JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، يتم وصف طريقة قائمة على قياس الخلايا الفوسفورية لتحليل الإشارات في اتجاه مجرى مسارات mTORC1 و JAK / STAT5 و MAPK في خلايا ابيضاض الدم النخاعي البشري الحادة التي تم تطعيمها إلى فئران والحصول عليها من زخرفة نخاع العظام. يتم قياس مستويات p-STAT5 و p-4EBP1 و p-RPS6 و p-ERK1 / 2 في وقت واحد باستخدام مقياس التدفق الطيفي الخلوي من الجيل التالي بحساسية عالية.

Abstract

للتكيف مع العلاجات المعتمدة ومقاومتها، تنشط خلايا ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) مسارات جزيئية محددة تؤدي إلى تغييرات في التعبير الجيني ومستويات البروتين والنشاط. في هذا البروتوكول ، تم الإبلاغ عن نهج لاستكشاف الأهداف الفسفرية في اتجاه مجرى إشارات الأورام في AML: p-STAT5 (Tyr694) ، p-4EBP1 (Thr37 / 46) ، p-RPS6 (Ser240/244) ، و p-ERK1 / 2 (Thr202 / Tyr204). تتيح هذه الطريقة تقييم كيفية تعديل هذه المسارات - المنظمين الرئيسيين للحفاظ على الجذع ، والتهرب المناعي ، وتخليق البروتين ، والتكيف مع الإجهاد التأكسدي والتمثيل الغذائي - بواسطة واحد أو أكثر من المركبات المختبرة في خلايا نخاع العظام التي يتم حصادها من الفئران الحية عن طريق الشفط قبل وبعد مرحلة العلاج. تحافظ هذه الطريقة طفيفة التوغل على سلامة الخلايا وتقلل من التوتر مقارنة بتقنيات تكسير العظام ، والتي يمكن أن تسبب الضرر وربما تؤثر على النتائج التجريبية. لتحسين تلطيخ الأجسام المضادة داخل الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي ، تم تطوير بروتوكول باستخدام تثبيت بارافورمالدهيد ونفاذية الميثانول. يضمن هذا النهج دقة تلطيخ عالية ويقلل من ضوضاء الخلفية ، مما يتيح اكتشافا موثوقا لعلامات الإشارات داخل الخلايا. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول في تطوير لوحة أجسام مضادة متعددة العوامل ، مما يسمح بالتقييم المتزامن للمسارات الأربعة داخل نفس العينة. باستخدام مقياس التدفق الخلوي الطيفي من الجيل التالي بحساسية عالية ، لوحظت تحولات ديناميكية في تنشيط المسار اعتمادا على ظروف العلاج مقارنة بمستويات خط الأساس قبل المعالجة في نفس الفئران. تتيح هذه المنهجية تحليلا دقيقا في الجسم الحي لتعديل مسار الإشارات في عينات نخاع العظام المشتقة من المريض دون الحاجة إلى القتل الرحيم للحيوانات ، مما يوفر نظرة ثاقبة حول الآليات التكيفية لخلايا AML ، ويمكن أن توجه تقييم الاستراتيجيات العلاجية التي تهدف إلى استهداف هذه المسارات للتغلب على المقاومة.

Introduction

ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) هو ورم دموي خبيث عدواني يتميز بتراكم الخلايا السلفية النخاعية غير الناضجة في نخاع العظام والدم المحيطي. هذا يعطل تكون الدم الطبيعي ، مما يؤدي إلى قلة الكريات الخلوية التي تهدد الحياة ومضاعفات جهازية. على الرغم من أن التقدم في أنظمة العلاج الكيميائي والعلاجات المستهدفة وزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم قد حسنت النتائج بالنسبة لبعض المرضى ، إلا أن معدلات البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات بشكل عام لا تزال حوالي 30٪ ، مع تشخيص أسوأ لدى المرضى الأكبر سنا أو أولئك الذين لديهم ملامح وراثيةضارة 1. يتمثل التحدي الكبير في إدارة ابيضاض الدم النقوي الحاد في الظهور المتكرر لمقاومة الأدوية ، مما يساهم في الانتكاس وفشل العلاج2. وهذا يؤكد أهمية اكتساب فهم أعمق للآليات الجزيئية والخلوية التي تقود التقدم والمقاومة العلاجية لابيضاض الدم النقوي الحاد.

لمواجهة هذا التحدي ، يتم تقديم طريقة جديدة لشفط نخاع العظم إلى جانب قياس التدفق الخلوي متعدد الإرسال داخل الخلايا ، مما يوفر أداة قوية للتحقيق في مسارات الإشارات داخل الخلايا في نماذج الطعم الغريب المشتق من المريض (PDX) (الشكل 1 أ ، ب). على الرغم من أن شفط نخاع العظم في نماذج PDX قد تم وصفه سابقا3 ، فقد تم تحسين هذا البروتوكول للحفاظ على خلايا سرطان الدم لتحليل التدفق الفوسوفي. الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير إجراء طفيف التوغل يمكن تطبيقه طوليا أثناء تطور سرطان الدم والاستجابة العلاجية بدقة خلية واحدة. من خلال السماح بأخذ العينات المتكررة من نفس ، تقدم هذه التقنية تمثيلا أكثر دقة لتطور المرض تحت العلاج. يكمن الأساس المنطقي وراء تطوير هذه التقنية في الحاجة إلى تقييم ديناميكي عالي الدقة للإشارات داخل الخلايا في خلايا AML. تتطلب الطرق التقليدية ، مثل النشاف الغربي ، أعدادا كبيرة للخلايا ، وتفتقر إلى دقة الخلية المفردة ، وتعددالإرسال 4. في المقابل ، يحافظ قياس التدفق الخلوي الفوسفوري على عدم التجانس الخلوي ويتيح الكشف عن بروتينات الإشارات الفسفرية المتعددة في مجموعات سكانية فرعية مميزة من سرطان الدم5 ، مما يوفر رؤى رئيسية حول تنشيط المسار استجابة لعلاجات ابيضاض الدم النقوي الحاد.

من الأمور المركزية في بيولوجيا AML مسارات الإشارات التي تنظم التكاثر الخلوي والبقاء والتكيف الأيضي ، بما في ذلك بروتين كيناز المنشط بالميتوجين (MAPK) ، والهدف الميكانيكي لمركب الراباميسين 1 (mTORC1) ، ومحول Janus Kinase / Signal ومنشط النسخ 5 (JAK / STAT5) مسارات الإشارات. بالإضافة إلى أدوارها في تكاثر خلايا سرطان الدم وبقائها ، تشارك هذه المسارات أيضا بشكل حاسم في عمليات الأورام الرئيسية مثل الحفاظ على الجذع ، والتهرب المناعي ، والتكيف مع الإجهاد التأكسدي والتمثيلالغذائي 4. بالإضافة إلى تعزيز نمو الخلايا وبقائها ، فإن الحديث المتبادل بين هذه المسارات ينسق العمليات الحرجة مثل النسخ والترجمة والتمثيل الغذائي الخلوي ، مما يمكن خلايا AML من الحفاظ على نموها ومقاومة إشارات موت الخلايا المبرمج ، حتى في مواجهة التدخلات العلاجية6،7 (الشكل 1 أ).

