ヒトBAMBI^高MFGE8^高 臍帯由来間葉系間質細胞の単離

不均一なヒトUC-MSCを構成する3つの主要なサブグループの1つであるBAMBI^高MFGE8^高 MSCの単離は、このサブタイプの特性と機能を完全に理解するために役立ち、特定の疾患における臨床効果を改善するための将来の応用に役立ちます。ここでは、BAMBI^の高MFGE8^高 UC-MSCの選別方法を紹介します。

臍帯由来間葉系間質間質/幹細胞(UC-MSC)は、さまざまな疾患の治療に低い免疫原性と強力な免疫調節効果を示します。ヒトUC-MSCは、細胞形状、増殖速度、分化能力、免疫調節機能が異なる3つの主要な亜集団からなる不均一な集団です。以前、UC-MSCから単離に成功した最初のサブグループであるBAMBI^高MFGE8^高 UC-MSCは、ループス腎炎を緩和できないことがわかりました。したがって、疾患の MSC 療法におけるこのサブグループの機能と根本的なメカニズムは不明のままです。このMSCサブグループの性質を完全に理解するには、BAMBI^高MFGE8^高 UC-MSCを分離し、その表現型、代謝、および機能の観点からさらに調査する必要があります。このプロトコルでは、ヒトUC-MSCからBAMBI^高MFGE8^高 亜集団を単離するための詳細な方法について説明します。UC-MSCの亜集団は、フローサイトメトリーソーティングにより、BAMBIとMFGE8の2つの表面マーカーで標識されます。単離された細胞を培養し、フローサイトメトリー分析によって検証します。BAMBI^高MFGE8^高 UC-MSCで発現する特異的遺伝子は、RT-qPCRによって同定されます。このプロトコルは、高効率で純粋な細胞ソーティングをもたらし、BAMBI^高MFGE8^高 UC-MSCのマーカープロファイルを説明しています。

ヒト間葉系間質/幹細胞(MSC)は、骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、およびその他の細胞型に分化することができる体細胞前駆細胞です¹。MSCは最初に骨髄から単離され、臍帯、脂肪組織、およびその他の組織から広く由来します²。UC-MSCは容易に入手でき、免疫原性や免疫抑制効果が低いため、さまざまな疾患の治療のための臨床試験に広く適用されています^3,4,5。MSC療法は疾患の治療に有望な可能性を示していますが、治療効果は個人間で一貫していません⁶。しかし、MSC療法が不安定な理由はまだ不明です。

分子の揺らぎ、形態、分化能力、および治療機能は、MSCの不均一性を構成します。いくつかの研究では、MSC^{が異なる機能を持つ}亜集団を構成すると仮定し^7,8、シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)^9,10を通じてMSCの不均一性を調査しました。その結果、ヒトUC-MSCは特定のトランスクリプトーム特徴を持つ明確な亜集団を持っているのに対し、いわゆるMSC亜集団の単離に成功した研究はほとんどないことが明らかになりました。我々は以前に、scRNA-seqおよびバイオインフォマティクス解析により、ヒトUC-MSCをそのシグネチャーに従って3つのサブグループに解剖し、BAMBI^高MFGE8^高UC-MSC亜集団をさらに精製し、機能的に試験した¹¹。しかし、このサブグループはループス腎炎を緩和することができませんでした。したがって、BAMBI^高MFGE8^高MSCの治療効果を他の疾患でテストして、それらの真の機能を理解する必要があります。

このプロトコルでは、フローサイトメトリーによる蛍光活性化セルソーティング(FACS)を介してヒトUC-MSCからBAMBI^高MFGE8^高 サブグループを単離する方法と、BAMBI^高MFGE8^高 サブグループの特性について説明します。

本研究は、1989年のヘルシンキ宣言の原則に則り、南京大学医学部鼓楼病院の倫理委員会で承認されました(承認番号:202019701)。人間のへその緒は、自然分娩後に南京大学医学部の附属ドラムタワー病院の健康な母親から入手し、この作業での使用についてインフォームドコンセントを与えました。初代UC-MSCは、以前に報告されたようにヒトの臍帯から単離された¹¹。

