coloração de controle de isotipo.
5. Incube no gelo por 10 min protegido da luz.
6. Centrifugue as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar suavemente e rejeitar o sobrenadante utilizando um sistema de vácuo.
7. Adicione 100 μL por amostra de anticorpo hCD45-BUV395 diluído a 1/100 em PBS contendo 2% de soro fetal bovino para marcar as células hematopoiéticas humanas. Faça o mesmo com os tubos extras mantidos para controles de isotipo.
8. Incubar no gelo por 15 min protegido da luz. Prossiga imediatamente para a etapa 3.

3. Fixação e permeabilização

1. Prepare uma solução fresca de formaldeído / PBS a 1,6%: Para cada amostra, misture 29,5 μL de solução estoque de formaldeído a 37% + 970,5 μL de PBS (considere algum volume extra como precaução). Mantenha a solução de formaldeído / PBS a 1,6% em temperatura ambiente.
   CUIDADO: O formaldeído deve ser manuseado em uma capa química e descartado de acordo com os regulamentos de segurança institucionais.
2. Centrifugue as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar e rejeitar o sobrenadante utilizando um sistema de vácuo.
3. Ressuspender em 1 mL de solução de formaldeído/PBS a 1,6%.
4. Incubar durante 10 min à temperatura ambiente, protegido da luz.
5. Centrifugue as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar e rejeitar o sobrenadante utilizando um sistema de vácuo.
6. Adicione 1 mL de metanol 100% resfriado a -20 °C diretamente no tubo.
7. Incubar amostras a -20 °C durante 30 min protegidas da luz.
   NOTA: Neste ponto, é possível armazenar células fixas e permeabilizadas a -80 °C por até um mês antes da análise.

4. Coloração de fosfofluxo

NOTA: O seguinte painel de anticorpos foi validado usando o citômetro de fluxo equipado com os seguintes lasers: 320 nm, 355 nm, 405 nm, 488 nm, 561 nm, 637 nm e 808 nm. Este painel deve ser revalidado se forem utilizados citómetros diferentes com diferentes configurações de laser e detector.

1. Preparar uma solução de mistura principal de anticorpos com as seguintes diluições num tampão de coloração comercialmente disponível (quadro 1), calculando um volume de 50 μl para cada amostra. Conservar a 4 °C protegido da luz.
2. Para lavagens (etapas 4.8, 4.10), mantenha o PBS no gelo (2 mL para cada amostra).
3. Preparar uma segunda solução da mistura principal para os replicados técnicos de controlo de isotipo no tampão de coloração (quadro 1), calculando um volume de 50 μl para cada amostra. Conservar a 4 °C protegido da luz. Recomenda-se um mínimo de duas amostras de controlo de isotipo para a reprodutibilidade técnica.
4. Centrifugar as células do passo 3.7 a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar e rejeitar o sobrenadante utilizando um sistema de vácuo.
   NOTA: Após a fixação e permeabilização, as células podem parecer mais translúcidas.
5. Adicionar 50 μL de solução de mistura de anticorpos (etapa 4.1) ou solução de mistura de controle de isotipo (etapa 4.2). Ressuspenda suavemente as células com uma pipeta.
6. Incubar todas as amostras durante a noite a 4 °C protegidas da luz.
7. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar e rejeitar o sobrenadante utilizando um sistema de vácuo.
8. Lave com 1000 μL de PBS ressuspendendo suavemente com a pipeta.
9. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar e rejeitar o sobrenadante utilizando um sistema de vácuo.
10. Realize uma segunda lavagem com 1000 μL de PBS ressuspendendo suavemente com a pipeta.
11. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar e rejeitar o sobrenadante utilizando um sistema de vácuo.
12. Ressuspender amostras em 200 μL de PBS. Transferência para tubos ou placas FACS para análise por citometria de fluxo (Figura 3).
13. Prepare controles de compensação de cor única com grânulos incubando 0,1 μL de cada anticorpo com grânulos de compensação, de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).

O projeto experimental visa monitorar o estado de fosforilação de proteínas selecionadas de interesse em diferentes momentos, por exemplo, 1 dia de início do pré-tratamento e 15 dias após o início do tratamento. Essa linha de base serve como um controle crítico para verificar a veracidade das alterações subsequentes na ativação da via de sinalização após o tratamento. Após quinze dias de tratamento, uma segunda comparação é realizada para avaliar a modulação da via em camundongos tratados versus controles tratados com veículo (Figura 4). Essa abordagem em duas etapas permite a distinção entre os efeitos induzidos pelo tratamento e a variabilidade basal.

