Isolement de cellules stromales mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical BAMBI^humain

L’isolement^{des CSM} BAMBI^{à haute}MFGE8, l’un des trois principaux sous-groupes constituant les CSM-UC humaines hétérogènes, est utile pour bien comprendre les caractéristiques et les fonctions de ce sous-type en vue de son application future pour améliorer l’efficacité clinique dans des maladies spécifiques. Nous présentons ici une méthode de tri des UC-MSC^{BAMBI high}MFGE8.

Les cellules stromales/souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical (UC-MSCs) présentent une faible immunogénicité et de puissants effets immunomodulateurs pour le traitement de diverses maladies. Les CSM-UC humaines sont une population hétérogène composée de trois sous-populations principales avec des formes cellulaires, des taux de prolifération, des capacités de différenciation et des fonctions de régulation immunitaire différents. Auparavant, les UC-MSC^{BAMBI high}MFGE8 high, le premier sous-groupe isolé avec succès des UC-MSC, n’ont pas réussi à soulager la néphrite lupique. Par conséquent, la fonction et le mécanisme sous-jacent de ce sous-groupe dans le traitement des CSM pour les maladies restent inconnus. Il est nécessaire d’isoler et d’étudier plus en détail les CSM-UC^élevées de BAMBI^entermes de phénotype, de métabolisme et de fonction pour comprendre complètement la nature de ce sous-groupe de CSM. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode détaillée pour isoler la sous-population^{BAMBI high}MFGE8 high des UC-MSC humaines. La sous-population de CSM-UC est marquée avec deux marqueurs de surface, BAMBI et MFGE8, par tri par cytométrie en flux. Les cellules isolées sont cultivées et vérifiées par analyse par cytométrie en flux. Les gènes spécifiques exprimés dans les^CSM-UC élevées de BAMBI^àMFGE8 élevés sont identifiés par RT-qPCR. Ce protocole permet un tri cellulaire très efficace et pur et décrit les profils de marqueurs des UC-MSC^{BAMBI high}MFGE8^high.

Les cellules stromales/souches mésenchymateuses humaines (CSM) sont des progéniteurs somatiques capables de se différencier en ostéocytes, adipocytes, chondrocytes et autres types de cellules¹. Les CSM ont d’abord été isolées dans la moelle osseuse et sont largement dérivées du cordon ombilical, du tissu adipeux et d’autres tissus². Parce que les UC-MSC sont faciles à obtenir et présentent une faible immunogénicité et des effets immunosuppresseurs, elles sont largement appliquées dans les essais cliniques pour traiter diverses maladies ^3,4,5. Bien que la thérapie MSC montre un potentiel prometteur pour le traitement des maladies, les effets thérapeutiques sont incohérents entre les individus⁶. Cependant, la raison de l’instabilité du traitement par CSM n’est pas encore claire.

Les fluctuations moléculaires, la morphologie, la capacité de différenciation et la fonction thérapeutique constituent l’hétérogénéité des CSM. Certaines études ont également postulé que les CSM constituent des sous-populations ayant des fonctions différentes ^7,8 et ont exploré l’hétérogénéité des CSM via le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq)^9,10. Les résultats ont révélé que les CSM-UC humaines ont des sous-populations distinctes avec des caractéristiques transcriptomiques spécifiques, alors que peu d’études ont réussi à isoler ce que l’on appelle les sous-populations de CSM. Nous avons précédemment disséqué les UC-MSC humaines en trois sous-groupes en fonction de leurs signatures via le scRNA-seq et l’analyse bioinformatique, dans laquelle la sous-population BAMBI^highMFGE8^high UC-MSC a été purifiée et testée fonctionnellement¹¹. Cependant, ce sous-groupe n’a pas réussi à atténuer la néphrite lupique. Ainsi, il est nécessaire de tester les effets thérapeutiques de BAMBI^highMFGE8^{high MSCs} dans d’autres troubles pour comprendre leurs fonctions authentiques.

Ce protocole décrit les méthodes d’isolement^{du sous-groupe} BAMBI^HighMFGE8 high à partir des UC-MSC humaines par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) par cytométrie en flux et les caractéristiques du sous-groupe BAMBI^highMFGE8^high.