يلعب مسار MAPK ، الذي يتضمن المؤثرات الرئيسية مثل p-ERK1 / 2 (كيناز منظم الإشارات خارج الخلية 1/2) ، دورا مهما في تكامل الإشارات خارج الخلية ، مثل عوامل النمو والسيتوكينات ، لتنظيم تكاثر الخلايا وبقائها على قيد الحياة. يحدث تنشيط ERK1 / 2 من خلال RAS (ساركوما الفئران) - RAF (الساركوما الليفية سريعة التسارع) - MEK (MAPK / ERK KINASE) - ERK CASCADE ، حيث يقوم RAS-GTP بتجنيد سلاح الجو الملكي البريطاني ، مما يؤدي إلى الفسفرة المتسلسلة ل MEK1 / 2 ثم ERK1 / 2 في Thr202 / Tyr204. بمجرد أن تكون فسفرة ، يتناقص ERK1 / 2 ويتحول إلى النواة ، حيث يقوم بفسفرة عوامل النسخ مثل MYC (متماثل الجينات المسرطنة الفيروسي للورم النخاعي) ، و ELK1 (بروتين ETS Like-1) ، و AP-1 (بروتين المنشط -1) ، مما يعزز تكاثر الخلايا ، وكتلة التمايز ، والبقاءعلى قيد الحياة 8. في AML ، تؤدي الطفرات في FLT3 (التيروزين كيناز 3 الشبيه ب fms) أو RAS أو KIT في كثير من الأحيان إلى تنشيط ERK التأسيسي9،10 (الشكل 1 أ).

تتسبب الطفرات في FLT3 أو RAS أو KIT أيضا في تنظيم إشارات mTORC1 ، مما يتيح نمو AML والمقاومة العلاجية من خلال دعم العمليات المسرطنة مثل إعادة الأسلاك الأيضية ، وتعديل تخليق البروتين ، والتكوين الحيوي للريبوسوم ، والالتهام الذاتي11. من خلال تنظيم ترجمة الرنا المرسال ، يسهل mTORC1 إنتاج البروتينات المسرطنة والعوامل الأساسية الأخرى لتطور ابيضاض الدم النقوي الحاد. تتضمن مجموعة رئيسية من ركائز mTORC1 4E-BPs (بروتينات ربط عامل بدء حقيقيات النواة 4E). في حالتها الناقص الفسفرية ، ترتبط 4E-BPs ب eIF4E (عامل بدء حقيقيات النواة 4E) ، مما يثبط الترجمة المعتمدة على الغطاء. تتسبب فسفرة 4E-BP1 عند Thr37 / 46 بواسطة mTORC1 في إطلاق eIF4E ، مما يتيح بدء الترجمة ل mRNAs الرئيسية المسرطنة للأورام ، مثل MYC و CCND1 (Cyclin D1) و MCL-1 (ابيضاض الدم في الخلايا النخاعية 1) ، وبالتالي تعزيز تكاثر سرطان الدم والبقاء على قيد الحياة8،12. بالإضافة إلى ذلك ، فإن فسفرة RPS6 في Ser240 / 244 ، بوساطة S6K1 (البروتين الريبوسومي S6 كيناز بيتا -1) في اتجاه مجرى mTORC1 ، يعزز التكوين الحيوي للريبوسوم ، وترجمة mRNA ، مما يزيد من تخليق البروتينات اللازمة للتكيف الأيضي ، ومقاومة الإجهاد ، والانتشار السريع8،13. والجدير بالذكر أن نشاط mTORC1 يرتبط ارتباطا وثيقا بالتكيف الأيضي ، وهي استراتيجية بقاء حاسمة تستخدمها خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد تحت الإجهاد العلاجي13،14،15 (الشكل 1 أ).

يعد مسار JAK / STAT5 محورا حاسما آخر للإشارات في ابيضاض الدم النقوي الحاد ، لا سيما في الحالات التي تؤثر فيها الطفرات التي تؤثر على مستقبلات السيتوكين أو وسطاء الإشارات مثل JAK2 و FLT3 و CALR (calreticulin) 16،17. يتم تنشيط STAT5 استجابة لإشارات السيتوكين من خلال مستقبلات مثل FLT3 و JAK2. عند ربط الترابط ، يرتبط Janus kinases (JAKs) بالفوسفوريلات STAT5 في Tyr694. يقوم STAT5 الفسفوري بتضييق وينتقل إلى النواة ، حيث يرتبط بتسلسلات محددة من الحمض النووي لتنظيم نسخ الجينات المشاركة في بقاء الخلية وتكاثرهاوتمايزها 8. في ابيضاض الدم النقوي الحاد ، يؤدي التنشيط التأسيسي ل STAT5 ، غالبا بسبب الطفرات في FLT3 أو JAK2 ، إلى التعبير المستمر عن الجينات التي تعزز تكوين الكرياتالبيضاء 18 (الشكل 1 أ).

بالإضافة إلى مساهماتهم الفردية ، تتلاقى هذه المسارات لتنظيم كل من النسخ والترجمة ، وتشكيل بروتين خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد بطرق تعزز البقاء والمقاومة. على وجه الخصوص ، تبرز ترجمة الرنا المرسال كعامل رئيسي في الفيزيولوجيا المرضية لمرض ابيضاض الدم النقوي الحاد ، حيث تسمح بالإنتاج السريع للبروتينات المسرطنة وعوامل الاستجابة للإجهاد التي تمكن خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد من التكيف مع التحديات البيئية والتهرب من آثار العلاجات المستهدفة. كان خلل تنظيم آلية الترجمة ، مثل عوامل بدء حقيقيات النواة (eIFs) أو البروتينات الريبوسومية ، متورطا في المقاومة العلاجية وسوء التشخيص في AML19. يعد التحقيق التفصيلي لأدوار مسارات MAPK و mTORC1 و JAK / STAT5 في تنظيم النسخ والتحويل أمرا ضروريا لاكتساب فهم شامل للآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور ومقاومة ابيضاض الدم النقوي الحاد. هذه الأفكار ضرورية لتحديد المؤشرات الحيوية الجديدة للاستجابة للعلاج وتصميم استراتيجيات علاجية جديدة تستهدف هذه المسارات للتغلب على المقاومة. توفر هذه المقالة بروتوكولا مصمما خصيصا للتحقيق في شبكات الإشارات هذه في نماذج الطعم الغريب المشتق من المريض (PDX) المشتق من AML.

تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول في دمج شفط نخاع العظم مع قياس التدفق الخلوي داخل الخلايا ، مما يسمح بإجراء تقييم ديناميكي وطفيف التوغل لتنشيط مسار الإشارات في نماذج الطعم الغريب المشتق من المريض (PDX). هذا ذو قيمة خاصة لمراقبة حالة تنشيط المسارات الرئيسية مثل MAPK و mTORC1 و JAK / STAT5 استجابة للعلاجات المستهدفة. يتيح الجمع بين هذه التقنيات اكتساب فهم شامل وعالي الدقة لبيولوجيا ابيضاض الدم النقوي الحاد ، مما يساعد في النهاية في تطوير استراتيجيات علاجية أكثر فعالية.