Para este estudo, foi utilizado um modelo de camundongo AML PDX. Os camundongos foram transplantados com células LMA derivadas de pacientes caracterizadas pelas seguintes mutações: DNMT3^AMR882H com uma fração alélica variante (VAF) de 48%, NPM1^W288fs VAF 36%, FLT3^ITD VAF 10% e IDH2^R140Q VAF 44%. Após o transplante, foram permitidas três semanas para o crescimento do tumor antes de iniciar o tratamento. Os camundongos PDX transplantados com mutante FLT3 foram tratados por quinze dias com um dos três regimes: placebo, gilteritinibe (15 mg / kg por dia) ou uma combinação de venetoclax (50 mg / kg por dia), 5-azacitidina (2,5 mg / kg por dia) e cedarizudina (3 mg / kg por dia) (Figura 4A).

Com relação aos resultados obtidos, vale ressaltar que o tratamento com esquema à base de venetoclax resultou em fosforilação significativamente aumentada de STAT5 e RPS6, sugerindo que essas vias contribuem para a resistência à terapia (Figura 4E). Em contraste, o gilteritinibe, um medicamento direcionado ao FLT3, não reduziu o status de fosforilação dos efetores FLT3 mutantes. É possível que, na amostra de LMA testada, a presença de mutações secundárias adicionais além de FLT3-ITD (por exemplo, IDH2) contribua para a ativação dessas vias ou que o tratamento medicamentoso ao longo de duas semanas resulte na eliminação seletiva de células de LMA com diminuição da sinalização. Como todas as fosfoproteínas analisadas são da mesma população de células, é possível comparar a ativação da fosfoproteína. Neste experimento, a correlação mais forte na coloração de fosfoproteínas parece ser entre p-STAT5 e p-RPS6 (Figura Suplementar 1A), que são regulados positivamente neste grupo experimental após o tratamento (Figura 4E). Parece haver uma relação menor entre p-STAT5 e p-ERK (Figura Suplementar 1B). É importante ressaltar que o tamanho da célula (avaliado usando FSC-A) não é um dos principais contribuintes para a positividade geral do p-STAT5, destacando que a positividade da coloração não é apenas um produto do tamanho da célula (Figura Suplementar 1C). Essa estrutura experimental permite uma avaliação abrangente dos efeitos desses tratamentos na modulação da via de sinalização.

