Isolamento de células estromais mesenquimais derivadas do cordão umbilical alto BAMBI^humanoMFGE8^alto

O isolamento de MSCs^altasde MFGE8^BAMBI , um dos três principais subgrupos que constituem UC-MSCs humanas heterogêneas, é útil para entender completamente as características e funções desse subtipo para sua futura aplicação para melhorar a eficácia clínica em doenças específicas. Aqui, apresentamos um método para classificar BAMBI^altoMFGE8^alto UC-MSCs.

As células-tronco estromais/tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical (UC-MSCs) apresentam baixa imunogenicidade e potentes efeitos imunomoduladores para o tratamento de várias doenças. As UC-MSCs humanas são uma população heterogênea que consiste em três subpopulações principais com diferentes formas celulares, taxas de proliferação, habilidades de diferenciação e funções reguladoras imunológicas. Anteriormente, descobriu-se que as UC-MSCs^{BAMBI altas}MFGE8, o primeiro subgrupo isolado com sucesso das UC-MSCs, não aliviavam a nefrite lúpica. Portanto, a função e o mecanismo subjacente desse subgrupo na terapia com MSC para doenças permanecem desconhecidos. É necessário isolar e investigar ainda mais as CTMs^altasde MFGE8^em termos de fenótipo, metabolismo e função para entender completamente a natureza desse subgrupo de CTMs. Neste protocolo, descrevemos um método detalhado para isolar a subpopulação alta^deMFGE8^BAMBI de UC-MSCs humanas. A subpopulação de UC-MSCs é marcada com dois marcadores de superfície, BAMBI e MFGE8, por classificação por citometria de fluxo. As células isoladas são cultivadas e verificadas por análise de citometria de fluxo. Os genes específicos expressos nas CTMs^{de UC altas}de MFGE8^de BAMBI são identificados por RT-qPCR. Este protocolo resulta em uma classificação de células altamente eficiente e pura e descreve os perfis de marcadores das BAMBI^highMFGE8^high UC-MSCs.

As células-tronco estromais/tronco mesenquimais humanas (CTMs) são progenitores somáticos capazes de se diferenciar em osteócitos, adipócitos, condrócitos e outros tipos de células¹. As CTMs foram isoladas pela primeira vez da medula óssea e são amplamente derivadas do cordão umbilical, tecido adiposo e outros tecidos². Como as UC-MSCs são facilmente obtidas e exibem baixa imunogenicidade e efeitos imunossupressores, elas são amplamente aplicadas em ensaios clínicos para tratar várias doenças ^3,4,5. Embora a terapia com CTM mostre potencial promissor para o tratamento de doenças, os efeitos terapêuticos são inconsistentes entre os indivíduos⁶. No entanto, a razão para a instabilidade da terapia com MSC ainda não está clara.

Flutuações moleculares, morfologia, capacidade de diferenciação e função terapêutica compreendem a heterogeneidade das CTMs. Alguns estudos também postularam que as MSCs constituem subpopulações com diferentes funções ^7,8 e exploraram a heterogeneidade das MSC por meio do sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) ^{9 , 10} . Os resultados revelaram que as UC-MSCs humanas têm subpopulações distintas com características transcriptômicas específicas, enquanto poucos estudos isolaram com sucesso as chamadas subpopulações de MSC. Anteriormente, dissecamos UC-MSCs humanas em três subgrupos de acordo com suas assinaturas por meio de scRNA-seq e análise de bioinformática, nos quais a subpopulação BAMBI^highMFGE8^high UC-MSC foi purificada e testada funcionalmente¹¹. No entanto, esse subgrupo não conseguiu aliviar a nefrite lúpica. Assim, é necessário testar os efeitos terapêuticos das CTMs^altasde MFGE8^de BAMBI em outros distúrbios para entender suas funções autênticas.

