Citometría de fosfoflujo intracelular de xenotrasplantes derivados de pacientes con leucemia mieloide aguda

Aquí, se describe un método basado en citometría de fosfoflujo para analizar la señalización aguas abajo de las vías mTORC1, JAK/STAT5 y MAPK en células de leucemia mieloide humana aguda xenoinjertadas en ratones y obtenidas de aspirados de médula ósea. Los niveles de p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 y p-ERK1/2 se miden simultáneamente utilizando un citómetro de flujo espectral de última generación con alta sensibilidad.

Para adaptarse y resistir los tratamientos aprobados, las células de leucemia mieloide aguda (LMA) activan vías moleculares específicas que conducen a cambios en la expresión génica, los niveles de proteínas y la actividad. En este protocolo, se informa de un enfoque para explorar objetivos fosforilados aguas abajo de la señalización oncogénica en la LMA: p-STAT5 (Tyr694), p-4EBP1 (Thr37/46), p-RPS6 (Ser240/244) y p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204). Este método permite evaluar cómo estas vías, principales reguladores del mantenimiento de la madre, la evasión inmunitaria, la síntesis de proteínas y la adaptación al estrés oxidativo y metabólico, son moduladas por uno o más compuestos probados en células de médula ósea recolectadas de ratones vivos por aspiración antes y después de la fase de tratamiento. Este método mínimamente invasivo preserva la integridad celular y reduce el estrés en comparación con las técnicas de trituración de huesos, que pueden inducir daños y afectar potencialmente los resultados experimentales. Para optimizar la tinción de anticuerpos intracelulares para el análisis por citometría de flujo, se desarrolló un protocolo que utiliza la fijación de paraformaldehído y la permeabilización de metanol. Este enfoque garantiza una alta precisión de tinción y minimiza el ruido de fondo, lo que permite una detección fiable de los marcadores de señalización intracelular. Una de las principales ventajas de este protocolo es el desarrollo de un panel de anticuerpos multiparamétrico, que permite la evaluación simultánea de las cuatro vías dentro de una misma muestra. Utilizando un citómetro de flujo espectral de última generación con alta sensibilidad, se observaron cambios dinámicos en la activación de la vía en función de las condiciones del tratamiento en comparación con los niveles basales previos al tratamiento en los mismos ratones. Esta metodología permite un análisis preciso in vivo de la modulación de la vía de señalización en muestras de médula ósea de xenoinjertos derivados de pacientes sin necesidad de eutanasia de los animales, lo que proporciona información valiosa sobre los mecanismos adaptativos de las células de LMA y puede guiar la evaluación de estrategias terapéuticas destinadas a dirigirse a estas vías para superar la resistencia.

La leucemia mieloide aguda (LMA) es una neoplasia hematológica maligna agresiva caracterizada por la acumulación de células progenitoras mieloides inmaduras en la médula ósea y la sangre periférica. Esto interrumpe la hematopoyesis normal, lo que provoca citopenia potencialmente mortal y complicaciones sistémicas. Aunque los avances en los regímenes quimioterapéuticos, las terapias dirigidas y el trasplante de células madre hematopoyéticas han mejorado los resultados para algunos pacientes, en general, las tasas de supervivencia a 5 años se mantienen en torno al 30%, con un peor pronóstico en los pacientes de edad avanzada o con perfiles genéticos adversos¹. Un desafío importante en el tratamiento de la LMA es la aparición frecuente de resistencia a los medicamentos, que contribuye a la recaída y al fracaso del tratamiento². Esto subraya la importancia de obtener una comprensión más profunda de los mecanismos moleculares y celulares que impulsan la progresión y la resistencia terapéutica de la LMA.

Para abordar este desafío, se presenta un nuevo método para las aspiraciones de médula ósea junto con la citometría de fosfoflujo intracelular multiplex, que ofrece una poderosa herramienta para investigar las vías de señalización intracelular en modelos de xenoinjertos derivados de pacientes con LMA (PDX) (Figura 1A,B). Aunque la aspiración de médula ósea en modelos PDX ha sido descrita previamente³, este protocolo ha sido optimizado para preservar células leucémicas para el análisis de fosfoflujo. El objetivo general de este método es proporcionar un procedimiento mínimamente invasivo que sea aplicable longitudinalmente durante la progresión de la leucemia y la respuesta terapéutica con resolución de una sola célula. Al permitir el muestreo repetido del mismo animal, esta técnica ofrece una representación más precisa de la evolución de la enfermedad bajo tratamiento. La justificación del desarrollo de esta técnica radica en la necesidad de una evaluación dinámica y de alta resolución de la señalización intracelular en las células de LMA. Los métodos tradicionales, como la transferencia occidental, requieren un gran número de células, carecen de resolución de una sola célula y multiplexación⁴. Por el contrario, la citometría de fosfoflujo preserva la heterogeneidad celular y permite la detección de múltiples proteínas de señalización fosforiladas en distintas subpoblaciones leucémicas⁵, lo que ofrece información clave sobre la activación de la vía en respuesta a los tratamientos de LMA.