Figura 1: Visualização das vias de sinalização do alvo e a estratégia para sua análise. (A) Visão geral das vias de sinalização envolvendo p-STAT5 (Tyr694), p-4EBP1 (Thr37/46), p-RPS6 (Ser240/244) e p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204). Na via p-STAT5, JAK sofre autofosforilação, aumentando sua atividade catalítica, depois fosforila resíduos específicos de tirosina, criando locais de ancoragem para proteínas STAT. O STAT5 fosforilado (Tyr694) homodimeriza e se transloca para o núcleo, onde se liga a elementos específicos responsivos ao STAT nas regiões promotoras dos genes-alvo. Na cascata RAS-RAF-MEK-ERK, a autofosforilação do receptor FLT3 ou de outros receptores tirosina quinases (RTKs) após a ligação do ligante leva à troca de GDP por GTP em RAS, ativando assim o RAS. O RAS-GTP ativado recruta RAF para a membrana plasmática, onde o RAF sofre uma mudança conformacional e se torna ativo. RAF então fosforila e ativa MEK1 / 2, uma quinase de dupla especificidade, que por sua vez fosforila ERK em resíduos Thr202 / Tyr204. O ERK1/2 ativado se transloca para o núcleo, onde fosforila fatores de transcrição específicos. ERK1/2 também é capaz, por meio de vias de sinalização intermediárias, de aumentar a atividade de mTORC1 e fosforilar eIF4E em locais específicos para aumentar a atividade de tradução. Ativado por nutrientes e fatores de crescimento através de FLT3 e outros RTKs, o mTORC1 fosforila alvos a jusante como S6K1 e 4E-BP1. S6K1, por sua vez, fosforila RPS6, o que aumenta a função do ribossomo e ativa a tradução. A hiperfosforilação de 4E-BP1 libera eIF4E, permitindo a montagem do complexo de iniciação da tradução eIF4F e a ativação da tradução dependente de cap. Todas essas vias estão altamente envolvidas na LMA, contribuindo para adaptações adquiridas, aumentando a proliferação celular, o metabolismo e a resistência a sinais apoptóticos. (B) apresenta as principais etapas do protocolo acoplado de aspiração de medula óssea e coloração de fosfofluxo intracelular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visualização das etapas críticas durante o procedimento de aspiração da medula óssea. A área cirúrgica e os materiais necessários são montados sob uma capela de fluxo laminar. Após a anestesia por inalação de isoflurano (A), a superfície articular femoral é preparada para aspiração (B,C). O osso femoral é puncionado por uma primeira seringa alinhada ao meio do osso femoral (D). É fundamental evitar a aplicação de forte pressão na agulha e, em vez disso, realizar um movimento de perfuração rotativa; Isso geralmente é suficiente para que a agulha perfure a superfície do osso e siga o caminho da cavidade femoral. Em seguida, a medula óssea é aspirada com uma segunda seringa através do local da punção (I,J). Após a transferência do aspirado de medula óssea para um tubo de microcentrífuga (K), uma leve pressão é aplicada para estancar o sangramento na área (L) e o camundongo é colocado em uma gaiola quente e limpa para recuperação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Fluxo de trabalho para a análise da estratégia de gating, incluindo controles de isotipo. (A) representa estratégias de gating para células vivas, exclusão de dupletos e células AML positivas para hCD45. (B) mostra sinais para cada fosfoproteína em marrom e controles de isotipo em preto (duas réplicas biológicas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Fluxo de trabalho para a detecção e análise de fosfoproteínas intracelulares após imuno-estanquinação de células viáveis de LMA da medula óssea. (A) Camundongos NSG-SGM3 enxertados com células AML doadas por pacientes foram tratados com veículo (controle) ou venetoclax, 5-azacitidina e cedazuridina (vene / aza / CDZ) ou gilteritinibe. Após 15 dias, os aspirados de medula óssea (MO) foram processados. (B) representa a estratégia de gating para a análise de células LMA viáveis (por exemplo, hCD45/Zombie-NIR positivo) 15 dias após o tratamento. (C,D) representam a normalização do sinal para cada um dos fosfoanticorpos, conforme indicado, em 10.000 células AML isoladas de camundongos tratados com venetoclax/5-azacitidina/cedazuridina ou veículo (B) ou gilteritinibe ou veículo (C). Os traços representam os sinais em células AML isoladas do camundongo controle tratado com veículo (azul claro), vene/aza/CDZ (vermelho) ou gilteritinibe (roxo). (E) O histograma representa as mudanças médias nas intensidades de coloração para cada fosfoproteína testada em células vivas AML CD45⁺ humanas de três camundongos e SD. As barras de erro representam o desvio padrão. Os asteriscos indicam diferenças significativas nas intensidades de coloração avaliadas por ANOVA com valores de p abaixo de 0,05 (*) e 0,01 (**). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Lista de diluições otimizadas para anticorpos.

Figura suplementar 1: Comparação de p-STAT5, p-RPS6, p-ERK1/2 e FSC-A em uma amostra representativa de AML PDX. Esta figura mostra um exemplo da relação entre p-STAT5, p-ERK e p-RPS6 em camundongo "E9" no dia 15 de tratamento com venetoclax / 5-azacitidina / cedazuridina (resultado da Figura 4C). Nesta amostra, a correlação mais forte na coloração de fosfoproteínas parece ser entre p-STAT5 e p-RPS6 (A), que são regulados positivamente neste grupo experimental após o tratamento (Figura 4E). Parece haver uma relação menor entre p-STAT5 e p-ERK (B). É importante ressaltar que o tamanho da célula (avaliado usando FSC-A) não é um dos principais contribuintes para a positividade geral do p-STAT5, destacando que a positividade da coloração não é apenas um produto do tamanho da célula (C). Clique aqui para baixar este arquivo.

Etapas críticas
O uso de técnicas de base imunológica no estudo de vias de sinalização complexas por meio da detecção específica de fosfoproteínas requer que as variáveis experimentais sejam rigidamente controladas²², o preparo da amostra seja meticuloso e técnicas complementares sejam empregadas para validação. A integração dessas práticas garante a reprodutibilidade, precisão e robustez dos dados, contribuindo para conclusões biológicas mais confiáveis. Esses esforços não apenas aumentam o rigor científico do método, mas também ampliam sua aplicabilidade em estudos complexos de sinalização e regulação celular. A anestesia adequada e o manuseio cuidadoso são essenciais para minimizar o estresse fisiológico, que pode alterar significativamente os resultados experimentais, particularmente em estudos focados em respostas imunes ou vias de sinalização. Garantir protocolos analgésicos apropriados ajuda ainda mais a manter o bem-estar animal, evitando o estresse relacionado à dor que pode interferir nos dados. A manutenção de condições assépticas durante o procedimento é vital para prevenir infecções, que podem levar a respostas inflamatórias e potencialmente confundir os resultados experimentais. Isso envolve esterilizar equipamentos, usar luvas limpas e desinfetar completamente o local da aspiração.