Protocol

تم إجراء التجارب التالية بموافقة لجنة رعاية بجامعة ماكجيل (CIHR PJT-186019) ومجلس المراجعة المؤسسية للمستشفى اليهودي العام (11-047). في هذا البروتوكول ، تم زرع الفئران الذكور NOD-scid IL2Rg ^ null-3 / GM / SF (NSGS) ، التي تتراوح أعمارها بين 8 أسابيع و 6 أشهر ووزنها 20-30 جم ، بخلايا AML المشتقة من المريض البشري. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. شفط نخاع العظم

تنبيه: يجب اتباع احتياطات السلامة المحيطة باستخدام الإبر.

  1. تسكين التسكين في الفترة المحيطة بالجراحة: قبل 1-4 ساعات من شفط نخاع العظم ، يتم حقن الفئران تحت الجلد (SC) ب 0.1 مجم / كجم من البوبرينورفين بطيء الإطلاق. هذا يضمن التسكين لمدة تصل إلى 72 ساعة بعد العملية.
  2. قم بإعداد المنطقة الجراحية تحت غطاء التدفق الصفحي باستخدام وسادة تقويم العمود الفقري ، وماكينة تشذيب الشعر ، ومصباح التسخين ، وجميع المواد اللازمة لشفط نخاع العظم (محاقن 25 جم ، أنابيب طرد مركزي دقيقة 1.5 مل تحتوي على 0.5 مل من PBS على الجليد ، 70٪ مسحات الأيزوبروبانول). قم بتأمين مخروط الأنف لاستنشاق الأيزوفلوران باستخدام شريط لاصق (الشكل 2 أ).
  3. قم بإعداد حقنتين 25 جم لكل شفط ، واحدة لثقب العظام ("إبرة جافة") والأخرى تم مسح محورها باستخدام PBS للشفط ("إبرة متدفقة").
  4. قم بتخدير الماوس باستخدام استنشاق الأيزوفلوران الذي يتم تسليمه بواسطة مبخر معتمد ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة والإرشادات البيطرية. قد تختلف الإجراءات المحلية. كمرجع ، اتبع هذا البروتوكول إجراءات التشغيل القياسية لجامعة ماكجيل لتخدير الفأر20.
  5. تأكد من عمق التخدير من خلال عدم الاستجابة لقرصة القدم واسترخاء العضلات. ضع مرهما بيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير للحيوان. مراقبة معدل التنفس باستمرار أثناء التخدير.
  6. احلق الساق بالكامل حيث سيتم إجراء الشفط باستخدام أداة تشذيب الشعر. تطهير موقع الشفط (عظم الفخذ) بقطعة مطهرة مشبعة بكحول الأيزوبروبيل (الشكل 2 ب).
  7. كشف السطح المفصلي لعظم الفخذ ، حيث يوجد موقع البزل ، عن طريق ثني الركبة وشل حركة الساق باستخدام اليد غير المهيمنة. ضع الإبهام على الظنبوب ، والسبابة على عظم الفخذ ، والإصبع الأوسط ، مع تثبيت كل شيء على الجانب الخارجي من العظمتين (الشكل 2 ج).
    ملاحظة: تأكد من وضع ثابت جدا للساق باستخدام اليد غير المهيمنة لمنع أي حركة للساق أثناء الشفط قد تؤدي إلى الفشل أو الإصابة. إذا كان تثبيت الساق غير مستقر ، فقم بتغيير موضع اليد وأعد المحاولة قبل أي ثقب.
  8. أثناء الشلل باليد غير المهيمنة ، قم بتطهير منطقة الركبة مرة أخرى باستخدام كحول الأيزوبروبيل (الشكل 2 ج) لتحريك الشعيرات المتبقية بعيدا لتحسين تصور بنية العظام.
  9. استخدم أول حقنة جافة 25 جم لإحداث ثقب في السطح المفصلي الفخذي عن طريق وضعها في منتصف مفصل عظم الفخذ وتدويرها دون إجبار (الشكل 2D ، E). تأكد من محاذاة إبرة المحقنة تماما (انحراف 0 درجة) مع المحور الطولي لعظم الفخذ لدخول النخاع بشكل صحيح.
    ملاحظة: حافظ على هذه المحاذاة لضمان الدخول السلس دون التسبب في أضرار غير ضرورية للأنسجة المحيطة. عندما تدخل الإبرة إلى منتصف عظم الفخذ ، يشير انخفاض طفيف في المقاومة إلى اختراق ناجح في تجويف النخاع (الشكل 2F). تجنب استخدام القوة المفرطة على الإبرة في هذه الخطوة ، فقد يتسبب ذلك في فقدان المحاذاة الصحيحة أو الكسر أو الصدمة. باستخدام حركة الحفر الدورانية ، تزداد احتمالات أن تتبع الإبرة المسار الأقل مقاومة وتدخل تجويف الفخذ بشكل صحيح. يجب أن تظل الإبرة الموضوعة بشكل صحيح داخل عظم الفخذ عمودية حتى عند إزالة اليد التي تمسكها بها.
  10. بمجرد دخولك النخاع ، قم بإزالة المحقنة تدريجيا عن طريق التدوير (الشكل 2G) وأدخل المحقنة الثانية المتدفقة في الفتحة التي تصنعها الإبرة الأولى (الشكل 2H ، I).
    ملاحظة: يتم استخدام حقنة ثانية لأن الحقنة الأولى غالبا ما يتم انسدادها بواسطة العظام أثناء الحفر.
  11. ضع الفراغ على المحقنة التي يتم إدخالها داخل عظم الفخذ أثناء تدوير المحقنة برفق وسحبها تدريجيا. يجب أن يكون ما يقرب من 10-20 ميكرولتر من نخاع العظم مرئيا داخل محور المحقنة (الشكل 2J).
    ملاحظة: إذا لزم الأمر ، أعد تقديم الإبرة برفق داخل العظم لتحسين استخراج النخاع.
  12. انقل نخاع العظم عن طريق شطف محتويات المحقنة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق المبرد الذي يحتوي على 500 ميكرولتر من PBS (الشكل 2 ك). استمر في وضع الجليد وانتقل إلى الخطوات 2-3 في أسرع وقت ممكن.
  13. ضع ضغطا برفق على موقع البزل لمدة 30 ثانية باستخدام مسحة الأيزوبروبانول لوقف أي نزيف (الشكل 2L).
  14. ضع الماوس في قفص استرداد نظيف دافئ باستخدام مصباح تسخين. راقب التنفس والحركة حتى يستيقظ ويتعافى تماما قبل وضعه في أقفاص مشتركة مع بقية الفئران. تحقق من علامات النزيف.

2. تلطيخ علامة الحية / الميتة والسطح

ملاحظة: حافظ على الخلايا على الجليد طوال الإجراء. قم بإعداد مزيج رئيسي من محاليل تلطيخ الأجسام المضادة (للخطوة 2.4 والخطوة 2.7) قبل الخطوة 2 والخطوة 3 ، مع الاحتفاظ بها عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء. قم بإعداد محلول فورمالديهايد طازج بنسبة 1.6٪ (الخطوة 3.1) ومحلول ميثانول بنسبة 100٪ مع الاحتفاظ به عند -20 درجة مئوية (الخطوة 3.6).