Un elemento central de la biología de la LMA son las vías de señalización que regulan la proliferación, la supervivencia y la adaptación metabólica celulares, incluidas las vías de señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), el objetivo mecanicista del complejo de rapamicina 1 (mTORC1) y las vías de señalización Janus Kinasa/Transductor de señal y activador de la transcripción 5 (JAK/STAT5). Más allá de su papel en la proliferación y supervivencia de las células leucémicas, estas vías también están implicadas de forma crítica en procesos oncogénicos clave como el mantenimiento de las madres, la evasión inmunitaria y la adaptación al estrés oxidativo y metabólico⁴. Además de promover el crecimiento celular y la supervivencia, la comunicación cruzada entre estas vías orquesta procesos críticos como la transcripción, la traducción y el metabolismo celular, lo que permite que las células de LMA mantengan su crecimiento y resistan las señales apoptóticas, incluso frente a intervenciones terapéuticas ^6,7 (Figura 1A).

La vía MAPK, que incluye efectores clave como p-ERK1/2 (quinasa 1/2 regulada por señales extracelulares), desempeña un papel crucial en la integración de señales extracelulares, como factores de crecimiento y citocinas, para regular la proliferación y supervivencia celular. La activación de ERK1/2 se produce a través de la cascada RAS (sarcoma de rata)-RAF (fibrosarcoma rápidamente acelerado)-MEK (MAPK/ERK Kinase)-ERK, donde RAS-GTP recluta RAF, lo que conduce a la fosforilación secuencial de MEK1/2 y luego ERK1/2 en Thr202/Tyr204. Una vez fosforilada, ERK1/2 se dimeriza y se transloca al núcleo, donde fosforila factores de transcripción como MYC (homólogo de oncogén viral de mielocitomatosis), ELK1 (proteína ETS Like-1) y AP-1 (proteína activadora-1), promoviendo la proliferación celular, el bloqueo de la diferenciación y la supervivencia⁸. En la LMA, las mutaciones en FLT3 (tirosina cinasa 3 similar a fms), RAS o KIT frecuentemente dan lugar a la activación constitutiva de ERK ^9,10 (Figura 1A).

Las mutaciones en FLT3, RAS o KIT también causan la regulación positiva de la señalización de mTORC1, lo que permite el crecimiento de la LMA y la resistencia terapéutica al apoyar procesos oncogénicos como el recableado metabólico, la modulación de la síntesis de proteínas, la biogénesis de ribosomas y la autofagia¹¹. A través de la regulación de la traducción del ARNm, mTORC1 facilita la producción de proteínas oncogénicas y otros factores esenciales para la progresión de la LMA. Un grupo clave de sustratos mTORC1 incluye 4E-BP (proteínas de unión al factor de iniciación eucariota 4E). En su estado hipofosforilado, las 4E-BP se unen a eIF4E (factor de iniciación eucariota 4E), inhibiendo la traducción dependiente de la tapa. La fosforilación de 4E-BP1 en Thr37/46 por mTORC1 provoca la liberación de eIF4E, lo que permite el inicio de la traducción de ARNm oncogénicos clave, como MYC, CCND1 (ciclina D1) y MCL-1 (leucemia de células mieloides 1), promoviendo así la proliferación leucémica y la supervivencia ^8,12. Además, la fosforilación de RPS6 en Ser240/244, mediada por S6K1 (proteína ribosómica S6 quinasa beta-1) aguas abajo de mTORC1, mejora la biogénesis del ribosoma y la traducción del ARNm, aumentando la síntesis de proteínas necesarias para la adaptación metabólica, la resistencia al estrés y la rápida proliferación ^8,13. En particular, la actividad de mTORC1 está estrechamente relacionada con la adaptación metabólica, una estrategia de supervivencia crítica empleada por las células de LMA bajo estrés terapéutico 13,14,15 (Figura 1A).

La vía JAK/STAT5 es otro eje de señalización crucial en la LMA, particularmente en casos con mutaciones que afectan a los receptores de citocinas o mediadores de señalización como JAK2, FLT3 y CALR (calreticulina)^16,17. STAT5 se activa en respuesta a la señalización de citocinas a través de receptores como FLT3 y JAK2. Tras la unión del ligando, las quinasas Janus asociadas (JAKs) fosforilan STAT5 en Tyr694. La STAT5 fosforilada se dimeriza y se transloca al núcleo, donde se une a secuencias específicas de ADN para regular la transcripción de genes implicados en la supervivencia, proliferación y^{diferenciación celular}. En la LMA, la activación constitutiva de STAT5, a menudo debida a mutaciones en FLT3 o JAK2, conduce a la expresión persistente de genes que promueven la leucogénesis¹⁸ (Figura 1A).