As proteínas fosforiladas são altamente suscetíveis à desfosforilação por fosfatases durante a manipulação de espécimes biológicos ^22,23. Para preservar os estados de fosforilação durante o processamento, a fixação imediata é essencial. Dois métodos diferentes de fixação/permeabilização foram testados: um kit citofixo/citoperm e o método comum de formaldeído/metanol descrito no protocolo. Entre estes, o método à base de metanol forneceu resultados mais limpos com sinais de fluorescência mais brilhantes, tornando-o a escolha preferida. Após a fixação, as amostras podem ser armazenadas a curto prazo a -20 °C ou a longo prazo a -80 °C. Em experimentos, amostras fixas armazenadas por até três meses a -80 ° C produziram resultados consistentes. Para coloração de anticorpos, uma incubação noturna pode aumentar a precisão, especialmente para mudanças sutis de fosforilação, embora isso dependa do experimento específico e dos efeitos do medicamento sob investigação. Uma incubação mais curta de 1 h também foi testada em gelo, protegida da luz, o que produziu resultados aceitáveis em certos casos. Para garantir uma avaliação precisa do ruído de fundo, os controles de isotipo são recomendados como referência para ligação não específica, conforme mostrado na Figura 3.

Modificações e solução de problemas da técnica
Para desenvolver proficiência técnica, os estagiários do nosso grupo praticam a técnica de inserção de agulhas em camundongos sacrificados, onde a colocação adequada pode ser confirmada por dissecação. O procedimento de animais vivos é realizado de forma mais eficiente por dois operadores, onde um pode se concentrar nas aspirações enquanto um assistente se dedica às tarefas de monitoramento de animais e manuseio de amostras. Em casos raros em que não é possível obter uma aspiração após várias tentativas, é aconselhável abortar o procedimento, pois o risco de lesão aumenta a cada tentativa. O monitoramento pós-procedimento dos animais é igualmente importante. A observação de sinais de infecção, dor ou estresse garante o bem-estar dos camundongos e a confiabilidade do estudo. As condições de moradia devem apoiar a recuperação, com cama e nutrição adequadas para minimizar os estressores externos.

Para análise por citometria de fluxo, recomenda-se o processamento simultâneo de todas as amostras fixas e preservadas de diferentes dias de aspiração da medula óssea. Variações na reidratação e coloração da amostra devido a diferenças nos dias de manuseio ou operadores podem afetar a sensibilidade à fluorescência detectada pelo citômetro. Para garantir resultados consistentes, otimize as configurações de tensão do citômetro para manter todas as amostras coradas dentro da faixa de detecção antes de prosseguir. A proteína p-4EBP1 conjugada com Alexa Fluor 488 exibe o maior brilho entre os marcadores neste painel, tornando-a uma referência confiável para definir a faixa máxima de detecção. Embora o painel de anticorpos apresentado neste protocolo não exija ajustes de compensação, isso pode variar dependendo do citômetro de fluxo espectral usado.

Limitações
Uma das principais limitações dessa técnica é o número de células extraídas durante a aspiração da medula óssea. Para garantir resultados confiáveis, é essencial corar células suficientes para analisar um mínimo de aproximadamente 10.000 células por amostra. A análise de poucas células pode levar a variações significativas entre as amostras, comprometendo a precisão e a interpretabilidade dos dados. Garantir um número adequado de células é fundamental para estudos mecanicistas robustos e reprodutíveis.

Para análise dos dados, é aplicada a estratégia de gating ilustrada na Figura 3A . Primeiro, após a exclusão de dupletos, as células de interesse são identificadas usando um anticorpo CD45 humano acoplado ao BUV395. Em seguida, o bloqueio de células vivas é feito usando o Zombie NIR. Finalmente, a intensidade média de fluorescência (MFI) é calculada para cada fosfoproteína (Figura 3B). Todas as células analisadas para todas as proteínas fosforiladas foram controladas usando a mesma estratégia, garantindo consistência e comparabilidade entre as populações de células AML.