1. 単離前のUC-MSCの培養と同定

1. MSCが70〜80%のコンフルエンス(P0)に達したら、細胞をPBSで一度洗浄し、0.25%トリプシン-EDTAの1mLを37°Cで2分間加えます。 次に、9 mLの完全培地を加えてトリプシンを中和し、細胞懸濁液を15 mLの遠心チューブに移し、300 × g で5分間遠心分離して細胞を回収します。上清を捨て、適切な完全培地を添加して細胞を再懸濁します。各ディッシュの細胞を3つのT75フラスコ(P1)に移し、細胞インキュベーターで37°C、5%_CO2で培養します。
2. トリプシン化によりUC-MSCを2回継代した後、P3で、ステップ1.1で説明したのと同じステップで細胞を回収します。遠心分離後、上清を捨てます。細胞をFACS染色バッファー(2% FBSを含む1x PBS)に再懸濁し、カウントします。FACS染色バッファーを最終濃度5-10 × 10⁶ 細胞/mLまで加え、細胞懸濁液を氷上に保ちます。
3. この細胞懸濁液のチューブあたり100 μLを異なる1.5 mLチューブに分配します。CD29、CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45、CD79、およびHLA-DR(すべて1:200)に対するアイソタイプコントロールとFACS抗体を細胞に4°Cで30分間添加します。
4. 細胞をFACS染色バッファーで2回洗浄し、300 × gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、沈殿物を200 μLのFACS染色バッファーに再懸濁して、フローサイトメトリー分析を行い、MSCマーカーを同定します。

2. フローサイトメトリーによるBAMBI^高 MFGE8^高 UC-MSCの単離

1. BAMBI^高MFGE8^高UC-MSCsを単離する際に、UC-MSCを約5-10×10⁶細胞の密度で培養します。細胞が丸い形態になり始めるまで、細胞を0.5 mM EDTAで5分間解離し、完全な培地を加えて細胞を15 mLのコニカルチューブに移し、細胞懸濁液を数回上下にピペットで動かして単一細胞懸濁液を調製します。10 μLの細胞懸濁液を使用して細胞をカウントし、採取した細胞の総数を計算します。細胞懸濁液を入れた円錐管を300 × gで5分間遠心分離し、細胞を回収します。
2. 細胞を1 mLの完全培地に再懸濁し、最終濃度5〜10 ×^{10 6} 細胞/mLまで戻し、細胞懸濁液を氷上に保ちます。
3. 細胞を4本の1.5 mL微量遠心チューブ(ブランク細胞のみ;BAMBI標識細胞;MFGE8標識細胞;およびBAMBIおよびMFGE8標識細胞の両方)。
4. 適切な濃度の一次抗体(MFGE8およびBAMBI、どちらも1:100)をチューブに添加し、混合し、細胞を室温で15分間インキュベートします。
5. 標識した細胞を1x PBSで一度洗浄し、300×gで5分間遠心分離します。上清を捨てます。細胞を1 mLの完全培地に再懸濁し、標識蛍光二次抗体(ヤギ抗ウサギIgG H&L Alexa Fluor 488およびAlexa Fluor 647、すべて1:1,000)を細胞に添加し、混合し、細胞を室温で暗所で15分間インキュベートします。
6. ステップ2.5で説明したように、標識した細胞を1x PBSで一度洗浄します。細胞を500 μLの完全培地に再懸濁し、70 μmの細胞ストレーナーでろ過して凝集物や破片を取り除き、濾液を15 mLチューブに移してフローサイトメトリーソーティングを行います。
7. 抗体を添加せずにブランクセルチューブを泳動し(ネガティブコントロール)、前方散乱光(FSC)と側方散乱(SSC)を調整して、抗体染色でネガティブ集団のスケールをゲートします。
8. 単一の抗体標識細胞チューブ(すなわち、MFGE8 + ヤギ抗ウサギIgG H&L Alexa Fluor 488、またはBAMBI+ヤギ抗ウサギIgG H&L Alexa Fluor 647)をゲーティングコントロールとして実行し、プロットのどこから陽性が始まるかを決定します。
9. 実験用サンプルチューブを走らせて、BAMBI^高MFGE8^{高細胞集団} を選別し、回収します。
10. 選別したBAMBI^高MFGE8^高 MSCを24ウェルプレートに播種し、細胞インキュベーターで37°Cおよび5%CO₂で細胞を培養します。
11. 選別したBAMBI^高MFGE8^高 MSCが2継代で増殖して十分な細胞を得たら、ステップ2.1〜2.9で説明したように、細胞を解離し、選別後の分析を実行して、フローサイトメトリーによって選別された細胞集団の純度を確保します。あるいは、採取した細胞の数が少なすぎる場合は、ヒトBAMBIおよびMFGE8の発現に対して従来の免疫蛍光法を用いて、選別した細胞の純度を調べます。