Más allá de sus contribuciones individuales, estas vías convergen para regular tanto la transcripción como la traducción, dando forma al proteoma de las células de LMA de manera que promueven la supervivencia y la resistencia. En particular, la traducción del ARNm se está convirtiendo en un factor clave en la fisiopatología de la LMA, ya que permite la producción rápida de proteínas oncogénicas y factores de respuesta al estrés que permiten a las células de LMA adaptarse a los desafíos ambientales y evadir los efectos de las terapias dirigidas. La desregulación de la maquinaria de traducción, como los factores de iniciación eucariotas (eIFs) o las proteínas ribosómicas, se ha implicado en la resistencia terapéutica y el mal pronóstico en la LMA¹⁹. Una investigación detallada de las funciones de las vías MAPK, mTORC1 y JAK/STAT5 en la regulación transcripcional y traduccional es esencial para obtener una comprensión completa de los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión y resistencia de la LMA. Estos conocimientos son fundamentales para identificar nuevos biomarcadores de la respuesta al tratamiento y diseñar nuevas estrategias terapéuticas que se dirijan a estas vías para superar la resistencia. Este artículo proporciona un protocolo diseñado específicamente para investigar estas redes de señalización en modelos de xenoinjertos derivados de pacientes con LMA (PDX).

Una de las principales ventajas de este protocolo es la integración de la aspiración de médula ósea con la citometría de fosfoflujo intracelular, lo que permite una evaluación dinámica y mínimamente invasiva de la activación de la vía de señalización en modelos de xenoinjertos derivados de pacientes con LMA (PDX). Esto es particularmente valioso para monitorear el estado de activación de vías clave como MAPK, mTORC1 y JAK/STAT5 en respuesta a terapias dirigidas. La combinación de estas técnicas permite la adquisición de una comprensión completa y de alta resolución de la biología de la LMA, lo que en última instancia ayuda en el desarrollo de estrategias terapéuticas más efectivas.

Los siguientes experimentos se realizaron con la aprobación del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad McGill (CIHR PJT-186019) y la Junta de Revisión Institucional del Hospital General Judío (11-047). En este protocolo, ratones machos NOD-scid IL2Rg^null-3/GM/SF (NSGS), de 8 semanas a 6 meses de edad y con un peso de 20 a 30 g, fueron trasplantados previamente con células de LMA derivadas de pacientes humanos. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aspiración de médula ósea

PRECAUCIÓN: Se deben seguir las precauciones de seguridad relacionadas con el uso de agujas.

1. Analgesia perioperatoria: 1-4 h antes de la aspiración de médula ósea, inyectar a los ratones por vía subcutánea (s.c.) 0,1 mg/kg de buprenorfina de liberación lenta. Esto asegura la analgesia hasta 72 horas después del procedimiento.
2. Prepare el área quirúrgica debajo de la campana de flujo laminar con una almohadilla quirúrgica, un cortapelos, una lámpara de calentamiento y todo el material necesario para la aspiración de médula ósea (jeringas de 25 G, tubos de microcentrífuga de 1,5 mL que contienen 0,5 mL de PBS en hielo, hisopos de isopropanol al 70%). Asegure el cono de la nariz para la inhalación de isoflurano con cinta adhesiva (Figura 2A).
3. Prepare dos jeringas de 25 g para cada aspirado, una para la punción ósea ("aguja seca") y otra cuyo cubo se haya enjuagado con PBS para la aspiración ("aguja enjuagada").
4. Anestesia al ratón mediante la inhalación de isoflurano administrada por un vaporizador certificado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las pautas veterinarias. Los procedimientos locales pueden variar. Como referencia, este protocolo siguió los procedimientos operativos estándar de la Universidad McGill para la anestesia en ratones²⁰.
5. Confirme la profundidad de la anestesia a través de la falta de respuesta al pellizco del pie y la relajación muscular. Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras el animal está bajo anestesia. Monitorear continuamente la frecuencia respiratoria durante la anestesia.
6. Afeita toda la pierna donde se realizará la aspiración con la recortadora de pelo. Desinfecte el sitio de aspiración (fémur) con una almohadilla antiséptica saturada con alcohol isopropílico (Figura 2B).
7. Exponga la superficie articular del fémur, donde se encuentra el sitio de punción, doblando la rodilla e inmovilizando la pierna con la mano no dominante. Coloque el pulgar en la tibia, el dedo índice en el fémur y el dedo medio, estabilizando todo lo que hay en el lado exterior de los dos huesos (Figura 2C).
   NOTA: Asegúrese de que la pierna esté muy bien posicionada con la mano no dominante para evitar cualquier movimiento de la pierna durante la aspiración que pueda provocar un fallo o una lesión. Si la inmovilización de la pierna no es estable, vuelva a colocar la mano y vuelva a intentarlo antes de cualquier pinchazo.
8. Mientras se inmoviliza con la mano no dominante, desinfecte de nuevo la zona de la rodilla con alcohol isopropílico (Figura 2C) para alejar los pelos restantes y mejorar la visualización de la estructura ósea.
9. Utilice la primera jeringa seca de 25 G para crear un orificio en la superficie articular femoral colocándola en el centro de la articulación del fémur y girándola sin forzar (Figura 2D,E). Asegúrese de que la aguja de la jeringa esté completamente alineada (0° de desviación) con el eje longitudinal del fémur para entrar correctamente en la médula.
   NOTA: Mantenga esta alineación para garantizar una entrada suave sin causar daños innecesarios a los tejidos circundantes. Cuando la aguja entra en el centro del hueso femoral, una ligera disminución de la resistencia indica una penetración exitosa en la cavidad de la médula (Figura 2F). Evite aplicar una fuerza excesiva sobre la aguja en este paso, ya que puede causar la pérdida de la alineación correcta, fractura o traumatismo. Al utilizar un movimiento de perforación rotatorio, hay mayores posibilidades de que la aguja siga el camino de menor resistencia y entre correctamente en la cavidad femoral. Una aguja correctamente colocada dentro del fémur debe permanecer vertical incluso cuando se retira la mano que la sostiene.
10. Una vez en la médula, retire gradualmente la jeringa girándola (Figura 2G) e inserte la segunda jeringa enjuagada en el orificio hecho por la primera aguja (Figura 2H, I).
    NOTA: Se utiliza una segunda jeringa porque la primera suele estar bloqueada por el hueso durante la perforación.
11. Aplique vacío a la jeringa insertada dentro del fémur mientras gira suavemente y retira gradualmente la jeringa. Aproximadamente 10-20 μL de médula ósea deben ser visibles dentro del cubo de la jeringa (Figura 2J).
    NOTA: Si es necesario, vuelva a avanzar suavemente la aguja dentro del hueso para optimizar la extracción de la médula.
12. Transfiera la médula ósea enjuagando el contenido de la jeringa en el tubo de microcentrífuga refrigerado que contiene 500 μL de PBS (Figura 2K). Manténgalo en hielo y continúe con los pasos 2 y 3 lo antes posible.
13. Aplique una presión suave en el sitio de punción durante 30 s con un hisopo de isopropanol para detener cualquier sangrado (Figura 2L).
14. Coloque el ratón en una jaula de recuperación limpia calentada con una lámpara de calentamiento. Vigile la respiración y la movilidad hasta que el animal esté despierto y completamente recuperado antes de colocarlo en jaulas comunes con el resto de los ratones. Revisa si hay signos de sangrado.