Este protocolo descreve métodos para isolar o subgrupo BAMBI^altoMFGE8^alto de UC-MSCs humanas por meio de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) por citometria de fluxo e as características do subgrupo^{BAMBI alto}MFGE8 alto.

Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1989 e aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Drum Tower Afiliado da Faculdade de Medicina da Universidade de Nanjing (número de aprovação: 202019701). Os cordões umbilicais humanos foram obtidos de mães saudáveis no Hospital Afiliado Drum Tower da Faculdade de Medicina da Universidade de Nanjing após o parto natural, que deram seu consentimento informado para seu uso neste trabalho. As CTMs-UC primárias foram isoladas de cordões umbilicais humanos, conforme relatado anteriormente¹¹.

1. Cultura e identificação de UC-MSC antes do isolamento

1. Quando as MSCs atingirem 70-80% de confluência (P0), lave as células uma vez com PBS e adicione 1 mL de tripsina-EDTA a 0,25% por 2 min a 37 ° C. Em seguida, adicione 9 mL de meio completo para neutralizar a tripsina, transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugue a 300 × g por 5 min para coletar as células. Rejeitar o sobrenadante e adicionar o meio completo adequado para ressuspender as células. Transferir as células de cada placa para três frascos T75 (P1) e cultivar numa estufa de células a 37 °C e 5% de CO₂.
2. Depois de passar as UC-MSCs 2x por tripsinização, em P3, colha as células pelas mesmas etapas descritas na etapa 1.1. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda as células no tampão de coloração FACS (1x PBS contendo 2% de FBS) e conte-as. Adicione o tampão de coloração FACS a uma concentração final de 5-10 × 10⁶ células/mL e mantenha a suspensão celular no gelo.
3. Distribua 100 μL por tubo desta suspensão celular em diferentes tubos de 1,5 mL. Adicione controles de isotipo e anticorpos FACS contra CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 e HLA-DR (todos a 1:200) às células a 4 ° C por 30 min.
4. Lave as células 2x com o tampão de coloração FACS e centrifugue a 300 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os precipitados em 200 μL de tampão de coloração FACS para análise de citometria de fluxo para identificar marcadores MSC.

2. Isolamento de BAMBI^alto MFGE8^alto UC-MSCs por citometria de fluxo

1. Cultive UC-MSC a uma densidade de aproximadamente 5-10 × 10⁶ células ao isolar BAMBI^altoMFGE8^alto UC-MSCs. Dissocie as células com EDTA 0,5 mM por 5 min até que comecem a ter uma morfologia redonda, adicione o meio completo para transferir as células para um tubo cônico de 15 mL e pipete a suspensão celular para cima e para baixo várias vezes para preparar uma suspensão unicelular. Use 10 μL da suspensão celular para contar as células e calcular o número total de células colhidas. Centrifugar o tubo cónico com a suspensão celular a 300 × g durante 5 min para recolher as células.
2. Ressuspenda as células em 1 mL de meio completo até uma concentração final de 5-10 × 10⁶ células / mL e mantenha a suspensão celular no gelo.
3. Divida as células em quatro tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (somente células em branco; Células marcadas com BAMBI; Células marcadas com MFGE8; e células marcadas com BAMBI e MFGE8).
4. Adicione anticorpos primários em concentrações apropriadas (MFGE8 e BAMBI, ambos a 1:100) aos tubos, misture e incube as células em temperatura ambiente por 15 min.
5. Lave as células marcadas uma vez com 1x PBS e centrifugue a 300×g por 5 min. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1 mL de meio completo, adicione anticorpos secundários fluorescentes conjugados (cabra anti-coelho IgG H & L Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647, todos a 1: 1.000) às células, misture e incube as células em temperatura ambiente por 15 minutos no escuro.
6. Lave as células marcadas uma vez com 1x PBS, conforme descrito na etapa 2.5. Ressuspenda as células em 500 μL de meio completo, filtre através de um filtro de células de 70 μm para eliminar aglomerados e detritos e transfira o filtrado para um tubo de 15 mL para classificação por citometria de fluxo.
7. Execute o tubo celular em branco sem adicionar um anticorpo (controle negativo) e ajuste a dispersão direta (FSC) e a dispersão lateral (SSC) para bloquear a escala da população negativa com coloração de anticorpos.
8. Execute os tubos celulares marcados com anticorpos únicos (ou seja, MFGE8 + cabra anti-coelho IgG H & L Alexa Fluor 488, ou BAMBI + cabra anti-coelho IgG H & L Alexa Fluor 647) como um controle de gating para determinar onde a positividade começa na parcela.
9. Execute o(s) tubo(s) de amostra experimental(is) para classificar e coletar a população^{de células altas de alto}MFGE8 do BAMBI.
10. Coloque as MSCs BAMBI^altasMFGE8^altas classificadas em uma placa de 24 poços e cultive as células em uma incubadora de células a 37 ° C e 5% de CO₂.
11. Quando as MSCs^{altas de}MFGE8 BAMBI classificadas crescerem por duas passagens para obter células suficientes, dissocie as células e execute uma análise pós-classificação para garantir a pureza das populações de células classificadas por citometria de fluxo, conforme descrito nas etapas 2.1-2.9. Alternativamente, examine a pureza das células classificadas com imunofluorescência convencional contra a expressão humana de BAMBI e MFGE8 se o número de células coletadas for muito pequeno.