3. BAMBI^高 MFGE8^高 MSCの特性評価

1. 選別したBAMBI^高MFGE8^高 MSCを12ウェルプレートで増殖させ、顕微鏡で細胞形態を調べ、未選別MSCと比較します。
   注:一般に、BAMBI^の高MFGE8^高 細胞は、未分類のUC-MSCよりも速く増殖します。
2. 12ウェルプレートで細胞が約90%コンフルエントになったら、細胞培養培地を吸引し、細胞を1x PBSで1回洗浄し、500 μLのRNA抽出試薬を細胞に加えます。プレートを室温(RT)で5分間ゆっくりと振ってください。
3. 混合物をピペットで移し、RNaseおよびDNaseフリーのチューブに移します。100 μLのクロロホルムを加え、チューブにキャップをし、15秒間ボルテックスして混合物を激しく振とうします。次に、チューブをRTで3分間放置します。
4. チューブを11,000 × g 、4°Cで15分間遠心分離します。
5. 上部水層の約200μLを新しいチューブに移します。同量のイソプロパノールを加え、ピペットで数回上下に完全にピペットします。次に、混合物を室温で10分間放置します。
6. 11,000 × g 、4°Cで15分間遠心分離します。 上清を捨てます。
7. チューブ内のペレットに500μLの75%エタノールを加え、チューブを数回穏やかに反転させます。
8. チューブを6,000 × g 、4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨てます。遠心分離を6,000 × gで10秒間1回繰り返し、残りの液体をピペットで慎重に吸引し、RTでチューブを乾燥させます。
9. RNaseを含まない水10μLを加えてRNAペレットを溶解し、分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。
10. 製造元の指示に従って、最大1 μgの全RNAから一本鎖cDNAを合成します。
11. qPCRキットを使用して、製造元の指示に従って遺伝子発現を検出および定量します。
    注:使用したDNAプライマーの配列を 表1に示します。

図1は、ヒトUC-MSCの細胞表面マーカー発現プロファイルを示しています。培養MSCは、CD44、CD73、CD90、およびCD105の発現に対して強く陽性であり、CD14、CD34、CD45、CD79、およびHLA-DRの発現に対して陰性でした。BAMBI^の高MFGE8^高MSCは、培養されたヒトUC-MSCから選別し、そのBAMBIおよびMFGE8の発現を3-4継代拡大した後、フローサイトメトリーによって再解析しました(図2)。このプロセスでは、BAMBI^の高MFGE8^高MSCの頻度は、ドナーと解離の方法によって変動しました(図3および図4)。図5は、RT-qPCRによって決定された、BAMBI^高MFGE8^高MSCと未分類MSCを比較した一連の高発現シグネチャー遺伝子を示しています。

図1:フローサイトメトリー解析により同定されたUC-MSCのイムノフェノタイピング。 UC-MSCは、CD44、CD73、CD90、およびCD105に対して陽性であり、CD14、CD34、CD45、CD79、およびHLA-DRに対して陰性である。黒のヒストグラムは抗体アイソタイプコントロールを表し、赤のヒストグラムは抗体シグナルを表します。略語:UC-MSCs =臍帯由来間葉系間質/幹細胞;HLA-DR = ヒト白血球抗原-DR. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:フローサイトメトリー分析による選別後のBAMBI^高MFGE8^高 MSCの純度。 抗体染色なし(左上)とMFGE8およびBAMBI染色前(中央上)およびセルソーティング後(右上)のUC-MSCのフローサイトメトリー解析結果を示します。また、MFGE8(左下)とBAMBI(右下)の単一染色の結果も示しています。略語:BAMBI =骨形態形成タンパク質およびアクチビン膜結合阻害剤;MFGE8 = 乳脂肪球表皮成長因子 8;MSCs = 間葉系間質/幹細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:BAMBI^の高MFGE8^高 MSCの異なる周波数を異なる方法で解離させた結果。 トリプシン-EDTA解離(左)、EDTA処理のみ(中)、トリプシンフリー細胞解離試薬(右)を受けた同じドナー由来のUC-MSCのフローサイトメトリー解析結果を示しています。略語:BAMBI =骨形態形成タンパク質およびアクチビン膜結合阻害剤;MFGE8 = 乳脂肪球表皮成長因子 8;MSCs = 間葉系間質/幹細胞;TE = トリプシン-EDTA。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:さまざまなドナーからのBAMBI^高MFGE8^高 MSCの頻度。 BAMBI^高MFGE8^高 MSCの頻度は、ドナーサンプル1(左)、2(中央)、および3(右)によって異なります。略語:BAMBI =骨形態形成タンパク質およびアクチビン膜結合阻害剤;MFGE8 = 乳脂肪球表皮成長因子 8;MSCs = 間葉系間質/幹細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:RT-qPCRで調べたBAMBI^高MFGE8^高 MSCで高発現したシグネチャー遺伝子。 略語:BAMBI =骨形態形成タンパク質およびアクチビン膜結合阻害剤;MFGE8 = 乳脂肪球表皮成長因子 8;MSCs = 間葉系間質/幹細胞;RT-qPCR = 逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応。スチューデントの t検定。*、 P<0.05。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:このプロトコルで使用したDNAプライマーの配列。