2. Tinción de marcadores vivos/muertos y de superficie

NOTA: Mantenga las células en hielo durante todo el procedimiento. Prepare mezclas maestras de soluciones de tinción de anticuerpos (para los pasos 2.4 y 2.7) antes de los pasos 2 y 3, manteniéndolas a 4 °C protegidas de la luz. Prepare una solución fresca de formaldehído al 1,6% (paso 3.1) y una solución de metanol al 100% mantenida a -20 °C (paso 3.6).

1. Cuente las células viables utilizando naranja de acridina/yoduro de propidio (AO/PI) con el contador de células²¹.
2. Transfiera el volumen adecuado para 1 millón de células a un nuevo tubo de 1,5 ml. Si el volumen no es suficiente, tome todo el volumen. Agrupe las células restantes y las alícuotas en 3 tubos replicados (1 M cada uno) para la tinción de control de isotipo y 1 tubo para el control sin tinción.
3. Centrifugar las celdas a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire suavemente y deseche el sobrenadante mediante un sistema de aspiración endouterina.
4. Añadir 200 μL por muestra de solución de tinción de células fluorescentes diluida 1/100 en PBS para etiquetar las células muertas. Vuelva a suspender suavemente las células con la pipeta. Haga lo mismo con los tubos adicionales para la tinción de control de isotipos.
5. Incubar en hielo durante 10 min protegido de la luz.
6. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire suavemente y deseche el sobrenadante mediante un sistema de vacío.
7. Añadir 100 μL por muestra de anticuerpo hCD45-BUV395 diluido 1/100 en PBS que contenga un 2% de suero fetal bovino para marcar las células hematopoyéticas humanas. Haga lo mismo con los tubos adicionales reservados para los controles de isotipo.
8. Incubar en hielo durante 15 min protegido de la luz. Continúe inmediatamente con el paso 3.

3. Fijación y permeabilización

1. Prepare una nueva solución de formaldehído/PBS al 1,6%: Para cada muestra, mezcle 29,5 μL de solución madre de formaldehído al 37% + 970,5 μL de PBS (tenga en cuenta un poco de volumen adicional como precaución). Mantenga la solución de formaldehído/PBS al 1,6% a temperatura ambiente.
   PRECAUCIÓN: El formaldehído debe manipularse en una cubierta química y desecharse de acuerdo con las normas de seguridad institucionales.
2. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire y deseche el sobrenadante mediante un sistema de vacío.
3. Vuelva a suspender en 1 mL de solución de formaldehído/PBS al 1,6%.
4. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
5. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire y deseche el sobrenadante mediante un sistema de vacío.
6. Añadir 1 mL de metanol 100% enfriado a -20 °C directamente en el tubo.
7. Incubar las muestras a -20 °C durante 30 min protegidas de la luz.
   NOTA: En este punto, es posible almacenar celdas fijas y permeabilizadas a -80 °C hasta un mes antes del análisis.

4. Tinción por fosfoflujo

NOTA: El siguiente panel de anticuerpos se validó utilizando el citómetro de flujo equipado con los siguientes láseres: 320 nm, 355 nm, 405 nm, 488 nm, 561 nm, 637 nm y 808 nm. Este panel debe volver a validarse si se utilizan diferentes citómetros con diferentes configuraciones de láser y detectores.