  1. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام أكريدين برتقال / يوديد بروبيديوم (AO / PI) مع عداد الخلايا21.
  2. انقل الحجم المناسب ل 1 مليون خلية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. إذا لم يكن الحجم كافيا ، فخذ وحدة التخزين بالكامل. قم بتجميع الخلايا المتبقية وقم بتقطيعها إلى 3 أنابيب مكررة (1 متر لكل منهما) لتلطيخ التحكم في النمط المتماثل وأنبوب واحد للتحكم غير الملوث.
  3. خلايا الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بالشفيق برفق وتخلص من المادة الطافية باستخدام نظام الشفط بالفراغ.
  4. أضف 200 ميكرولتر لكل عينة من محلول تلطيخ الخلايا الفلورية المخفف 1/100 في PBS لتسمية الخلايا الميتة. أعد تعليق الخلايا برفق باستخدام الماصة. افعل الشيء نفسه مع الأنابيب الإضافية لتلوين التحكم في النمط المتماثل.
  5. احتضن على الجليد لمدة 10 دقائق محمية من الضوء.
  6. الطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق برفق وتخلص من المادة الطافية باستخدام نظام تفريغ.
  7. أضف 100 ميكرولتر لكل عينة من الجسم المضاد hCD45-BUV395 المخفف 1/100 في PBS الذي يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني لتسمية الخلايا المكونة للدم البشرية. افعل الشيء نفسه مع الأنابيب الإضافية المحفوظة لعناصر التحكم في النمط المتماثل.
  8. احتضن على الثلج لمدة 15 دقيقة محميا من الضوء. انتقل فورا إلى الخطوة 3.

3. التثبيت والنفاذية

  1. تحضير محلول فورمالديهايد / PBS طازج بنسبة 1.6٪: لكل عينة ، امزج 29.5 ميكرولتر من محلول مخزون الفورمالديهايد بنسبة 37٪ + 970.5 ميكرولتر من PBS (ضع في اعتبارك بعض الحجم الإضافي كإجراء احترازي). احتفظ بمحلول الفورمالديهايد / PBS بنسبة 1.6٪ في درجة حرارة الغرفة.
    تنبيه: يجب التعامل مع الفورمالديهايد في غطاء كيميائي والتخلص منه وفقا للوائح السلامة المؤسسية.
  2. الطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بالشفط والتخلص من المادة الطافية باستخدام نظام التفريغ.
  3. أعد التعليق في 1 مل من محلول الفورمالديهايد / PBS بنسبة 1.6٪.
  4. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء.
  5. الطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بالشفط والتخلص من المادة الطافية باستخدام نظام التفريغ.
  6. أضف 1 مل من الميثانول بنسبة 100٪ المبرد عند -20 درجة مئوية مباشرة في الأنبوب.
  7. احتضان العينات عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، من الممكن تخزين الخلايا الثابتة والمتنفذة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد قبل التحليل.

4. تلطيخ Phosphoflow

ملاحظة: تم التحقق من صحة لوحة الأجسام المضادة التالية باستخدام مقياس التدفق الخلوي المزود بالليزر التالي: 320 نانومتر ، 355 نانومتر ، 405 نانومتر ، 488 نانومتر ، 561 نانومتر ، 637 نانومتر ، و 808 نانومتر. يجب إعادة التحقق من صحة هذه اللوحة إذا تم استخدام مقاييس خلوية مختلفة مع إعدادات ليزر وكاشف مختلفة.

  1. قم بإعداد محلول مزيج رئيسي للأجسام المضادة مع التخفيفات التالية في مخزن تلطيخ متاح تجاريا (الجدول 1) ، مع حساب حجم 50 ميكرولتر لكل عينة. يحفظ عند 4 درجات مئوية محميا من الضوء.
  2. للغسيل (الخطوات 4.8 ، 4.10) ، احتفظ ببرنامج تلفزيوني على الثلج (2 مل لكل عينة).
  3. قم بإعداد محلول خلط رئيسي ثان للتكرارات التقنية للتحكم في النمط المتماثل في المخزن المؤقت للتلطيخ (الجدول 1) ، مع حساب حجم 50 ميكرولتر لكل عينة. يحفظ عند 4 درجات مئوية محميا من الضوء. يوصى بعينتين على الأقل من عينات التحكم في النمط المتماثل من أجل التكاثر التقني.
  4. الطرد المركزي للخلايا من الخطوة 3.7 عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بالشفط والتخلص من المادة الطافية باستخدام نظام التفريغ.
    ملاحظة: بعد التثبيت والنفاذية ، قد تبدو الخلايا أكثر شفافية.
  5. أضف 50 ميكرولتر من محلول مزيج الأجسام المضادة (الخطوة 4.1) أو محلول مزيج التحكم في النمط المتماثل (الخطوة 4.2). أعد تعليق الخلايا برفق باستخدام ماصة.
  6. احتضان جميع العينات طوال الليل عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
  7. خلايا الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بالشفط والتخلص من المادة الطافية باستخدام نظام التفريغ.
  8. اغسل ب 1000 ميكرولتر من PBS عن طريق التعليق برفق باستخدام الماصة.
  9. خلايا الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بالشفط والتخلص من المادة الطافية باستخدام نظام التفريغ.
  10. قم بإجراء غسلة ثانية باستخدام 1000 ميكرولتر من PBS عن طريق إعادة التعليق برفق باستخدام الماصة.
  11. خلايا الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بالشفط والتخلص من المادة الطافية باستخدام نظام التفريغ.
  12. أعد تعليق العينات في 200 ميكرولتر من PBS. نقل إلى أنابيب أو لوحات FACS للتحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي (الشكل 3).
  13. قم بإعداد أدوات تحكم تعويض أحادية اللون بالخرز عن طريق احتضان 0.1 ميكرولتر من كل جسم مضاد بخرز تعويض ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).

النتائج

يهدف التصميم التجريبي إلى مراقبة حالة الفسفرة للبروتينات المختارة ذات الأهمية في نقاط زمنية مختلفة ، على سبيل المثال ، بدء المعالجة المسبقة لمدة يوم واحد و 15 يوما بعد بدء العلاج. يعمل خط الأساس هذا كعنصر تحكم حاسم للتحقق من صحة التغييرات اللاحقة في تنشيط مسار الإشارات بعد العلاج. بعد خمسة عشر يوما من العلاج ، يتم إجراء مقارنة ثانية لتقييم تعديل المسار في الفئران المعالجة مقابل الضوابط المعالجة بالمركبات (الشكل 4). يسمح هذا النهج المكون من خطوتين بالتمييز بين التأثيرات الناجمة عن العلاج من التباين الأساسي.

في هذه الدراسة ، تم استخدام نموذج ماوس AML PDX. تم زرع الفئران بخلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد المشتقة من المريض والتي تتميز بالطفرات التالية: DNMT3AMR882H بجزء أليل متغير (VAF) بنسبة 48٪ ، و NPM1W288fs VAF 36٪ ، و FLT3ITD VAF 10٪ ، و IDH2R140Q VAF 44٪. بعد الزرع ، سمح بثلاثة أسابيع لنمو الورم قبل بدء العلاج. عولجت فئران PDX المزروعة بالطفرة FLT3 لمدة خمسة عشر يوما بأحد الأنظمة الثلاثة: الدواء الوهمي ، جيلتريتينيب (15 مجم / كجم يوميا) ، أو مزيج من الفينيتوكلاكس (50 مجم / كجم يوميا) ، 5-أزاسيتيدين (2.5 مجم / كجم يوميا) ، وسيداريزودين (3 مجم / كجم يوميا) (الشكل 4 أ).