Outra limitação desse método é o potencial de ruído de fundo, que pode surgir de ligação inespecífica de anticorpos, lavagem insuficiente, autofluorescência celular ou permeabilização inadequada. Isso pode afetar a especificidade do sinal e reduzir a precisão da análise de citometria de fosfofluxo. Para usuários que encontram esses problemas, uma etapa de lavagem adicional é recomendada para reduzir o ruído de fundo, e reagentes de bloqueio de Fc podem ser usados para minimizar a ligação inespecífica. Além disso, a fluorescência de células mortas pode interferir nos resultados, tornando essencial o uso de corantes de viabilidade. É importante ressaltar que, para uma análise precisa, o número de células analisadas não deve ser inferior a 500 células AML para garantir resultados confiáveis e reprodutíveis. Também é importante garantir que um número semelhante de células seja usado durante a coloração para manter a consistência entre as amostras. Apesar dessas limitações, a otimização cuidadosa dos controles e estratégias de gating pode aumentar a confiabilidade do método.

Significado da técnica
A técnica de aspiração de medula óssea já foi publicada³; No entanto, uma técnica atualizada está incluída neste protocolo com uma explicação destacando duas vantagens: imobilização aprimorada e o uso de uma abordagem de duas agulhas para aumentar a precisão e a consistência na aspiração da medula óssea, evitando qualquer problema de bloqueio da agulha com fragmentos ósseos. Para estudos longitudinais, a aspiração femoral pode ser realizada várias vezes, fornecendo um método poderoso para rastrear alterações biológicas ao longo do tempo em animais individuais. Recomenda-se um intervalo mínimo de recuperação de um mês entre as aspirações no mesmo fêmur para permitir a cicatrização óssea suficiente e a regeneração da medula óssea. Ao usar o fêmur contralateral, um intervalo mais curto de uma semana é suficiente para garantir que o camundongo se recupere dos efeitos da analgesia e da anestesia sem introduzir estresse indevido ou variabilidade fisiológica.

Ao todo, esta técnica combinada de aspiração de medula óssea murina e citometria de fluxo fornece informações valiosas sobre as principais vias de sinalização, incluindo JAK / p-STAT5, mTORC1 / p-4EBP1, mTORC1 / p-RPS6 e MEK / p-ERK1 / 2. Essas vias desempenham papéis significativos na resistência ao tratamento na LMA. Essa técnica permite a amostragem repetida do mesmo animal, permitindo o monitoramento em tempo real da progressão da doença e da resposta à terapia no nível de uma única célula.

A citometria de fosfofluxo captura eventos de fosforilação e preserva a heterogeneidade celular ^4,23,24. Isso o torna particularmente valioso para entender as respostas celulares dinâmicas à terapia em subpopulações leucêmicas específicas.

Aplicações futuras
Este protocolo fornece uma ferramenta valiosa para estudar os mecanismos subjacentes de adaptação ao tratamento e o surgimento de resistência na LMA, abrindo caminho para insights mais profundos e possíveis avanços terapêuticos. Estudos futuros podem integrar essa abordagem com transcriptômica ou proteômica de célula única para dissecar ainda mais os mecanismos moleculares que impulsionam a resistência e a progressão da doença²⁵. Além disso, a aplicação desse método a outras neoplasias hematológicas ou condições inflamatórias pode ampliar seu impacto na pesquisa translacional.

Ao refinar esse protocolo e abordar suas limitações, essa abordagem pode se tornar um método padrão para estudar a sinalização de fosfoproteínas em doenças hematológicas, auxiliando no desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes. Em conclusão, este protocolo fornece uma ferramenta valiosa para estudar os mecanismos subjacentes de adaptação ao tratamento e o surgimento de resistência na LMA, abrindo caminho para insights mais profundos e possíveis avanços terapêuticos.

Os autores não têm nada a divulgar.

Este trabalho foi apoiado por Subsídios de Transição para LH e FEM da Fundação Cole e subsídios da Sociedade de Leucemia e Linfoma do Canadá e dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (PJT-186019) para LH e FEM. FEM É UM Cientista Clínico FRSQ Junior 2 e LH é um Cientista FRSQ Junior 2. VG possui uma bolsa de doutorado da Cole Foundation. A Figure 1 foi criada com o BioRender sob um contrato de licença. Os gráficos de citometria de fluxo foram gerados usando o software FlowJo. Agradecimentos especiais ao Dr. Colin Crist e Victoria Richard por conceder acesso às suas instalações de cirurgia animal.