Cette étude a été menée conformément aux principes énoncés dans la Déclaration d’Helsinki de 1989 et approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital affilié Drum Tower de la faculté de médecine de l’Université de Nanjing (numéro d’approbation : 202019701). Des cordons ombilicaux humains ont été obtenus de mères en bonne santé à l’hôpital Affiliate Drum Tower de la faculté de médecine de l’Université de Nanjing après un travail naturel, qui ont donné leur consentement éclairé pour leur utilisation dans ce travail. Des CSM-UC primaires ont été isolées dans les cordons ombilicaux humains, comme indiqué précédemment¹¹.

1. Culture et identification de l’UC-MSC avant l’isolement

1. Une fois que les CSM atteignent 70-80 % de confluence (P0), lavez les cellules une fois avec du PBS et ajoutez 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % pendant 2 min à 37 °C. Ensuite, ajoutez 9 ml de milieu complet pour neutraliser la trypsine, transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml et centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes pour recueillir les cellules. Jetez le surnageant et ajoutez le milieu complet approprié pour remettre les cellules en suspension. Transvaser les cellules de chaque boîte dans trois flacons T75 (P1) et les faire cultiver dans un incubateur cellulaire à 37 °C et 5 % de CO₂.
2. Après avoir passé les UC-MSCs 2x par trypsinisation, à P3, récoltez les cellules en suivant les mêmes étapes que celles décrites à l’étape 1.1. Après la centrifugation, jeter le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans le tampon de coloration FACS (1x PBS contenant 2 % de FBS) et comptez-les. Ajouter le tampon de coloration FACS à une concentration finale de 5-10 ×^10-6 cellules/mL et maintenir la suspension cellulaire sur de la glace.
3. Répartissez 100 μL par tube de cette suspension cellulaire dans différents tubes de 1,5 mL. Ajoutez des contrôles d’isotypes et des anticorps FACS contre CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 et HLA-DR (tous à 1:200) dans les cellules à 4 °C pendant 30 min.
4. Lavez les cellules 2 fois avec le tampon de coloration FACS et centrifugez-les à 300 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre les précipités en suspension dans 200 μL de tampon de coloration FACS pour une analyse par cytométrie en flux afin d’identifier les marqueurs MSC.

2. Isolement des CSM-UC^{BAMBI à haute} MFGE8^élevée par cytométrie en flux

1. Cultivez des UC-MSC à une densité d’environ 5-10 × 10⁶ cellules en isolant^des UC-MSC^{BAMBI à haute}MFGE8. Dissociez les cellules avec 0,5 mM d’EDTA pendant 5 min jusqu’à ce qu’elles commencent à avoir une morphologie ronde, ajoutez le milieu complet pour transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL, et pipetez la suspension cellulaire de haut en bas plusieurs fois pour préparer une suspension unicellulaire. Utilisez 10 μL de suspension cellulaire pour compter les cellules et calculer le nombre total de cellules récoltées. Centrifuger le tube conique avec la suspension cellulaire à 300 × g pendant 5 min pour collecter les cellules.
2. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu complet jusqu’à une concentration finale de 5 à 10 × 10 à⁶ cellules/mL et maintenir la suspension cellulaire sur de la glace.
3. Divisez les cellules dans quatre tubes de microcentrifugation de 1,5 mL (cellules vides seulement ; cellules marquées BAMBI ; cellules marquées MFGE8 ; et les cellules marquées BAMBI et MFGE8).
4. Ajouter des anticorps primaires à des concentrations appropriées (MFGE8 et BAMBI, tous deux à 1:100) dans les tubes, mélanger et incuber les cellules à température ambiante pendant 15 min.
5. Lavez une fois les cellules marquées avec 1x PBS et centrifugez à 300×g pendant 5 min. Jetez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de milieu complet, ajoutez des anticorps secondaires fluorescents conjugués (IgG H&L de chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488 et Alexa Fluor 647, tous à 1:1 000) aux cellules, mélangez et incubez les cellules à température ambiante pendant 15 min dans l’obscurité.
6. Lavez une fois les cellules marquées avec 1x PBS, comme décrit à l’étape 2.5. Remettre les cellules en suspension dans 500 μL de milieu complet, filtrer à travers une crépine cellulaire de 70 μm pour éliminer les amas et les débris, et transférer le filtrat dans un tube de 15 mL pour le tri par cytométrie en flux.
7. Faites fonctionner le tube de cellules vierges sans ajouter d’anticorps (contrôle négatif) et ajustez la diffusion vers l’avant (FSC) et la diffusion latérale (SSC) pour bloquer l’échelle de la population négative avec la coloration des anticorps.
8. Exécutez les tubes cellulaires marqués d’un seul anticorps (c’est-à-dire MFGE8 + IgG H&L anti-lapin Alexa Fluor 488, ou BAMBI + IgG H&L Alexa Fluor 647 anti-lapin pour chèvre) comme contrôle de contrôle pour déterminer où commence la positivité dans la parcelle.
9. Exécutez le(s) tube(s) d’échantillon expérimental pour trier et collecter la^{population cellulaire BAMBI high}MFGE8.
10. Plaquez les CSM triées BAMBI^highMFGE8^high dans une plaque à 24 puits et cultivez les cellules dans un incubateur cellulaire à 37 °C et 5 % de CO₂.
11. Lorsque^{les CSM} triées BAMBI^{à haute}MFGE8 se sont développées sur deux passages pour obtenir suffisamment de cellules, dissociez les cellules et effectuez une analyse post-tri pour garantir la pureté des populations cellulaires triées par cytométrie en flux, comme décrit aux étapes 2.1 à 2.9. Vous pouvez également examiner la pureté des cellules triées par immunofluorescence conventionnelle par rapport à l’expression humaine de BAMBI et MFGE8 si le nombre de cellules collectées est trop faible.