فيما يتعلق بالنتائج التي تم الحصول عليها ، من الجدير بالذكر أن العلاج بنظام قائم على الفينيتوكلاكس أدى إلى فسفرة STAT5 و RPS6 محسنة بشكل كبير ، مما يشير إلى أن هذه المسارات تساهم في مقاومة العلاج (الشكل 4E). في المقابل ، لم يقلل gilteritinib ، وهو دواء يستهدف FLT3 ، من حالة الفسفرة لمؤثرات FLT3 الطافرة. من الممكن أن يساهم وجود طفرات ثانوية إضافية بخلاف FLT3-ITD (على سبيل المثال ، IDH2) في تنشيط هذه المسارات أو أن العلاج الدوائي على مدى أسبوعين يؤدي إلى القضاء الانتقائي على خلايا AML مع انخفاض الإشارات. نظرا لأن جميع البروتينات الفوسفورية التي تم تحليلها مسورة من نفس مجموعة الخلايا ، فمن الممكن مقارنة تنشيط البروتين الفوسوفي. في هذه التجربة ، يبدو أن أقوى ارتباط في تلطيخ البروتين الفوسفوري هو بين p-STAT5 و p-RPS6 (الشكل التكميلي 1 أ) ، وكلاهما يتم تنظيمه في هذه المجموعة التجريبية بعد العلاج (الشكل 4 ه). يبدو أن هناك علاقة أقل بين p-STAT5 و p-ERK (الشكل التكميلي 1 ب). الأهم من ذلك ، أن حجم الخلية (الذي تم تقييمه باستخدام FSC-A) ليس مساهما رئيسيا في إيجابية p-STAT5 الإجمالية ، مما يسلط الضوء على أن إيجابية التلوين ليست مجرد نتاج لحجم الخلية (الشكل التكميلي 1C). يتيح هذا الإطار التجريبي تقييما شاملا لتأثيرات هذه العلاجات على تعديل مسار الإشارات.

figure-results-2781
الشكل 1: تصور مسارات الإشارات المستهدفة واستراتيجية تحليلها. (أ) نظرة عامة على مسيرات التشوير التي تشمل p-STAT5 (Tyr694) و p-4EBP1 (Thr37/46) و p-RPS6 (Ser240/244) و p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204). في مسار p-STAT5 ، يخضع JAK للفسفرة الذاتية ، مما يزيد من نشاطه التحفيزي ، ثم يقوم بفسفرة بقايا التيروزين المحددة ، مما يخلق مواقع لرسو السفن لبروتينات STAT. يتجانس STAT5 الفسفوري (Tyr694) ويتحول إلى النواة ، حيث يرتبط بعناصر محددة مستجيبة ل STAT في مناطق المحفز للجينات المستهدفة. في سلسلة RAS-RAF-MEK-ERK ، يؤدي الفسفرة الذاتية لمستقبلات FLT3 أو مستقبلات التيروزين كينازات الأخرى (RTKs) عند ربط الترابط إلى تبادل الناتج المحلي الإجمالي ل GTP على RAS ، وبالتالي تنشيط RAS. يقوم RAS-GTP المنشط بتجنيد سلاح الجو الملكي البريطاني في غشاء البلازما ، حيث يخضع سلاح الجو الملكي البريطاني لتغيير توافقي ويصبح نشطا. ثم يقوم سلاح الجو الملكي البريطاني بفسفرة وتنشيط MEK1 / 2 ، وهو كيناز ثنائي الخصوصية ، والذي بدوره يفسفرة ERK عند بقايا Thr202 / Tyr204. ينتقل ERK1 / 2 المنشط إلى النواة ، حيث يقوم بفسفرة عوامل نسخ محددة. كما أن ERK1/2 قادر على زيادة نشاط mTORC1 وفسفرة eIF4E في مواقع محددة لزيادة نشاط الترجمة. يتم تنشيطه بواسطة العناصر الغذائية وعوامل النمو من خلال FLT3 و RTKs الأخرى ، فإن mTORC1 يفسفرات في أهداف المصب مثل S6K1 و 4E-BP1. S6K1 ، بدوره ، يفسفور RPS6 ، مما يعزز وظيفة الريبوسوم وينشط الترجمة. فرط الفسفرة ل 4E-BP1 يطلق eIF4E ، مما يسمح بتجميع مركب بدء الترجمة eIF4F وتنشيط الترجمة المعتمدة على الغطاء. كل هذه المسارات تشارك بشكل كبير في ابيضاض الدم النقوي الحاد ، مما يساهم في التكيفات المكتسبة عن طريق زيادة تكاثر الخلايا ، والتمثيل الغذائي ، ومقاومة إشارات موت الخلايا المبرمج. (ب) يعرض الخطوات الرئيسية لطموح نخاع العظم وبروتوكول تلطيخ الفوسفو داخل الخلايا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4821
الشكل 2: تصور الخطوات الحاسمة أثناء إجراء شفط نخاع العظم. يتم إعداد المنطقة الجراحية والمواد اللازمة تحت غطاء التدفق الرقائقي. بعد التخدير عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (A) ، يتم تحضير السطح المفصلي الفخذي للشفط (B ، C). يتم ثقب عظم الفخذ بواسطة حقنة أولى محاذاة لمنتصف عظم الفخذ (D). من الأهمية بمكان تجنب تطبيق ضغط قوي على الإبرة وبدلا من ذلك إجراء حركة حفر دوارة ؛ عادة ما يكون هذا كافيا للإبرة لثقب سطح العظم واتباع مسار تجويف الفخذ. بعد ذلك ، يتم شفط نخاع العظم بحقنة ثانية من خلال موقع البزل (I ، J). بعد نقل نشفط نخاع العظم إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق (K) ، يتم تطبيق ضغط لطيف لوقف النزيف في المنطقة (L) ، ويتم وضع الفأر في قفص دافئ ونظيف للاستجمام. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5926
الشكل 3: سير العمل لتحليل استراتيجية البوابات ، بما في ذلك عناصر التحكم في النمط المتماثل. (أ) يمثل استراتيجيات البوابات للخلايا الحية ، واستبعاد الزوجات ، وخلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد الإيجابية hCD45. (ب) يعرض إشارات لكل بروتين فسفوسي باللون البني وعناصر التحكم في النمط المتماثل باللون الأسود (مكرران بيولوجيان). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6622
الشكل 4: سير العمل للكشف عن البروتينات الفوسفورية داخل الخلايا وتحليلها بعد تحديد مناعة خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد لنخاع العظم القابلة للحياة. (أ) تم علاج الفئران NSG-SGM3 المطعمة بخلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد المتبرع بها من قبل المريض بالمركبة (التحكم) أو الفينيتوكلاكس و 5-azacytidine و cedazuridine (vene / aza / CDZ) أو gilteritinib. بعد 15 يوما ، تمت معالجة شفاطات نخاع العظام (BM). (ب) يمثل استراتيجية البوابات لتحليل خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد القابلة للحياة (على سبيل المثال ، hCD45 / Zombie-NIR إيجابي) بعد 15 يوما من العلاج. (C ، D) يمثل تطبيع الإشارة لكل من الأجسام المضادة للفوسف كما هو موضح ، في 10,000 خلية ابيضاض الدم النقوي الحاد المعزولة من الفئران المعالجة بفينيتوكلاكس / 5-أزاسيتيدين / سيدازوريدين أو مركبة (B) أو gilteritinib أو مركبة (C). تمثل الآثار الإشارات الموجودة في خلايا AML المعزولة من فأر التحكم المعالج بالسيارة (أزرق فاتح) أو vene / aza / CDZ (أحمر) أو gilteritinib (أرجواني). (ه) يمثل الرسم البياني متوسط القيمة التغيرات في شدة التلوين لكل بروتين فسوسفي تم اختباره على خلايا AML CD45 + البشرية الحية من ثلاثة فئران و SD. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة في شدة التلوين كما تم تقييمها بواسطة ANOVA مع قيم p أقل من 0.05 (*) و 0.01 (**). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