3. Caracterização das CTMs^altas de MFGE8^BAMBI

1. Cultive as MSCs^{BAMBI altas}MFGE8^em uma placa de 12 poços, examine sua morfologia celular ao microscópio e compare-as com a de MSCs não classificadas.
   NOTA: Em geral, as células^{altas de}MFGE8 BAMBI crescem mais rápido do que as UC-MSCs não classificadas.
2. Quando as células estiverem aproximadamente 90% confluentes na placa de 12 poços, aspire o meio de cultura celular, lave as células uma vez com 1x PBS e adicione 500 μL de reagente de extração de RNA às células. Agite o prato lentamente à temperatura ambiente (RT) por 5 min.
3. Pipete a mistura e transfira-a para um tubo livre de RNase e DNase. Adicione 100 μL de clorofórmio, tampe o tubo e agite a mistura vigorosamente por vórtice por 15 s. Em seguida, deixe o tubo em repouso por 3 min.
4. Centrifugar o tubo durante 15 min a 11.000 × g e 4 °C.
5. Transferir cerca de 200 μL da camada aquosa superior para um novo tubo. Adicione o mesmo volume de isopropanol e pipete completamente para cima e para baixo várias vezes. Em seguida, deixe a mistura repousar em RT por 10 min.
6. Centrifugue por 15 min a 11.000 × g e 4 °C. Descarte o sobrenadante.
7. Adicione 500 μL de etanol a 75% ao pellet no tubo e inverta o tubo suavemente várias vezes.
8. Centrifugue o tubo por 5 min a 6.000 × g e 4 °C. Descarte o sobrenadante. Repita a centrifugação uma vez por 10 s a 6.000 × g, aspire cuidadosamente o fluido restante com pipeta e seque o tubo em RT.
9. Adicione 10 μL de água livre de RNase para dissolver o pellet de RNA e meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro.
10. Siga as instruções do fabricante para sintetizar o cDNA de primeira fita de até 1 μg de RNA total.
11. Use um kit qPCR para detectar e quantificar a expressão gênica, de acordo com as instruções do fabricante.
    NOTA: As sequências dos primers de DNA usados estão listadas na Tabela 1.