3. Caractérisation des CSM^hautes MFGE8^de BAMBI

1. Cultivez^{les CSM} BAMBI^{à haute}MFGE8 triées dans une plaque à 12 puits, examinez leur morphologie cellulaire au microscope et comparez-les à celle des CSM non triées.
   REMARQUE : En général,^{les cellules} BAMBI^{à haute}MFGE8 se développent plus rapidement que les UC-MSC non triées.
2. Lorsque les cellules sont confluentes à environ 90 % dans la plaque à 12 puits, aspirez le milieu de culture cellulaire, lavez les cellules une fois avec 1x PBS et ajoutez 500 μL de réactif d’extraction d’ARN aux cellules. Agitez lentement la plaque à température ambiante (RT) pendant 5 min.
3. Pipetez le mélange et transférez-le dans un tube sans RNase ni DNase. Ajouter 100 μL de chloroforme, boucher le tube et agiter vigoureusement le mélange en tourbillonnant pendant 15 s. Ensuite, laissez le tube reposer à RT pendant 3 min.
4. Centrifugez le tube pendant 15 min à 11 000 × g et 4 °C.
5. Transférez environ 200 μL de la couche aqueuse supérieure dans un nouveau tube. Ajoutez le même volume d’isopropanol et pipetez soigneusement de haut en bas plusieurs fois. Ensuite, laissez le mélange reposer à RT pendant 10 min.
6. Centrifugeuse pendant 15 min à 11 000 × g et 4 °C. Jetez le surnageant.
7. Ajoutez 500 μL d’éthanol à 75 % dans le tube et retournez doucement le tube plusieurs fois.
8. Centrifugez le tube pendant 5 min à 6 000 × g et 4 °C. Jetez le surnageant. Répétez la centrifugation une fois pendant 10 s à 6 000 × g, aspirez soigneusement le liquide restant à l’aide d’une pipette et séchez le tube à RT.
9. Ajoutez 10 μL d’eau exempte de RNase pour dissoudre la pastille d’ARN et mesurez la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre.
10. Suivez les instructions du fabricant pour synthétiser l’ADNc premier brin à partir d’un maximum de 1 μg d’ARN total.
11. Utilisez un kit qPCR pour détecter et quantifier l’expression des gènes, selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE : Les séquences des amorces d’ADN utilisées sont énumérées dans le tableau 1.

