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Aqui, descrevemos um bioensaio usando brometo de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) para testar oximas espirocíclicos previamente sintetizados.
Heterociclos espirocíclicos têm sido recentemente relatados na literatura como potenciais drogas para a terapia do câncer. A síntese desses novos sistemas de anéis ortogonais é um desafio. Uma metodologia eficiente para sintetizar esses compostos foi publicada recentemente que descreveu a síntese em fase sólida em quatro etapas, em vez das cinco etapas relatadas anteriormente. A vantagem desta síntese mais curta é a eliminação do uso de reagentes tóxicos. A resina à base de ligador Regenerating Michael (REM) de baixa carga foi considerada crucial na síntese, pois as versões de alta carga impediram a adição de reagentes contendo fenil volumoso e cadeias laterais aromáticas. O ensaio colorimétrico de brometo de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi utilizado para examinar a citotoxicidade das concentrações micromolares destas novas moléculas espirocíclicas in vitro. O MTT está prontamente disponível comercialmente e produz resultados relativamente rápidos e confiáveis, tornando este ensaio ideal para esses heterociclos espirocíclicos. Estruturas de anéis ortogonais, bem como furfurilamina (um precursor no método de síntese contendo um motivo de anel semelhante de 5 membros) foram testados.
Sabe-se que a inibição de moléculas pequenas da interação do camundongo E3 ubiquitina-ligase duplo minuto 2 (MDM2) com p53 restaura a indução mediada pela p53 da apoptose de células tumorais 1,2,3. O MDM2 é um regulador negativo da via p53 e é frequentemente superexpresso em células cancerígenas 4,5,6,7,8,9. Estudos cristalográficos e bioquímicos recentes revelaram que pequenas moléculas contendo uma estrutura espirocíclica podem efetivamente inibir as interações MDM2-p5310. A estrutura espirocíclica (Figura 1, sombreada em azul) é considerada um motivo privilegiado, pois a derivatização desse sistema rígido de anéis ortogonais levou à descoberta de novas drogas terapêuticas. Acessar essa arquitetura interessante representa um desafio ao usar técnicas tradicionais de síntese orgânica. Embora os efeitos terapêuticos de moléculas espirocíclicas em sistemas biológicos tenham sido investigados, a síntese dessas moléculas ainda é um processo complicado. Produtos secundários indesejados, usando condições adversas e metais de transição perigosos são muitas vezes problemáticos.
O potencial uso do motivo espirocíclico no desenvolvimento de fármacos levou ao desenvolvimento de um protocolo utilizando síntese em fase sólida para gerar uma biblioteca de moléculas com o motivo, além de outros grupos funcionais intercambiáveis11,12. A separação de produtos e reagentes entre as etapas pode ser alcançada simplesmente utilizando um ligador REM ligado a um grânulo de resina e um recipiente de filtro de fase sólida. Isso reduziria as etapas e potencialmente aumentaria os rendimentos. Essa abordagem sintética poderia produzir uma grande variedade de potenciais candidatos a medicamentos. No entanto, a eficácia dessas moléculas em um sistema biológico exigiria uma investigação mais aprofundada.
Para determinar a citotoxicidade desses compostos espirocíclicos, foi empregado o ensaio MTT13,14. Este método mede a viabilidade celular e pode ser usado para determinar indiretamente a citotoxicidade celular. Diferentes concentrações dos inibidores foram adicionadas às células cultivadas em uma placa de 96 poços, e a proporção de células vivas foi medida pela análise colorimétrica da extensão da redução do MTT amarelo pelas desidrogenases mitocondriais ao composto formazano roxo (Figura 2). A atividade é mais frequentemente relatada como um valor de CI 50 - a concentração na qual o crescimento celular é inibido em50% em relação a um controle não tratado. Este trabalho descreve o protocolo para o ensaio de MTT e os resultados preliminares dessas novas moléculas espirocíclicas.
NOTA: Vários produtos químicos e reagentes biológicos utilizados neste protocolo são tóxicos e cancerígenos. Consulte as fichas de dados de segurança do material (FISPQ) relevantes antes de utilizar. Use equipamentos de proteção individual apropriados (óculos de segurança aprovados pela Administração de Segurança e Saúde Ocupacional, luvas adequadas, jalecos, calças de corpo inteiro e sapatos fechados) antes de iniciar o experimento. Além disso, adote práticas de segurança apropriadas ao realizar a síntese e manusear produtos químicos e reagentes tóxicos (exaustor).