A Figura 1 mostra os perfis de expressão de marcadores de superfície celular de UC-MSCs humanas. As MSCs cultivadas foram fortemente positivas para a expressão de CD44, CD73, CD90 e CD105 e negativas para a expressão de CD14, CD34, CD45, CD79 e HLA-DR. As MSCs^altasde MFGE8^BAMBI foram classificadas de UC-MSCs humanas cultivadas, e sua expressão de BAMBI e MFGE8 foi reanalisada por citometria de fluxo após expansão por 3-4 passagens (Figura 2). Nesse processo, a frequência de MSCs altas de MFGE8^{BAMBI flutuou}dependendo do doador e do método de dissociação (Figura 3 e Figura 4). A Figura 5 mostra uma série de genes de assinatura altamente expressos nas MSCs^altasde MFGE8 altas do BAMBI em comparação com as MSCs não classificadas, conforme determinado por RT-qPCR.

Figura 1: Imunofenotipagem de UC-MSCs identificadas por análise de citometria de fluxo. As UC-MSCs são positivas para CD44, CD73, CD90 e CD105 e negativas para CD14, CD34, CD45, CD79 e HLA-DR. O histograma preto representa o controle do isotipo do anticorpo e o histograma vermelho representa o sinal do anticorpo. Abreviaturas: UC-MSCs = células-tronco estromais/estaminais mesenquimais derivadas do cordão umbilical; HLA-DR = antígeno leucocitário humano-DR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Pureza de MSCs^altasde MFGE8^altas de BAMBI após classificação por análise de citometria de fluxo. Os resultados da análise de citometria de fluxo de UC-MSCs sem coloração de anticorpos (canto superior esquerdo) e com coloração MFGE8 e BAMBI antes (meio superior) e depois da classificação celular (canto superior direito) são mostrados. Os resultados da coloração única MFGE8 (inferior esquerda) e BAMBI (inferior direita) também são mostrados. Abreviaturas: BAMBI = proteína morfogênica óssea e inibidor ligado à membrana de ativina; MFGE8 = fator de crescimento epidérmico 8 do glóbulo de gordura do leite; CTMs = células-tronco estromais mesenquimais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Diferentes frequências de MSCs altas de MFGE8^{BAMBI altas}dissociadas com diferentes métodos. Os resultados da análise de citometria de fluxo de UC-MSCs do mesmo doador submetido à dissociação tripsina-EDTA (esquerda), tratamento apenas com EDTA (meio) e reagente de dissociação de células livres de tripsina (direita) são mostrados. Abreviaturas: BAMBI = proteína morfogênica óssea e inibidor ligado à membrana de ativina; MFGE8 = fator de crescimento epidérmico 8 do glóbulo de gordura do leite; CTMs = células-tronco estromais/estaminais mesenquimais; TE = tripsina-EDTA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: A frequência de MSCs altas de MFGE8^de BAMBI^dediferentes doadores. As frequências de MSCs altas de MFGE8^{BAMBI variam}entre as amostras de doadores 1 (esquerda), 2 (meio) e 3 (direita). Abreviaturas: BAMBI = proteína morfogênica óssea e inibidor ligado à membrana de ativina; MFGE8 = fator de crescimento epidérmico 8 do glóbulo de gordura do leite; CTMs = células-tronco estromais mesenquimais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Genes de assinatura altamente expressos nas MSCs^altasde MFGE8 BAMBI examinadas por RT-qPCR. Abreviaturas: BAMBI = proteína morfogênica óssea e inibidor ligado à membrana de ativina; MFGE8 = fator de crescimento epidérmico 8 do glóbulo de gordura do leite; CTMs = células-tronco estromais/estaminais mesenquimais; RT-qPCR = reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa. Teste t de Student. *, P<0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Sequências dos primers de DNA usados neste protocolo.

Este protocolo descreve como isolar e enriquecer a subpopulação alta^deMFGE8^BAMBI de UC-MSCs humanas. O método é importante para um estudo mais aprofundado da morfologia, crescimento e função deste subgrupo de MSC. Algumas etapas são vitais para o isolamento bem-sucedido e alto rendimento de células^{BAMBI altas}MFGE8 altas.