La figure 1 montre les profils d’expression des marqueurs de surface cellulaire des CSM-UC humaines. Les CSM en culture étaient fortement positives pour l’expression de CD44, CD73, CD90 et CD105 et négatives pour l’expression de CD14, CD34, CD45, CD79 et HLA-DR. Les^{CSM BAMBI à haute}MFGE8 ont été triées à partir de CSU-UC humaines cultivées, et leur expression de BAMBI et MFGE8 a été réanalysée par cytométrie en flux après expansion pour 3-4 passages (Figure 2). Dans ce processus, la fréquence des CSM^{BAMBI élevées}en MFGE8 a fluctué en fonction du donneur et de la méthode de dissociation (Figure 3 et Figure 4). La figure 5 montre une série de gènes de signature fortement exprimés dans les CSM^{élevées de BAMBI}à MFGE8 élevées par rapport aux CSM non triées, telles que déterminées par RT-qPCR.

Figure 1 : Immunophénotypage des CSM-UC identifiées par analyse par cytométrie en flux. Les UC-MSC sont positifs pour CD44, CD73, CD90 et CD105 et négatifs pour CD14, CD34, CD45, CD79 et HLA-DR. L’histogramme noir représente le contrôle de l’isotype de l’anticorps, et l’histogramme rouge représente le signal de l’anticorps. Abréviations : UC-MSCs = cellules stromales/souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical ; HLA-DR = antigène leucocytaire humain-DR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Pureté des CSM^{BAMBI à haute}MFGE8 après tri par cytométrie en flux. Les résultats de l’analyse par cytométrie en flux des UC-MSC sans coloration par anticorps (en haut à gauche) et avec coloration MFGE8 et BAMBI avant (en haut au milieu) et après le tri cellulaire (en haut à droite) sont présentés. Les résultats de la coloration simple MFGE8 (en bas à gauche) et BAMBI (en bas à droite) sont également présentés. Abréviations : BAMBI = protéine morphogénique osseuse et inhibiteur membranaire de l’activine ; MFGE8 = globule gras du lait facteur de croissance épidermique 8 ; CSM = cellules stromales/souches mésenchymateuses. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Différentes fréquences des CSM^élevées BAMBI^élevéesMFGE8 dissociées par différentes méthodes. Les résultats de l’analyse par cytométrie en flux des CSM-UC du même donneur soumis à la dissociation trypsine-EDTA (à gauche), au traitement EDTA uniquement (au milieu) et au réactif de dissociation cellulaire sans trypsine (à droite) sont présentés. Abréviations : BAMBI = protéine morphogénique osseuse et inhibiteur membranaire de l’activine ; MFGE8 = globule gras du lait facteur de croissance épidermique 8 ; CSM = cellules stromales/souches mésenchymateuses ; TE = trypsine-EDTA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : La fréquence des CSM^{BAMBI à forte}MFGE8 chez différents donneurs. Les fréquences des CSM^{BAMBI High}MFGE8^High varient entre les échantillons donneurs 1 (à gauche), 2 (au milieu) et 3 (à droite). Abréviations : BAMBI = protéine morphogénique osseuse et inhibiteur membranaire de l’activine ; MFGE8 = globule gras du lait facteur de croissance épidermique 8 ; CSM = cellules stromales/souches mésenchymateuses. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Gènes de signature hautement exprimés dans les CSM^{BAMBI à haute}MFGE8 examinées par RT-qPCR. Abréviations : BAMBI = protéine morphogénique osseuse et inhibiteur membranaire de l’activine ; MFGE8 = globule gras du lait facteur de croissance épidermique 8 ; CSM = cellules stromales/souches mésenchymateuses ; RT-qPCR = réaction en chaîne de la polymérase quantitative par transcription inverse. Test t de l’élève. *, P<0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Séquences des amorces d’ADN utilisées dans ce protocole.

Ce protocole décrit comment isoler et enrichir la sous-population^{BAMBI high}MFGE8 high à partir de UC-MSCs humaines. La méthode est importante pour l’étude plus approfondie de la morphologie, de la croissance et de la fonction de ce sous-groupe MSC. Certaines étapes sont essentielles pour la réussite de l’isolement et le rendement élevé^{des cellules} BAMBI^{à haute}MFGE8.