1. Prepare una solución de mezcla maestra de anticuerpos con las siguientes diluciones en un tampón de tinción disponible comercialmente (Tabla 1), calculando un volumen de 50 μL para cada muestra. Mantener a 4 °C protegido de la luz.
2. Para los lavados (pasos 4.8, 4.10), mantenga el PBS en hielo (2 ml por cada muestra).
3. Preparar una segunda solución de mezcla maestra para el control de isotipo que se replica técnicamente en el tampón de tinción (Tabla 1), calculando un volumen de 50 μL para cada muestra. Mantener a 4 °C protegido de la luz. Se recomienda un mínimo de dos muestras de control de isotipo para la reproducibilidad técnica.
4. Centrifugar las células del paso 3.7 a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire y deseche el sobrenadante mediante un sistema de vacío.
   NOTA: Después de la fijación y permeabilización, las células pueden parecer más translúcidas.
5. Añadir 50 μL de solución de mezcla de anticuerpos (paso 4.1) o de solución de mezcla de control de isotipo (paso 4.2). Vuelva a suspender suavemente las células con una pipeta.
6. Incubar todas las muestras durante la noche a 4 °C protegidas de la luz.
7. Centrifugar las celdas a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire y deseche el sobrenadante mediante un sistema de vacío.
8. Lavar con 1000 μL de PBS resuspendiendo suavemente con la pipeta.
9. Centrifugar las celdas a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire y deseche el sobrenadante mediante un sistema de vacío.
10. Realice un segundo lavado con 1000 μL de PBS resuspendiendo suavemente con la pipeta.
11. Centrifugar las celdas a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire y deseche el sobrenadante mediante un sistema de vacío.
12. Vuelva a suspender las muestras en 200 μL de PBS. Transfiera a tubos o placas FACS para su análisis mediante citometría de flujo (Figura 3).
13. Prepare controles de compensación de un solo color con perlas incubando 0,1 μL de cada anticuerpo con perlas de compensación, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).

El diseño experimental tiene como objetivo monitorear el estado de fosforilación de proteínas seleccionadas de interés en diferentes puntos temporales, por ejemplo, 1 día antes del inicio del tratamiento y 15 días después del inicio del tratamiento. Esta línea de base sirve como un control crítico para verificar la veracidad de los cambios posteriores en la activación de la vía de señalización después del tratamiento. Después de quince días de tratamiento, se realiza una segunda comparación para evaluar la modulación de la vía en ratones tratados frente a los controles tratados con vehículo (Figura 4). Este enfoque de dos pasos permite distinguir los efectos inducidos por el tratamiento de la variabilidad inicial.

Para este estudio, se utilizó un modelo de ratón AML PDX. Los ratones fueron trasplantados con células de LMA derivadas de pacientes caracterizadas por las siguientes mutaciones: DNMT3^AMR882H con una fracción alélica variante (VAF) del 48 %, NPM1^W288fs VAF 36 %, FLT3^ITD VAF 10 % e IDH2^R140Q VAF 44 %. Después del trasplante, se permitieron tres semanas para el crecimiento del tumor antes de iniciar el tratamiento. Los ratones PDX trasplantados con mutación FLT3 fueron tratados durante quince días con uno de tres regímenes: placebo, gilteritinib (15 mg/kg diarios) o una combinación de venetoclax (50 mg/kg diarios), 5-azacitidina (2,5 mg/kg diarios) y cedarizudina (3 mg/kg diarios) (Figura 4A).

Con respecto a los resultados obtenidos, cabe destacar que el tratamiento con una pauta basada en venetoclax resultó en un aumento significativo de la fosforilación de STAT5 y RPS6, lo que sugiere que estas vías contribuyen a la resistencia al tratamiento (Figura 4E). Por el contrario, el gilteritinib, un fármaco dirigido a FLT3, no redujo el estado de fosforilación de los efectores mutantes de FLT3. Es posible que en el espécimen de LMA analizado, la presencia de mutaciones secundarias adicionales distintas de FLT3-ITD (por ejemplo, IDH2) contribuya a la activación de estas vías o que el tratamiento farmacológico durante dos semanas dé lugar a la eliminación selectiva de las células de LMA con disminución de la señalización. Dado que todas las fosfoproteínas analizadas proceden de la misma población celular, es posible comparar la activación de las fosfoproteínas. En este experimento, la correlación más fuerte en la tinción de fosfoproteínas parece ser entre p-STAT5 y p-RPS6 (Figura suplementaria 1A), que están reguladas al alza en este grupo experimental después del tratamiento (Figura 4E). Parece haber una menor relación entre p-STAT5 y p-ERK (Figura suplementaria 1B). Es importante destacar que el tamaño de las células (evaluado mediante FSC-A) no es un contribuyente importante a la positividad general de p-STAT5, lo que pone de manifiesto que la positividad de la tinción no es simplemente un producto del tamaño de las células (Figura complementaria 1C). Este marco experimental permite una evaluación exhaustiva de los efectos de estos tratamientos en la modulación de la vía de señalización.