1. Síntese em fase sólida dos heterociclos espirocíclicos 6 e 7
NOTA: A síntese foi baseada em trabalhos publicados anteriormente11,12. O protocolo atualizado revela que a abertura do anel catalisado por fluoreto de tetrabutilamônio do heterociclo tricíclico não foi necessária e, portanto, sua eliminação encurta o procedimento sintético.
2. Ensaio de citotoxicidade utilizando MTT 14
Os oximas espirocíclicos 6 e 7 foram sintetizados por meio de um protocolo modificado (Figura 1). A adição de furfurilamina a um ligador REM 1b proporcionou resina 2 ligada ao polímero. O progresso da reação foi monitorado por espectroscopia de infravermelho (IR), detectando-se o desaparecimento do éster α,β-insaturado a 1722 cm-1 (Figura 3). A resina espirocíclica 4 foi formada a partir de 2 através de um intermediário transitório 3. A hidrólise metanólica de 4 produziu éster metílico do ácido 3-[(3E)-(2S, 4R)-2-fenil-3-hidroxiimino 4-hidroximetil-pirrolidina-1-il]-ácido propiónico 7, enquanto a alquilação seguida de eliminação β proporcionada (3E)-(2S, 4R)-4-hidroximetil-1-metil-2-fenil-3-pirrolidina oxima 6. A identidade dos oximas espirocíclicos foi determinada por análise espectroscópica de ressonância magnética nuclear de 1H e 13C e a pureza por espectroscopia de massa com base em nossos resultados anteriores11.
O ensaio MTT é um ensaio colorimétrico bem conhecido para determinar a viabilidade celular12. Como visto na Figura 2, as redutases mitocondriais presentes nas células vivas convertem o tetrazólio amarelo do MTT em um sólido formazan roxo insolúvel. Usando um espectrofotômetro, a formação de formazan é quantificada medindo a absorbância a 600 nm. A cisplatina, que é conhecida por induzir a morte celular em altas concentrações, foi utilizada como controle positivo (Figura 4). Como esperado, quanto maior a concentração de cisplatina, menor a viabilidade celular. Em seguida, o ensaio de MTT foi utilizado para testar os compostos espirocíclicos 6 e 7 e furfurilamina. A furfurilamina foi usada para determinar o efeito do anel de furano sozinho em comparação com a estrutura espirocíclica. Conforme ilustrado na Figura 5, a furfurilamina e a oxima espirocíclica 6 apresentaram citotoxicidade semelhante. No entanto, a toxicidade do composto espirocíclico 7 foi visivelmente maior do que a da furfurilamina e 6. Uma biblioteca de oximas espirocíclicos será sintetizada para investigar completamente a citotoxicidade, bem como os outros efeitos anticancerígenos desses heterociclos.
Figura 1: Construção de compostos espirocíclicos utilizando uma síntese de fase sólida atualizada. A estrutura espirocícica ortogonal é sombreada em azul. Observe que a etapa (c) não é necessária, o que evita o uso do reagente tóxico TBAF. As condições de reação são as seguintes: (a) furfurilamina, DMF, (b) β-nitroestireno, TMSCl, TEA, tolueno, (c) TBAF, (d) haleto de alquila, DMF e (e) TEA, DCM. Abreviaturas: TBAF = fluoreto de tetrabutilamónio; DMF = dimetilformamida; TMSCl = cloreto de trimetilsililo; TEA = trietilamina; DCM = diclorometano; ISOC = cicloadição intramolecular de silioxi olefina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Mecanismo do ensaio MTT. O sal de tetrazólio visivelmente amarelo do MTT é reduzido por redutases mitocondriais em células COS-7 vivas para formar formazan insolúvel roxo. Abreviatura: MTT = brometo de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5- difeniltetrazólio. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Monitorando o progresso de cada etapa de reação em fase sólida por espectroscopia de infravermelho. A frequência de alongamento a 1717 cm-1 indicou a presença de um éster insaturado, 1733 cm-1 representou um éster saturado e o sinal em torno de 3300-3500 cm-1 indicou a presença de um grupo hidroxila. Frequências de alongamento detectáveis para poliestireno também são mostradas. Abreviaturas: REM = Regenerando Michael; ISOC = cicloadição intramolecular de silioxi olefina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeitos da cisplatina na viabilidade celular COS-7 em um ensaio de MTT modificado. As concentrações de cisplatina variaram de 0 μM a 60 μM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Efeitos dos compostos de ensaio na viabilidade celular do COS-7 num ensaio MTT modificado. As concentrações variaram de 0 μM a 100 μM e foram plotadas em escala logarítmica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Layout da placa de 96 poços. Todas as linhas de dados do teste estavam em triplicado. Poços contendo apenas células COS-7 e meio foram utilizados como controles. Para garantir que o DMSO não fosse a causa de citotoxicidade nas células dosadas com cisplatina, poços contendo apenas DMSO foram usados como controles de solventes. Poços contendo células COS-7 são destacados. Abreviaturas: DMSO = dimetilsulfóxido; PBS = solução salina tamponada com fosfato. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A síntese dos compostos espirocíclicos foi baseada em pesquisas anteriores realizadas por este laboratório, porém com algumas modificações (Figura 1)11,12. O progresso de cada etapa de reação foi monitorado por espectroscopia de RI. Michael adição do ligador REM 1 com furfurilamina proporcionada polímero ligado 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). A partir do relatório anterior, o ISOC de 2 produziu o composto heterocíclico tricíclico 3, como confirmado pela detecção do grupo TMS (IR 1214 cm-1). Esta é uma etapa crítica da síntese, pois a ISOC forneceu a regio- e a estereosseletividade necessárias dos produtos. Uma frequência de alongamento do grupo hidroxila de 3500 cm-1 foi observada em vez da frequência do grupo funcional TMS. Isso pode ser porque o composto tricíclico é um intermediário transitório que leva ao sistema espirocíclico.
Diferentes tipos de resina REM foram encontrados para limitar a síntese. O polímero de alta carga (1,00 mmol/g) impediu a síntese de compostos espirocíclicos contendo cadeias laterais volumosas de R2. Devido às semelhanças nos grupos funcionais nas resinas 4 e 5, os resultados da RI foram inconclusivos. O sucesso desta etapa só poderia ser determinado pela tentativa de regenerar o vinculador REM (5 → 1). A regeneração não ocorreu nos casos em que um grupo R2 volumoso foi adicionado. Resinas de baixa carga (0,5 mmol / g ou menos) são recomendadas para uma síntese bem-sucedida. Esse método de síntese é consistente com os procedimentos descritos na literatura.
Como teste preliminar, um protocolo foi desenvolvido para um ensaio de citotoxicidade usando MTT. Ao longo de vários ensaios, etapas críticas e limitações foram descobertas. Para que os resultados fossem normalizados em todos os poços, as células tinham que ser semeadas uniformemente através dos poços, necessitando da medição da concentração celular antes da semeadura. O ensaio exigia placas com poços de fundo plano, pois a absorvância não podia ser lida com precisão a partir de poços de fundo redondo. Além disso, o excesso de MTT que permaneceu após a incubação teve que ser removido para evitar interferência nas leituras sem perturbar o formazan insolúvel.
A absorvância do formazan dissolvido deve ser lida a 590 nm. No entanto, a instrumentação atual no laboratório exigiu leituras a 600 nm. O armazenamento a 0 °C mostrou-se importante para os produtos químicos utilizados no ensaio (cisplatina, moléculas espirocíclicas, furfurilamina). DMSO - um produto químico com citotoxicidade conhecida - foi usado como solvente para os compostos de teste e foi usado para fazer diluições para o ensaio. O reagente MTT em si teve que ser preparado, pois foi armazenado como um pó que precisava ser dissolvido e filtrado, pois as partículas insolúveis interferiam nas leituras.
No geral, os resultados para este ensaio destinam-se a ser preliminares, uma vez que apenas um pequeno número de moléculas foi testado. Um teste exaustivo com uma bateria de moléculas está planejado, e um manuscrito completo será divulgado. Além disso, a síntese pode ser aplicável para aminas derivadas de pirrol-2-carbaldeído. Neste caso, as pirrolidinas espirocíclicas podem ser sintetizadas e testadas quanto a efeitos citotóxicos em linhagens celulares de câncer.
Os autores não têm nada a revelar.
Este trabalho foi financiado por uma bolsa do Conselho de Pesquisa da Faculdade para K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. e J.F.M. são destinatários da Bolsa de Experiência de Pesquisa de Graduação Acadêmica (SURE). S.K.M. e B.M.R. são beneficiários das Bolsas de Pesquisa STEM (Centro de Pesquisa em Ciência, Azusa Pacific University-EUA). Somos gratos ao Dr. Matthew Berezuk e ao Dr. Philip Cox pela orientação sobre os bioensaios.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CELLS | |||
COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
CHEMICALS | |||
1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas |
GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
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