Primeiro, o aspecto técnico mais crítico a ser considerado é o uso de uma solução de dissociação celular apropriada no presente protocolo. Embora o convencional 0,25% de tripsina-EDTA seja usado para dissociar MSCs para passagem, é melhor utilizar uma solução de EDTA livre de enzimas para classificar o subgrupo^{BAMBI alto}MFGE8 alto porque o tratamento com tripsina reduz o rendimento de BAMBI^altoMFGE8^alto MSCs quando eles são classificados (Figura 3). Uma possível razão pode ser que a tripsina prejudique a distribuição das proteínas transmembranares MFGE8 e BAMBI na superfície celular, como acontece com outras proteínas¹². Em contraste, o uso de solução de EDTA tem pouco efeito na expressão da superfície celular de MFGE8 e BAMBI. Em segundo lugar, o protocolo de classificação de células descreve as configurações de parâmetros para a seleção dos MSCs^altosde MFGE8^BAMBI. É necessário estabelecer uma amostra em branco e amostras únicas marcadas com anticorpos para controlar com precisão as MSCs^{altas de}MFGE8 altas BAMBI exatas para classificação FACS.

Ao contrário da tripsinização, o desprendimento de UC-MSCs humanas por EDTA é recomendado para classificar as MSCs^altasde MFGE8 BAMBI neste protocolo. No entanto, outras modificações envolvendo métodos de dissociação celular leve, como Dispase e Tryple E^13,14, também podem ser aplicáveis para a colheita de MSCs^altasde MFGE8 BAMBI, mas precisam ser verificadas. Notavelmente, a dissociação a longo prazo de UC-MSCs deve ser evitada, uma vez que a dissociação excessiva tende a reduzir a viabilidade celular. Além disso, inibidores de ROCK (por exemplo, Y-27632 a 10 μM), que previnem a apoptose celular¹⁵, podem ser adicionados ao meio de cultura celular para aumentar a sobrevivência de MSCs^altas de MFGE8BAMBI classificadas, reduzindo seu grau de apoptose. Além disso, recomenda-se reavaliar a pureza das MSCs^altasde MFGE8^altas BAMBI em expansão regular após a classificação para garantir que elas mantenham suas identidades primárias, especialmente antes de realizar mais testes de ensaio funcional.

Embora não tenha havido correlação entre a razão de MSC^altasde MFGE8^alto e sexo de BAMBI, as proporções de CTMs^deMFGE8^altas foram adquiridas de diferentes doadores (Figura 4). Notavelmente, a proporção da subpopulação alta de MFGE8^de BAMBI^podevariar dependendo de diferentes passagens ou condições de cultura. Se a proporção de células^{altas de}MFGE8 BAMBI na população de UC-MSC for extremamente pequena, o presente protocolo não será bem aplicável. Outras limitações deste protocolo incluem danos celulares relativamente graves causados pelo método de classificação FACS, que facilmente leva à morte celular de uma proporção de MSCs^altasde MFGE8^BAMBI após a classificação celular. Além disso, os atuais métodos de classificação de anticorpos primários e secundários em duas etapas levam mais tempo e são menos eficientes para a classificação de células. Aplicações futuras de anticorpos BAMBI e MFGE8 diretamente conjugados com fluorescência são preferíveis para aumentar a eficiência de classificação de MSCs^{BAMBI alto}MFGE8^alto.

O isolamento de cada subpopulação de CTMs mistas é indispensável para revelar suas funções autênticas e mecanismos subjacentes no tratamento de doenças. Portanto, o presente método fornece uma ferramenta básica e vital para agrupar e investigar ainda mais as CTMs^dealto nível de MFGE8^para entender completamente sua natureza. A otimização futura das condições de cultura^{de células altas de}MFGE8 BAMBI produzirá um grande número dessas células na indústria para terapia com células-tronco para pacientes específicos na clínica.

Os autores declaram não ter conflitos de interesse.

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (concessão nº 82271843).