Figura 1: Visualización de las vías de señalización del objetivo y la estrategia para su análisis. (A) Descripción general de las vías de señalización que involucran p-STAT5 (Tyr694), p-4EBP1 (Thr37/46), p-RPS6 (Ser240/244) y p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204). En la vía p-STAT5, JAK se somete a autofosforilación, aumentando su actividad catalítica, y luego fosforila residuos específicos de tirosina, creando sitios de acoplamiento para las proteínas STAT. El STAT5 fosforilado (Tyr694) se homodimeriza y se transloca al núcleo, donde se une a elementos específicos que responden a STAT en las regiones promotoras de los genes diana. En la cascada RAS-RAF-MEK-ERK, la autofosforilación del receptor FLT3 u otros receptores tirosina quinasas (RTKs) tras la unión del ligando conduce al intercambio de GDP por GTP en RAS, activando así RAS. El RAS-GTP activado recluta RAF a la membrana plasmática, donde el RAF sufre un cambio conformacional y se activa. A continuación, RAF fosforila y activa MEK1/2, una quinasa de doble especificidad, que a su vez fosforila ERK en los residuos de Thr202/Tyr204. ERK1/2 activado se transloca al núcleo, donde fosforila factores de transcripción específicos. ERK1/2 también es capaz, a través de vías de señalización intermedias, de aumentar la actividad de mTORC1 y fosforilar eIF4E en sitios específicos para aumentar la actividad de traducción. Activado por nutrientes y factores de crecimiento a través de FLT3 y otros RTKs, mTORC1 fosforila objetivos posteriores como S6K1 y 4E-BP1. S6K1, a su vez, fosforila RPS6, lo que mejora la función del ribosoma y activa la traducción. La hiperfosforilación de 4E-BP1 libera eIF4E, lo que permite el ensamblaje del complejo de iniciación de la traducción eIF4F y la activación de la traducción dependiente de la tapa. Todas estas vías están muy implicadas en la LMA, contribuyendo a las adaptaciones adquiridas al aumentar la proliferación celular, el metabolismo y la resistencia a las señales apoptóticas. (B) presenta los pasos principales del protocolo acoplado de aspiración de médula ósea y tinción de fosfoflujo intracelular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Visualización de los pasos críticos durante el procedimiento de aspiración de médula ósea. El área quirúrgica y los materiales necesarios se colocan bajo una campana de flujo laminar. Después de la anestesia por inhalación de isoflurano (A), la superficie articular femoral se prepara para la aspiración (B,C). El hueso femoral se perfora con una primera jeringa alineada con el centro del hueso femoral (D). Es fundamental evitar aplicar una fuerte presión a la aguja y, en su lugar, realizar un movimiento de perforación rotatorio; Esto suele ser suficiente para que la aguja perfore la superficie del hueso y siga el camino de la cavidad femoral. A continuación, se aspira la médula ósea con una segunda jeringa a través del sitio de punción (I,J). Después de transferir el aspirado de médula ósea a un tubo de microcentrífuga (K), se aplica una presión suave para detener el sangrado en el área (L) y se coloca el ratón en una jaula tibia y limpia para su recuperación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Flujo de trabajo para el análisis de la estrategia de compuertas, incluidos los controles de isotipo. (A) representa las estrategias de activación para células vivas, la exclusión de dobletes y las células de LMA hCD45 positivas. (B) muestra señales para cada fosfoproteína en marrón y controles de isotipo en negro (dos réplicas biológicas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Flujo de trabajo para la detección y el análisis de fosfoproteínas intracelulares después del inmunoestado de células viables de LMA de médula ósea. (A) Los ratones NSG-SGM3 injertados con células de LMA donadas por pacientes se trataron con vehículo (control) o venetoclax, 5-azacitidina y cedazuridina (vene/aza/CDZ) o gilteritinib. Después de 15 días, se procesaron los aspirados de médula ósea (BM). (B) representa la estrategia de activación para el análisis de células viables de LMA (p. ej., hCD45/Zombie-NIR positivo) 15 días después del tratamiento. (C,D) representan la normalización de la señal para cada uno de los fosfoanticuerpos indicados, en 10.000 células de LMA aisladas de ratones tratados con venetoclax/5-azacitidina/cedazuridina o vehículo (B) o gilteritinib o vehículo (C). Los trazas representan las señales en las células de LMA aisladas del ratón de control tratado con vehicle (azul claro), vene/aza/CDZ (rojo) o gilteritinib (púrpura). (E) El histograma representa los cambios en el valor medio de las intensidades de tinción para cada fosfoproteína probada en células humanas vivas de LMA CD45⁺ de tres ratones y SD. Las barras de error representan la desviación estándar. Los asteriscos indican diferencias significativas en las intensidades de tinción evaluadas por ANOVA con valores de p inferiores a 0,05 (*) y 0,01 (**). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Lista de diluciones optimizadas para anticuerpos.