このプロトコルは、ヒトUC-MSCからBAMBI^高MFGE8^高 亜集団を単離し、濃縮する方法を説明しています。この方法は、このMSCサブグループの形態、成長、および機能をさらに研究するために重要です。BAMBI^高MFGE8^高 細胞の単離を成功させ、高収率にするためには、いくつかのステップが不可欠です。

まず、考慮すべき最も重要な技術的側面は、現在のプロトコルにおける適切な細胞解離溶液の使用です。従来の0.25%トリプシン-EDTAは継代のためにMSCを解離するために使用されますが、トリプシン処理はBAMBI^高MFGE8^高MSCを選別するときに収量を低下させるため、BAMBI^高MFGE8^高サブグループの選別には酵素を含まないEDTA溶液を利用する方が適切です(図3)。考えられる理由は、トリプシンが他のタンパク質の場合と同様に、細胞表面上のMFGE8およびBAMBI膜貫通タンパク質の分布を損なうことであり得る¹²。対照的に、EDTA溶液の使用は、MFGE8およびBAMBIの細胞表面発現にほとんど影響を与えません。次に、セルソーティングプロトコルは、BAMBI^高MFGE8^高MSCの選択のためのパラメータ設定を記述します。FACSソーティングのための正確なBAMBI^高MFGE8^高MSCsを正確にゲーティングするためには、ブランクサンプルと単一抗体標識サンプルを確立する必要があります。

トリプシン化とは異なり、このプロトコルでBAMBI^高MFGE8^高MSCを選別するには、EDTAによるヒトUC-MSCの分離が推奨されます。ただし、DispaseやTryple E^13,14などの軽度の細胞解離法を含む他の修飾も、BAMBI^高MFGE8^高MSCの回収に適用できる可能性がありますが、検証する必要があります。特に、UC-MSCの長期的な解離は、過度の解離が細胞生存率を低下させる傾向があるため、避けるべきです。さらに、細胞アポトーシス¹⁵を防止するROCK阻害剤(例えば、10μMのY−27632)を細胞培養培地に添加して、選別されたBAMBI高MFGE8高MSCのアポトーシス度を低下させることにより、選別されたBAMBI^高MFGE8^高MSCの生存率を増加させることができる。さらに、特にさらなる機能アッセイ試験を実施する前に、BAMBI^高MFGE8^高MSCの定期的な増殖における純度を再評価することが推奨されます。

BAMBI^の高MFGE8^高MSC比と性別との間に相関関係はなかったが、BAMBI^の高MFGE8^高 UC-MSCの比率は異なるドナーから取得された(図4)。特に、BAMBI^の高MFGE8^の高 亜集団の割合は、継代や培養条件によって異なる可能性があります。UC-MSC集団におけるBAMBI^高MFGE8^高 細胞の割合が非常に小さい場合、現在のプロトコルは十分に適用できません。このプロトコルの他の制限には、FACSソーティング法によって引き起こされる比較的深刻な細胞損傷が含まれ、これにより、細胞ソーティング後にBAMBI^高MFGE8^高 MSCの一部が容易に細胞死につながります。さらに、現在の一次抗体と二次抗体の2段階のソーティング法は、細胞ソーティングに時間がかかり、効率が悪くなります。蛍光と直接結合したBAMBIおよびMFGE8抗体の将来のアプリケーションは、BAMBI^高MFGE8^高MSC のソーティング効率を高めるために好ましいです。

混合MSCの各亜集団の単離は、疾患の治療におけるそれらの真の機能と根本的なメカニズムを明らかにするために不可欠です。したがって、本方法は、BAMBI^高MFGE8^高 UC-MSCをプールし、さらに調査してその性質を完全に理解するための基本的かつ重要なツールを提供します。BAMBI^の高MFGE8^高 細胞培養条件の将来の最適化により、臨床の特定の患者に対する幹細胞治療のために、業界でこれらの細胞が大量に生産されるでしょう。

著者は、利益相反がないことを宣言します。

この研究は、中国国家自然科学基金会(助成金第82271843号)の支援を受けました。