جسمفلوروكرومالتخفيف
p-RPS6 (Ser240/244)أيه إف 5941/50
p-4EBP1 (Thr37/46)أيه إف 4881/50
ف-STAT5 (Tyr694)PE1/100
p-Erk1/2 (Thr202 / Tyr204)AF6471/100
التحكم في IgG للأرانبأيه إف 5941/50
التحكم في IgG للأرانبأيه إف 4881/50
التحكم في IgG للأرانبPE1/100
التحكم في IgG للأرانبAF6471/100

الجدول 1: قائمة التخفيفات المحسنة للأجسام المضادة.

الشكل التكميلي 1: مقارنة بين p-STAT5 و p-RPS6 و p-ERK1 / 2 و FSC-A في عينة AML PDX التمثيلية. يوضح هذا الشكل مثالا على العلاقة بين p-STAT5 و p-ERK و p-RPS6 في الفأر "E9" في اليوم 15 من العلاج بفينيتوكلاكس / 5-أزاسيتيدين / سيدازوريدين (نتيجة من الشكل 4C). في هذه العينة ، يبدو أن أقوى ارتباط في تلطيخ البروتين الفوسفوري هو بين p-STAT5 و p-RPS6 (A) ، وكلاهما يتم تنظيمهما في هذه المجموعة التجريبية بعد العلاج (الشكل 4E). يبدو أن هناك علاقة أقل بين p-STAT5 و p-ERK (B). الأهم من ذلك ، أن حجم الخلية (الذي تم تقييمه باستخدام FSC-A) ليس مساهما رئيسيا في إيجابية p-STAT5 الإجمالية ، مما يسلط الضوء على أن إيجابية التلوين ليست مجرد نتاج لحجم الخلية (C). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

الخطوات الحاسمة
يتطلب استخدام التقنيات القائمة على المناعة في دراسة مسارات الإشارات المعقدة من خلال الكشف المحدد عن البروتينات الفوسفورية التحكم بإحكام في المتغيرات التجريبية22 ، وإعداد العينة بدقة ، واستخدام تقنيات تكميلية للتحقق من الصحة. يضمن دمج هذه الممارسات قابلية تكرار البيانات ودقتها وقوتها ، مما يساهم في النهاية في استنتاجات بيولوجية أكثر موثوقية. لا تعزز هذه الجهود الصرامة العلمية للطريقة فحسب ، بل تعمل أيضا على توسيع قابليتها للتطبيق في الدراسات المعقدة لإشارات الخلية وتنظيمها. يعد التخدير السليم والتعامل اللطيف أمرا بالغ الأهمية لتقليل الإجهاد الفسيولوجي ، والذي يمكن أن يغير النتائج التجريبية بشكل كبير ، لا سيما في الدراسات التي تركز على الاستجابات المناعية أو مسارات الإشارات. يساعد ضمان بروتوكولات المسكنات المناسبة في الحفاظ على رفاهية مع منع الإجهاد المرتبط بالألم الذي قد يتداخل مع البيانات. يعد الحفاظ على الظروف المعقمة أثناء الإجراء أمرا حيويا للوقاية من العدوى ، والتي يمكن أن تؤدي إلى استجابات التهابية وربما إرباك النتائج التجريبية. يتضمن ذلك تعقيم المعدات واستخدام قفازات نظيفة وتطهير موقع الشفط جيدا.

البروتينات الفسفرة معرضة بشدة لإزالة الفسفرة بواسطة الفوسفاتاز أثناء التلاعب بالعينات البيولوجية22،23. للحفاظ على حالات الفسفرة أثناء المعالجة ، يعد التثبيت الفوري أمرا ضروريا. تم اختبار طريقتين مختلفتين للتثبيت / النفاذية: مجموعة التثبيت/النفوذ الخلوي وطريقة الفورمالديهايد / الميثانول الشائعة الموضحة في البروتوكول. من بين هذه ، قدمت الطريقة القائمة على الميثانول نتائج أنظف مع إشارات مضان أكثر إشراقا ، مما يجعلها الخيار المفضل. بعد التثبيت ، يمكن تخزين العينات على المدى القصير عند -20 درجة مئوية أو على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية. في التجارب ، أسفرت العينات الثابتة المخزنة لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر عند -80 درجة مئوية عن نتائج متسقة. بالنسبة لتلوين الأجسام المضادة ، يمكن أن تعزز الحضانة الليلية الدقة ، خاصة بالنسبة لتحولات الفسفرة الدقيقة ، على الرغم من أن هذا يعتمد على التجربة المحددة وتأثيرات الدواء قيد التحقيق. كما تم اختبار حضانة أقصر لمدة ساعة واحدة على الجليد ، المحمي من الضوء ، مما أدى إلى نتائج مقبولة في بعض الحالات. لضمان تقييم دقيق لضوضاء الخلفية ، يوصى باستخدام عناصر تحكم النمط المتماثل كمرجع للربط غير المحدد ، كما هو موضح في الشكل 3.

تعديلات التقنية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
لتطوير الكفاءة الفنية ، يمارس المتدربون في مجموعتنا تقنية إدخال الإبرة على الفئران التي تم القتل الرحيم ، حيث يمكن تأكيد التنسيب المناسب عن طريق التشريح. يتم تنفيذ إجراء الحية بكفاءة أكبر من قبل اثنين من المشغلين ، حيث يمكن للمرء التركيز على التطلعات بينما يتم تخصيص المساعد لمهام مراقبة والتعامل مع العينات. في حالات نادرة حيث لا يمكن الحصول على شفط بعد عدة محاولات ، ينصح بإجهاض الإجراء لأن خطر الإصابة يزداد مع كل محاولة. مراقبة بعد الإجراء لها نفس القدر من الأهمية. تضمن مراقبة علامات العدوى أو الألم أو الإجهاد رفاهية الفئران وموثوقية الدراسة. يجب أن تدعم ظروف السكن التعافي ، مع الفراش والتغذية المناسبة لتقليل الضغوطات الخارجية.