Figura complementaria 1: Comparación de p-STAT5, p-RPS6, p-ERK1/2 y FSC-A en una muestra representativa de AML PDX. Esta figura muestra un ejemplo de la relación entre p-STAT5, p-ERK y p-RPS6 en el ratón "E9" en el día 15 de tratamiento con venetoclax/5-azacitidina/cedazuridina (resultado de la Figura 4C). En esta muestra, la correlación más fuerte en la tinción de fosfoproteínas parece estar entre p-STAT5 y p-RPS6 (A), que están reguladas al alza en este grupo experimental después del tratamiento (Figura 4E). Parece haber una menor relación entre p-STAT5 y p-ERK (B). Es importante destacar que el tamaño de las células (evaluado mediante FSC-A) no es un contribuyente importante a la positividad general de p-STAT5, lo que pone de manifiesto que la positividad de la tinción no es simplemente un producto del tamaño de las células (C). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Pasos críticos
El uso de técnicas de base inmunológica en el estudio de vías de señalización complejas a través de la detección específica de fosfoproteínas requiere que las variables experimentales estén estrictamente controladas²², que la preparación de la muestra sea meticulosa y que se empleen técnicas complementarias para la validación. La integración de estas prácticas garantiza la reproducibilidad, precisión y solidez de los datos, lo que en última instancia contribuye a conclusiones biológicas más fiables. Estos esfuerzos no solo mejoran el rigor científico del método, sino que también amplían su aplicabilidad en estudios complejos de señalización y regulación celular. La anestesia adecuada y el manejo suave son fundamentales para minimizar el estrés fisiológico, que puede alterar significativamente los resultados experimentales, particularmente en estudios centrados en las respuestas inmunitarias o las vías de señalización. Garantizar protocolos analgésicos adecuados ayuda aún más a mantener el bienestar de los animales al tiempo que previene el estrés relacionado con el dolor que podría interferir con los datos. Mantener las condiciones asépticas durante el procedimiento es vital para prevenir infecciones, que pueden provocar respuestas inflamatorias y potencialmente confundir los resultados experimentales. Esto implica esterilizar el equipo, usar guantes limpios y desinfectar a fondo el sitio de aspiración.

Las proteínas fosforiladas son altamente susceptibles a la desfosforilación por fosfatasas durante la manipulación de muestras biológicas^22,23. Para preservar los estados de fosforilación durante el procesamiento, es esencial la fijación inmediata. Se probaron dos métodos diferentes de fijación/permeabilización: un kit de citofix/citoperm y el método común de formaldehído/metanol descrito en el protocolo. Entre estos, el método basado en metanol proporcionó resultados más limpios con señales de fluorescencia más brillantes, lo que lo convierte en la opción preferida. Después de la fijación, las muestras pueden almacenarse a corto plazo a -20 °C o a largo plazo a -80 °C. En los experimentos, las muestras fijas almacenadas hasta tres meses a -80 °C arrojaron resultados consistentes. En el caso de la tinción de anticuerpos, una incubación nocturna puede mejorar la precisión, especialmente en el caso de cambios sutiles en la fosforilación, aunque esto depende del experimento específico y de los efectos del fármaco que se estén investigando. También se probó una incubación más corta de 1 h en hielo, protegido de la luz, lo que produjo resultados aceptables en ciertos casos. Para garantizar una evaluación precisa del ruido de fondo, se recomiendan los controles de isotipo como referencia para la unión no específica, como se muestra en la Figura 3.

Modificaciones y solución de problemas de la técnica
Para desarrollar la competencia técnica, los aprendices de nuestro grupo practican la técnica de inserción de agujas en ratones sacrificados, donde la colocación adecuada se puede confirmar mediante disección. El procedimiento de animales vivos se realiza de manera más eficiente por dos operadores, donde uno puede concentrarse en las aspiraciones mientras que un asistente se dedica a las tareas de monitoreo de animales y manejo de muestras. En casos raros en los que no es posible obtener una aspiración después de varios intentos, es aconsejable abortar el procedimiento, ya que el riesgo de lesiones aumenta con cada intento. El seguimiento posterior al procedimiento de los animales es igualmente importante. La observación de signos de infección, dolor o estrés garantiza el bienestar de los ratones y la fiabilidad del estudio. Las condiciones de la vivienda deben apoyar la recuperación, con ropa de cama y nutrición adecuadas para minimizar los factores estresantes externos.

Para el análisis por citometría de flujo, se recomienda procesar simultáneamente todas las muestras fijas y conservadas de diferentes días de aspiración de médula ósea. Las variaciones en la rehidratación de la muestra y la tinción debido a diferencias en los días de manipulación o en los operarios pueden afectar a la sensibilidad a la fluorescencia detectada por el citómetro. Para garantizar resultados consistentes, optimice la configuración de voltaje del citómetro para mantener todas las muestras teñidas dentro del rango de detección antes de continuar. La proteína p-4EBP1 conjugada con Alexa Fluor 488 exhibe el brillo más alto entre los marcadores de este panel, lo que la convierte en una referencia confiable para establecer el rango máximo de detección. Si bien el panel de anticuerpos presentado en este protocolo no requirió ajustes de compensación, esto puede variar según el citómetro de flujo espectral utilizado.

Limitaciones
Una de las principales limitaciones de esta técnica es el número de células extraídas durante la aspiración de médula ósea. Para garantizar resultados fiables, es esencial teñir suficientes células para analizar un mínimo de aproximadamente 10.000 células por muestra. El análisis de muy pocas células puede dar lugar a variaciones significativas entre las muestras, lo que compromete la precisión y la interpretabilidad de los datos. Garantizar un número adecuado de células es fundamental para realizar estudios mecanicistas sólidos y reproducibles.