Tout d’abord, l’aspect technique le plus critique à prendre en compte est l’utilisation d’une solution de dissociation cellulaire appropriée dans le protocole actuel. Bien que la trypsine-EDTA conventionnelle à 0,25 % soit utilisée pour dissocier les CSM pour le passage, il est préférable d’utiliser une solution EDTA sans enzyme pour trier^{le sous-groupe} BAMBI^{à haute}MFGE8, car le traitement à la trypsine réduit le rendement^{des CSM à}haute MFGE8 de BAMBI lorsqu’elles sont triées (Figure 3). Une raison possible peut être que la trypsine altère la distribution des protéines transmembranaires MFGE8 et BAMBI à la surface de la cellule comme elle le fait pour d’autres protéines¹². En revanche, l’utilisation de la solution EDTA a peu d’effet sur l’expression cellulaire de MFGE8 et BAMBI. Deuxièmement, le protocole de tri cellulaire décrit les paramètres de sélection^{des CSM BAMBI High}MFGE8. Il est nécessaire d’établir un échantillon vierge et des échantillons uniques marqués par des anticorps pour contrôler avec précision^{les CSM} BAMBI élevées BAMBI^élevéesMFGE8 élevées pour le tri FACS.

Contrairement à la trypsinisation, le détachement des CSM-UC humaines par EDTA est recommandé pour trier les CSM^{BAMBI à haute}MFGE8 dans ce protocole. Cependant, d’autres modifications impliquant des méthodes de dissociation cellulaire légères, telles que Dispase et Tryple E^13,14, peuvent également être applicables à la récolte de CSM^{BAMBI à haute}MFGE8, mais doivent être vérifiées. En particulier, la dissociation à long terme des UC-MSC doit être évitée, car une dissociation excessive tend à réduire la viabilité cellulaire. De plus, des inhibiteurs de ROCK (par exemple, Y-27632 à 10 μM), qui empêchent l’apoptose cellulaire¹⁵, peuvent être ajoutés au milieu de culture cellulaire pour augmenter la survie^{des CSM} triées BAMBI^{à haute}MFGE8 en réduisant leur degré d’apoptose. De plus, il est recommandé de réévaluer la pureté^{des CSM BAMBI à haute}MFGE8 en expansion régulière après le tri pour s’assurer qu’elles conservent leurs identités primaires, en particulier avant que d’autres tests de dosage fonctionnel ne soient effectués.

Bien qu’il n’y ait pas de corrélation entre le rapport BAMBI ^élevéMFGE8 et le sexe, les rapports BAMBI^élevéMFGE8 élevé UC-MSC ont été acquis auprès de différents donneurs (Figure 4). Notamment, la proportion de^{la sous-population} BAMBI^élevéeMFGE8 élevée peut varier en fonction de différents passages ou conditions de culture. Si la proportion de cellules BAMBI^{à haut}taux de MFGE8 dans la population UC-MSC est extrêmement faible, le protocole actuel ne sera pas bien applicable. D’autres limitations de ce protocole incluent des dommages cellulaires relativement graves causés par la méthode de tri FACS, qui conduisent facilement à la mort cellulaire d’une proportion^{de CSM BAMBI élevées}en MFGE8 après le tri cellulaire. De plus, les méthodes actuelles de tri des anticorps primaires et secondaires en deux étapes prennent plus de temps et sont moins efficaces pour le tri cellulaire. Les applications futures des anticorps BAMBI et MFGE8 directement conjugués à la fluorescence sont préférables pour augmenter l’efficacité de tri^{des CSM BAMBI à haute}MFGE8.

L’isolement de chaque sous-population de CSM mixtes est indispensable pour révéler leurs fonctions authentiques et leurs mécanismes sous-jacents dans le traitement des maladies. Par conséquent, la présente méthode fournit un outil fondamental et vital pour la mise en commun et l’étude plus approfondie^{des CS-UC} élevées de BAMBI^{à MFGE8}élevées afin de comprendre complètement leur nature. L’optimisation future des conditions de culture cellulaire^élevée de BAMBI^HighMFGE8 produira un grand nombre de ces cellules dans l’industrie pour la thérapie par cellules souches pour des patients spécifiques en clinique.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 82271843).