لتحليل قياس التدفق الخلوي ، يوصى بمعالجة جميع العينات الثابتة والمحفوظة من أيام شفط نخاع العظم المختلفة في وقت واحد. يمكن أن تؤثر الاختلافات في ترطيب العينة وتلطيخها بسبب الاختلافات في أيام المناولة أو المشغلين على حساسية التألق التي اكتشفها مقياس الخلوي. لضمان نتائج متسقة ، قم بتحسين إعدادات جهد مقياس الخلوي للحفاظ على جميع العينات الملطخة ضمن نطاق الكشف قبل المتابعة. يظهر بروتين Alexa Fluor 488 المترافق p-4EBP1 أعلى سطوع بين العلامات الموجودة في هذه اللوحة ، مما يجعله مرجعا موثوقا به لتعيين نطاق الكشف الأقصى. في حين أن لوحة الأجسام المضادة المقدمة في هذا البروتوكول لا تتطلب تعديلات تعويض ، فقد يختلف هذا اعتمادا على مقياس التدفق الخلوي الطيفي المستخدم.

القيود
أحد القيود الرئيسية لهذه التقنية هو عدد الخلايا المستخرجة أثناء شفط نخاع العظم. لضمان نتائج موثوقة ، من الضروري تلطيخ ما يكفي من الخلايا لتحليل ما لا يقل عن 10,000 خلية لكل عينة. يمكن أن يؤدي تحليل عدد قليل جدا من الخلايا إلى اختلافات كبيرة بين العينات ، مما يضر بدقة البيانات وقابليتها للتفسير. يعد ضمان عدد كاف من الخلايا أمرا بالغ الأهمية للدراسات الميكانيكية القوية والقابلة للتكرار.

لتحليل البيانات ، يتم تطبيق استراتيجية البوابات الموضحة في الشكل 3 أ . أولا ، بعد استبعاد الزوجيات ، يتم تحديد الخلايا ذات الأهمية باستخدام جسم مضاد CD45 بشري مقترنا ب BUV395. بعد ذلك ، يتم إجراء بوابة الخلايا الحية باستخدام Zombie NIR. أخيرا ، يتم حساب متوسط شدة التألق (MFI) لكل بروتين فوسفوري (الشكل 3 ب). تم بوابات جميع الخلايا التي تم تحليلها لجميع البروتينات الفسفرية باستخدام نفس الإستراتيجية ، مما يضمن الاتساق وقابلية المقارنة عبر مجموعات خلايا AML.

قيد آخر لهذه الطريقة هو احتمال حدوث ضوضاء في الخلفية ، والتي يمكن أن تنشأ عن ارتباط الأجسام المضادة غير المحدد ، أو الغسيل غير الكافي ، أو التألق الذاتي للخلية ، أو النفاذية غير السليمة. قد يؤثر هذا على خصوصية الإشارة ويقلل من دقة تحليل قياس التدفق الخلوي للتدفق الفوسوفي. بالنسبة للمستخدمين الذين يواجهون هذه المشكلات ، يوصى بخطوة غسيل إضافية لتقليل ضوضاء الخلفية ، ويمكن استخدام كواشف حجب FC لتقليل الارتباط غير المحدد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يتداخل تألق الخلايا الميتة مع النتائج ، مما يجعل استخدام أصباغ البقاء أمرا ضروريا. الأهم من ذلك ، من أجل التحليل الدقيق ، يجب ألا يقل عدد الخلايا التي تم تحليلها عن 500 خلية ابيضاض الدم النقوي الحاد لضمان نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. من المهم أيضا التأكد من استخدام عدد مماثل من الخلايا أثناء التلوين للحفاظ على الاتساق عبر العينات. على الرغم من هذه القيود ، يمكن أن يؤدي التحسين الدقيق للضوابط واستراتيجيات البوابات إلى تعزيز موثوقية الطريقة.

أهمية التقنية
تم بالفعل نشر تقنية شفط نخاع العظم3 ؛ ومع ذلك ، يتم تضمين تقنية محدثة في هذا البروتوكول مع شرح يسلط الضوء على ميزتين: تحسين الشلل واستخدام نهج الإبرتين لتعزيز الدقة والاتساق في شفط نخاع العظم ، ومنع أي مشكلة في انسداد الإبرة بشظايا العظام. بالنسبة للدراسات الطولية ، يمكن إجراء شفط الفخذ عدة مرات ، مما يوفر طريقة قوية لتتبع التغيرات البيولوجية بمرور الوقت في الفردية. يوصى بفترة تعافي لا تقل عن شهر واحد بين الطموحات على نفس عظم الفخذ للسماح بالشفاء الكافي للعظام وتجديد نخاع العظام. عند استخدام عظم الفخذ المقابل ، يكفي فاصل زمني أقصر لمدة أسبوع واحد لضمان تعافي الفأر من آثار التسكين والتخدير دون إحداث إجهاد لا داعي له أو تباين فسيولوجي.

إجمالا ، توفر تقنية شفط نخاع عظم الفئران وقياس التدفق الخلوي هذه رؤى قيمة حول مسارات الإشارات الرئيسية ، بما في ذلك JAK / p-STAT5 و mTORC1 / p-4EBP1 و mTORC1 / p-RPS6 و MEK / p-ERK1 / 2. تلعب هذه المسارات أدوارا مهمة في مقاومة العلاج في ابيضاض الدم النقوي الحاد. تسمح هذه التقنية بأخذ عينات متكررة من نفس ، مما يتيح المراقبة في الوقت الفعلي لتطور المرض والاستجابة للعلاج على مستوى الخلية الواحدة.

يلتقط قياس الفوسفور الخلوي أحداث الفسفرة ويحافظ على عدم التجانس الخلوي4،23،24. هذا يجعله ذا قيمة خاصة لفهم الاستجابات الخلوية الديناميكية للعلاج في مجموعات سكانية فرعية معينة من سرطان الكريات.

التطبيقات المستقبلية
يوفر هذا البروتوكول أداة قيمة لدراسة الآليات الأساسية للتكيف مع العلاج وظهور المقاومة في ابيضاض الدم النقوي الحاد ، مما يمهد الطريق لرؤى أعمق والتطورات العلاجية المحتملة. يمكن للدراسات المستقبلية دمج هذا النهج مع النسخ أحادية الخلية أو البروتينات لتشريح الآليات الجزيئية التي تقود المقاومة وتطورالمرض 25. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تطبيق هذه الطريقة على الأورام الخبيثة الدموية الأخرى أو الحالات الالتهابية يمكن أن يوسع تأثيرها في الأبحاث الانتقالية.