Para el análisis de datos, se aplica la estrategia de compuerta que se ilustra en la Figura 3A . En primer lugar, después de excluir los dobletes, las células de interés se identifican utilizando un anticuerpo humano CD45 acoplado a BUV395. A continuación, la compuerta para células vivas se realiza mediante Zombie NIR. Finalmente, se calcula la intensidad media de fluorescencia (MFI) para cada fosfoproteína (Figura 3B). Todas las células analizadas para todas las proteínas fosforiladas se controlaron utilizando la misma estrategia, lo que garantizó la coherencia y la comparabilidad entre las poblaciones de células de LMA.

Otra limitación de este método es la posibilidad de ruido de fondo, que puede surgir de la unión inespecífica de anticuerpos, el lavado insuficiente, la autofluorescencia celular o la permeabilización inadecuada. Esto puede afectar la especificidad de la señal y reducir la precisión del análisis de citometría de fosfoflujo. Para los usuarios que se encuentran con estos problemas, se recomienda un paso de lavado adicional para reducir el ruido de fondo, y se pueden usar reactivos de bloqueo de Fc para minimizar la unión inespecífica. Además, la fluorescencia de células muertas puede interferir con los resultados, por lo que el uso de tintes de viabilidad es esencial. Es importante destacar que, para un análisis preciso, el número de células analizadas no debe ser inferior a 500 células de LMA para garantizar resultados fiables y reproducibles. También es importante asegurarse de que se utilice un número similar de células durante la tinción para mantener la coherencia en todas las muestras. A pesar de estas limitaciones, la optimización cuidadosa de los controles y las estrategias de compuerta puede mejorar la confiabilidad del método.

Importancia de la técnica
La técnica de aspiración de médula ósea ya ha sido publicada³; Sin embargo, en este protocolo se incluye una técnica actualizada con una explicación que destaca dos ventajas: una inmovilización mejorada y el uso de un enfoque de dos agujas para mejorar la precisión y la consistencia en la aspiración de médula ósea, evitando cualquier problema de bloqueo de la aguja con fragmentos óseos. Para los estudios longitudinales, la aspiración femoral se puede realizar varias veces, lo que proporciona un método poderoso para rastrear los cambios biológicos a lo largo del tiempo en animales individuales. Se recomienda un intervalo de recuperación mínimo de un mes entre aspiraciones en el mismo fémur para permitir una cicatrización ósea suficiente y la regeneración de la médula ósea. Cuando se utiliza el fémur contralateral, un intervalo más corto de una semana es suficiente para garantizar que el ratón se haya recuperado de los efectos de la analgesia y la anestesia sin introducir un estrés excesivo o variabilidad fisiológica.

En conjunto, esta técnica combinada de aspiración de médula ósea murina y citometría de flujo proporciona información valiosa sobre las vías de señalización clave, incluidas JAK/p-STAT5, mTORC1/p-4EBP1, mTORC1/p-RPS6 y MEK/p-ERK1/2. Estas vías desempeñan un papel importante en la resistencia al tratamiento de la LMA. Esta técnica permite tomar muestras repetidas del mismo animal, lo que permite el seguimiento en tiempo real de la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento a nivel de una sola célula.

La citometría de fosfoflujo captura los eventos de fosforilación y preserva la heterogeneidad celular ^4,23,24. Esto lo hace particularmente valioso para comprender las respuestas celulares dinámicas a la terapia en subpoblaciones leucémicas específicas.

Aplicaciones futuras
Este protocolo proporciona una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos subyacentes de la adaptación al tratamiento y la aparición de resistencia en la LMA, allanando el camino para conocimientos más profundos y posibles avances terapéuticos. Los estudios futuros podrían integrar este enfoque con la transcriptómica o proteómica de una sola célula para diseccionar aún más los mecanismos moleculares que impulsan la resistencia y la progresión de la enfermedad²⁵. Además, la aplicación de este método a otras neoplasias hematológicas malignas o afecciones inflamatorias podría ampliar su impacto en la investigación traslacional.

Al refinar este protocolo y abordar sus limitaciones, este enfoque podría convertirse en un método estándar para estudiar la señalización de fosfoproteínas en enfermedades hematológicas, lo que en última instancia ayudaría en el desarrollo de estrategias terapéuticas más efectivas. En conclusión, este protocolo proporciona una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos subyacentes de la adaptación al tratamiento y la aparición de resistencia en la LMA, allanando el camino para conocimientos más profundos y posibles avances terapéuticos.

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo fue apoyado por Subvenciones de Transición para LH y FEM de la Fundación Cole, y subvenciones de la Sociedad de Leucemia y Linfoma de Canadá y los Institutos Canadienses para la Investigación en Salud (PJT-186019) para LH y FEM. FEM es un científico clínico FRSQ Junior 2 y LH es un científico FRSQ Junior 2. VG tiene una beca de doctorado de la Fundación Cole. La Figura 1 se creó con BioRender bajo un acuerdo de licencia. Los gráficos de citometría de flujo se generaron utilizando el software FlowJo. Un agradecimiento especial al Dr. Colin Crist y Victoria Richard por permitir el acceso a sus instalaciones de cirugía animal.