من خلال تحسين هذا البروتوكول ومعالجة حدوده ، يمكن أن يصبح هذا النهج طريقة قياسية لدراسة إشارات البروتين الفوسفوري في أمراض الدم ، مما يساعد في النهاية في تطوير استراتيجيات علاجية أكثر فعالية. في الختام ، يوفر هذا البروتوكول أداة قيمة لدراسة الآليات الأساسية للتكيف مع العلاج وظهور المقاومة في ابيضاض الدم النقوي الحاد ، مما يمهد الطريق لرؤى أعمق والتطورات العلاجية المحتملة.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال المنح الانتقالية ل LH و FEM من مؤسسة كول ، ومنح من جمعية سرطان الدم والأورام اللمفاوية في كندا والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (PJT-186019) إلى LH و FEM. FEM هو عالم إكلينيكي FRSQ Junior 2 و LH هو عالم FRSQ Junior 2. VG حاصل على زمالة الدكتوراه من مؤسسة كول. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender بموجب اتفاقية مرخصة. تم إنشاء مخططات قياس التدفق الخلوي باستخدام برنامج FlowJo. شكر خاص للدكتور كولين كريست وفيكتوريا ريتشارد لمنحهما الوصول إلى منشأة جراحة الخاصة بهما.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringes 25G x 5/8 TW BD Biosciences#309626Syringes for bone marrow aspiration
1.7 mL Microcentrifuge TubesFroggaBio#LMCT1.7BTo aliquot the cells recovered by bone marrow aspiration
BD Horizon Brilliant Stain BufferBD Biosciences#563794For staining processes
BuprenorphineFidelis Animal HealthEthiqa XRAnalgesia for mice
CellDrop FL UnlimitedFroggaBio#CellDrop FL- UNLTDFor cell count
D-PBSWisent Inc.#311-425-CLMedia for cells recovered by bone marrow aspiration
Eppendorf Centrifuge 5427 RMillipore Sigma#EP5429000260
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Premium CAWisent Inc.#090-450For staining processes
Formaldehyde solutionMillipore Sigma#F1635Cells Permeabilization
humanCD45 [HI30] antibody BD Biosciences#563792Antibody coupled with BUV395
ID7000 Spectral Cell AnalyzerSonySpectral flow cytometer analyzer
Isoflurane 99.9% liquidMcKesson#803250Anesthesia for mice
Isospire (isoflurane) Inhalation AnestheticDechraAnesthesia for mice
Live/dead AO/PIFroggaBioCD-AO/PI-1.5For cell count
Live/dead Zombie NIRBioLegend+B6:C12#423106For spectral flow cytometry
Methanol solutionMillipore Sigma#179957Cells Fixation
P-4EBP1 (Thr37/46) [236B4] antibodyCell Signaling Technology#2846Antibody coupled with Alexa Fluor 488
p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204) [197G2] antibodyCell Signaling Technology#13148Antibody coupled with Alexa Fluor 647
p-RPS6 (Ser240/244) [D68F8] antibodyCell Signaling Technology#9468Antibody coupled with Alexa Fluor 594
p-STAT5 (Tyr694) [D47E7] antibodyCell Signaling Technology#14603Antibody coupled with PE
Rabbit IgG Control [DA1E]Cell Signaling Technology#2975Antibody coupled with Alexa Fluor 488
Rabbit IgG Control [DA1E]Cell Signaling Technology#2985Antibody coupled with Alexa Fluor 647
Rabbit IgG Control [DA1E]Cell Signaling Technology#8760Antibody coupled with Alexa Fluor 594
Rabbit IgG Control [DA1E]Cell Signaling Technology#5742SAntibody coupled with PE
Sanitizing wipesUnited Canada#UCDWPR-9022Disinfection for bone marrow aspiration

References

  1. Ferrara, F., Schiffer, C. A. Acute myeloid leukaemia in adults. Lancet. 381 (9865), 484-495 (2013).
  2. Döhner, H., et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood. 129 (4), 424-447 (2017).
  3. Chung, Y. R., Kim, E., Abdel-Wahab, O. Femoral bone marrow aspiration in live mice. J Vis Exp. (89), e51660(2014).
  4. Haas, A., Weckbecker, G., Welzenbach, K. Intracellular Phospho-Flow cytometry reveals novel insights into TCR proximal signaling events. A comparison with Western blot. Cytometry A. 73 (9), 799-807 (2008).
  5. Perbellini, O., Cavallini, C., Chignola, R., Galasso, M., Scupoli, M. T. Phospho-specific flow cytometry reveals signaling heterogeneity in t-cell acute lymphoblastic leukemia cell lines. Cells. 11 (13), 2072(2022).
  6. Kornblau, S. M., et al. Simultaneous activation of multiple signal transduction pathways confers poor prognosis in acute myelogenous leukemia. Blood. 108 (7), 2358-2365 (2006).
  7. Perl, A. E. The role of targeted therapy in the management of patients with AML. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2017 (1), 54µ65(2017).
  8. Márton, A., et al. The roles of phosphorylation of signaling proteins in the prognosis of acute myeloid leukemia. Pathol Oncol Res. 30, 1611747(2024).
  9. Levis, M. FLT3 mutations in acute myeloid leukemia: what is the best approach in 2013. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 220-226 (2013).
  10. Roux, P. P., Topisirovic, I. Signaling pathways involved in the regulation of mRNA translation. Mol Cell Biol. 38 (12), e00070-e00118 (2018).
  11. Nepstad, I., Hatfield, K. J., Grønningsæter, I. S., Reikvam, H. The PI3K-Akt-mTOR signaling pathway in human Acute Myeloid Leukemia (AML) Cells. Int J Mol Sci. 21 (8), ijms21082907(2020).
  12. Jia, X., Zhou, H. Phospho-eIF4E: A new target for acute myeloid leukemia. Curr Protein Pept Sci. 22 (4), 328-335 (2021).
  13. Ghosh, J., Kapur, R. Role of mTORC1-S6K1 signaling pathway in regulation of hematopoietic stem cell and acute myeloid leukemia. Exp Hematol. 50, 13-21 (2017).
  14. Park, H. J., et al. Therapeutic resistance in acute myeloid leukemia cells is mediated by a novel ATM/mTOR pathway regulating oxidative phosphorylation. Elife. 11, 79940(2022).
  15. Oki, T., et al. Imaging dynamic mTORC1 pathway activity in vivo reveals marked shifts that support time-specific inhibitor therapy in AML. Nat Commun. 12 (1), 245(2021).
  16. Lee, H. J., Daver, N., Kantarjian, H. M., Verstovsek, S., Ravandi, F. The role of JAK pathway dysregulation in the pathogenesis and treatment of acute myeloid leukemia. Clin Cancer Res. 19 (2), 327-335 (2013).
  17. Liu, A. C. H., et al. Targeting STAT5 signaling overcomes resistance to IDH Inhibitors in acute myeloid leukemia through suppression of stemness. Cancer Res. 82 (23), 4325-4339 (2022).
  18. Sung, P. J., Sugita, M., Koblish, H., Perl, A. E., Carroll, M. Hematopoietic cytokines mediate resistance to targeted therapy in FLT3-ITD acute myeloid leukemia. Blood Adv. 3 (7), 1061-1072 (2019).
  19. Song, P., Yang, F., Jin, H., Wang, X. The regulation of protein translation and its implications for cancer. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 68(2021).
  20. This Standard Operating Procedure (SOP) describes methods for anesthetizing mice. , McGill University. https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf (2024).
  21. Tech Team Tips: Preparing a Sample with AO/PI. , DeNovix. https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi (2021).
  22. Suni, M. A., Maino, V. C. Flow cytometric analysis of cell signaling proteins. Methods Mol Biol. 717, 155-169 (2011).
  23. Krutzik, P. O., Irish, J. M., Nolan, G. P., Perez, O. D. Analysis of protein phosphorylation and cellular signaling events by flow cytometry: techniques and clinical applications. Clin Immunol. 110 (3), 206-221 (2004).
  24. Chen, W., Luu, H. S. Immunophenotyping by multiparameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 1633, 51-73 (2017).
  25. Perez, O. D., Nolan, G. P. Phospho-proteomic immune analysis by flow cytometry: From mechanism to translational medicine at the single-cell level. Immunol Rev. 210, 208-228 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 220

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved