功能化螺环杂环合成和细胞毒性测定

在这里，我们描述了使用3-（4′，5′-二甲基噻唑-2′-基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）的生物测定，以测试先前合成的螺环肟。

最近文献报道了螺环杂环是癌症治疗的潜在药物。这些新型正交环系统的合成具有挑战性。最近发表了一种合成这些化合物的有效方法，该方法描述了四步的固相合成，而不是先前报道的五个步骤。这种较短合成的优点是消除了有毒试剂的使用。发现低负载再生迈克尔（REM）接头基树脂在合成中至关重要，因为高负载版本阻止了添加含有大块苯基和芳香族侧链的试剂。比色3-（4′，5′-二甲基噻唑-2′-基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）测定用于体外检查这些新型螺旋环分子微摩尔浓度的细胞毒性。MTT很容易在商业上获得，并产生相对快速，可靠的结果，使该测定成为这些螺环杂环的理想选择。测试了正交环结构以及糠胺（合成方法中的前体，包含类似的5元环基序）。

已知小分子抑制E3泛素连接酶小鼠双分钟2同系物（MDM2）与p53的相互作用可恢复p53介导的诱导肿瘤细胞凋亡1，^2，3。MDM2是p53通路的负调节因子，通常在癌细胞⁴，⁵，⁶，^7，8^，9中过表达。最近的晶体学和生化研究表明，含有螺旋环骨架的小分子可以有效抑制MDM2-p53相互作用¹⁰。螺旋环框架（图1，蓝色阴影）被认为是一个特权基序，因为这种刚性正交环系统的衍生化导致了新型治疗药物的发现。使用传统的有机合成技术时，访问这种有趣的架构提出了挑战。尽管已经研究了螺旋环分子在生物系统中的治疗效果，但这些分子的合成仍然是一个繁琐的过程。不需要的副产品、使用恶劣的条件和危险的过渡金属通常是有问题的。

螺旋环基序在药物开发中的潜在用途导致开发一种方案，利用固相合成来生成具有该基序的分子库以及其他可互换的官能团^11，12。步骤之间产物和反应物的分离可以通过简单地使用连接到树脂珠和固相过滤容器的REM接头来实现。这将减少步骤并可能提高产量。这种合成方法可以产生大量潜在的候选药物。然而，这些分子在生物系统中的有效性需要进一步研究。

为了确定这些螺环化合物的细胞毒性，采用了MTT测定^13，14 。该方法测量细胞活力，可用于间接确定细胞毒性。将不同浓度的抑制剂添加到96孔板中的培养细胞中，并通过比色分析测量线粒体脱氢酶将黄色MTT还原为紫色甲臜化合物的程度的活细胞比例（图2）。该活性通常报告为IC₅₀ 值 - 相对于未处理的对照，细胞生长抑制50%的浓度。本文描述了MTT测定的方案以及这些新型螺环分子的初步结果。

注意:本协议中使用的几种化学品和生物试剂具有毒性和致癌性。使用前，请查阅相关材料安全数据表 （MSDS）。在开始实验之前，使用适当的个人防护装备（职业安全与健康管理局批准的护目镜，适当的手套，实验室外套，全长裤和露趾鞋）。此外，在进行合成和处理有毒化学品和试剂（通风橱）时，应采取适当的安全措施。

1. 螺环杂环6和7的固相合成

注:综合基于先前发表的工作^11，12。更新后的协议表明，不需要四丁基氟化铵催化的三环杂环开环，因此其消除缩短了合成过程。

1. 向REM接头中加入糠胺（持续时间:25分钟设置+ 24小时反应时间）。
   1. 向 25 mL 固相反应容器中加入 1 g（1 当量 [当量]）REM 树脂、20 mL（20 当量）二甲基甲酰胺 （DMF） 和 2.4 mL 糠胺。反应引发后在室温下搅拌反应容器24小时。
      注意:确保充分混合，使树脂不会位于容器底部。
   2. 反应完成后用DMF 1x洗涤树脂。然后，洗涤4倍，在二氯甲烷（DCM）和甲醇之间交替。洗涤后在反应容器中彻底干燥树脂。
2. 进行串联迈克尔加成/1，3-偶极环加成（持续时间:25分钟设置+ 48小时反应时间）。
   1. 向干燥树脂中加入 1.48 mL（5 当量）三乙胺 （TEA）、0.637 g（2 当量）硝基烯烃和 10 mL 干甲苯。
   2. 然后，将 1.085 mL（4 当量）三甲基氯硅烷 （TMSCl） 加入通风良好的通风橱中的反应容器中。
      注意: 由于该反应会产生HCl气体，因此在气体释放到通风橱下之前，请勿盖上反应容器的盖子。
   3. 盖紧反应容器，并在室温下搅拌48小时。
      注意:确保树脂与试剂彻底混合。
   4. 使用 5 mL 甲醇淬灭反应。
   5. 排干容器以除去溶液，然后在DCM和甲醇之间交替洗涤4次。洗涤后在反应容器中彻底干燥树脂。
3. 对树脂结合的杂环进行 N-烷基化以形成季胺（持续时间:10分钟设置+ 24小时反应时间）。
   1. 向反应容器中的干燥树脂中，加入5mL DMF和10等量的烷基卤化物，并在室温下搅拌24小时。
      注意:确保试剂与树脂彻底混合。
   2. 反应完成后用DMF 1x洗涤树脂。然后，交替使用DCM和甲醇洗涤4倍。洗涤后在反应容器中干燥树脂。
4. 对季胺进行β消除，以从聚合物载体上裂解（持续时间:15分钟设置+ 24小时反应时间）。
   1. 向反应容器中的干树脂中，加入 3 mL DCM 和 1.49 mL（5 当量）TEA 以将杂环从聚合物载体上裂解。
   2. 将反应混合物搅拌24小时，以确保树脂与溶液充分混合。洗涤4倍，在DCM和甲醇之间交替。收集所有洗涤液的洗脱液，并通过旋转蒸发浓缩。
   3. 用甲醇氚化以纯化螺环肟。洗涤后在反应容器中彻底干燥树脂，以便在将来的实验中重复使用。

2. 使用 MTT ¹⁴ 进行细胞毒性测定

1. 使用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.9% NaCl 水溶液）作为稀释剂制备 20 mL 的 5 mg/mL MTT 溶液。过滤并储存在-20°C。 然后，在无血清细胞培养基（DMEM）中制备步骤2.1中的MTT溶液的1:1稀释度。
2. 在 1.5 mL 微量离心管中制备 1 mL 的储备溶液，分别在 100 mM、10 mM、10 μM、10 μM、1 μM 和 0.01 μM 的二甲基亚砜 （DMSO） 测试化合物中制备 1 mL 储备溶液。储存在-20°C。 通过在 1.5 mL 管中的无血清培养基中以 1:1000 稀释原液浓度，每剂量制备 200 μL 测试化合物的工作溶液。
3. 在组织培养罩中，使用多通道移液器将COS-7细胞（非洲绿猴肾细胞，尾 尾 蝇肾）在完全培养基[含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM]中接种到平底，组织培养处理的96孔板上，浓度为4×10³ 细胞/ 200μL/200μL。选择COS-7细胞是因为（1）这些是细胞毒性测定的常用细胞，（2）这些细胞已经在机构中可用。
4. 将COS-7细胞在含有5%CO₂的气氛中于37°C孵育24小时。
5. 使用连接到真空泵的玻璃巴斯德移液管从孔中吸出上清液。使用步骤2.2中制备的工作溶液将细胞与测试化合物一式三份加样（见表1）。按照步骤2.4中所述孵育细胞。
6. 从孔中吸出上清液。向每个孔中加入 200 μL MTT 溶液。在含有5%CO₂ 的气氛中于37°C孵育4小时。
7. 轻轻地从孔中吸出上清液，而不会干扰紫色甲臜晶体。向每个孔中加入 200 μL DMSO 以溶解紫色甲臜晶体。在室温下孵育15分钟。
8. 使用96孔板读数器测量每个孔的590nm¹⁴ 或600nm处的吸光度。使用没有细胞的孔作为背景并平均吸光度值。从每个处理孔的吸光度值中减去平均吸光度背景值。将数据标准化为平均零剂量值的百分比（平均三个零剂量值）。在y轴上绘制数据:线性（%相对细胞活力）;x 轴:对数（浓度）。将每个序列绘制为单独的曲线（例如，一式三份数据应有 3 条曲线）

使用改良方案合成螺环肟6和7（图1）。迈克尔将糠胺添加到REM接头1b中得到聚合物结合树脂2。通过红外（IR）光谱通过检测1722cm-1处α，β-不饱和酯的消失来监测反应的进展（图3）。螺环结合树脂4由2通过瞬态中间体3形成。甲醇水解4得到3-[（3E）-（2S，4R）-2-苯基-3-羟基亚氨基4-羟甲基吡咯烷-1-基]-丙酸甲酯7，同时烷基化后β得到（3E）-（2S，4R）-4-羟甲基-1-甲基-2-苯基-3-吡咯烷肟6。通过¹H和¹³C核磁共振波谱分析确定了螺环肟的身份，并根据我们之前的结果通过质谱法确定了纯度¹¹。

MTT测定法是一种众所周知的比色法，用于确定细胞活力¹²。如图2所示，活细胞中存在的线粒体还原酶将MTT的黄色四唑转化为不溶性紫色甲臜固体。使用分光光度计，通过测量600nm处的吸光度来量化甲臜的形成。已知顺铂在高浓度下诱导细胞死亡，被用作阳性对照（图4）。正如预期的那样，顺铂的浓度越高，细胞活力越低。接下来，MTT测定用于测试螺环化合物 6 和 7 以及糠胺。与螺环骨架相比，糠胺用于确定单独呋喃环的影响。如图5所示，糠胺和螺环肟 6 表现出相似的细胞毒性。然而，螺环化合物 7 的毒性明显大于糠胺和 6。将合成螺环肟库，以充分研究这些杂环的细胞毒性以及其他抗癌作用。

图1:使用更新的固相合成构建螺环化合物。 正交螺旋细胞框架以蓝色阴影显示。请注意，不需要步骤（c），这避免了使用有毒试剂TBAF。反应条件如下:（a）糠胺，DMF，（b）β-亚硝基苯乙烯，TMSCl，TEA，甲苯，（c）TBAF，（d）烷基卤化物，DMF，和（e）TEA，DCM。缩写:TBAF = 四丁基氟化铵;DMF = 二甲基甲酰胺;TMSCl = 三甲基氯硅烷;TEA = 三乙胺;DCM = 二氯甲烷;ISOC = 分子内硅氧基烯烃环加成。 请点击此处查看此图的大图。

图2:MTT测定的机制。 MTT的明显黄色四唑盐被活COS-7细胞中的线粒体还原酶还原，形成紫色不溶性甲胺。缩写:MTT = 3-（4′，5′-二甲基噻唑-2′-基）-2，5-二苯基四唑溴化物。 请点击此处查看此图的大图。

图3:通过红外光谱监测每个固相反应步骤的进度。 1717 cm-1处的拉伸频率表示存在不饱和酯，1733 cm-1表示饱和酯，3300-3500 ^cm-1 附近的信号表示存在羟基。还显示了聚苯乙烯的可检测拉伸频率。缩写:REM = 再生迈克尔;ISOC = 分子内硅氧基烯烃环加成。请点击此处查看此图的大图。

图 4:顺铂对改良 MTT 测定中 COS-7 细胞活力的影响。 顺铂的浓度范围为0μM至60μM。 请点击此处查看此图的大图。

图 5:测试化合物对改良 MTT 测定中 COS-7 细胞活力的影响。 浓度范围为0μM至100μM，并以对数刻度绘制。 请点击此处查看此图的大图。

表1:96孔板的布局。 所有测试数据行一式三份。仅含有COS-7细胞和培养基的孔用作对照。为了确保DMSO不是顺铂剂量细胞中细胞毒性的原因，仅含有DMSO的孔用作溶剂对照。突出显示含有COS-7细胞的孔。缩写:DMSO = 二甲基亚砜;PBS = 磷酸盐缓冲盐水。 请点击此处查看此图的大图。

螺环化合物的合成基于该实验室先前进行的研究，但进行了一些修改（图1）^11，12。通过红外光谱监测每个反应步骤的进度。迈克尔将REM接头1与糠胺一起加入得到聚合物结合的2（IR 1722 cm-1 → 1731 ^cm-1）。从上一份报告中，ISOC of 2产生了三环杂环化合物3，TMS组的检测证实了这一点（IR 1214 ^cm-1）。这是合成的关键步骤，因为ISOC为产品提供了必要的区域和立体选择性。观察到羟基拉伸频率为3500 ^cm-1，而不是TMS官能团的频率。这可能是因为三环化合物是导致螺旋环系统的瞬时中间体。

发现不同类型的REM树脂限制了合成。高负载聚合物（1.00 mmol/g）阻止了含有大块R₂侧链的螺环化合物的合成。由于树脂4和5中官能团的相似性，IR的结果尚无定论。此步骤的成功只能通过尝试重新生成 REM 接头来确定 （5 → 1）。在添加笨重的R₂组的情况下不会发生再生。建议使用低负载树脂（0.5 mmol/g或更低）以成功合成。该合成方法与文献中描述的程序一致。

作为初步测试，开发了一种使用MTT进行细胞毒性测定的方案。在几次试验过程中，发现了关键步骤和局限性。为了在所有孔中对结果进行归一化，细胞必须均匀地接种在孔中，因此需要在接种前测量细胞浓度。该测定需要具有平底孔的板，因为无法从圆底孔中准确读取吸光度。此外，必须去除孵育后残留的过量MTT，以防止干扰读数，而不会干扰不溶性甲胺。

溶解的甲臜的吸光度应在590nm处读取。然而，实验室中的当前仪器需要获取600 nm的读数。发现在0°C下储存对于测定中使用的化学物质（顺铂，螺环分子，糠胺）很重要。DMSO（一种具有已知细胞毒性的化学物质）被用作测试化合物的溶剂，并用于稀释测定。MTT试剂本身必须制备，因为它以粉末形式储存，需要溶解和过滤，因为不溶性颗粒会干扰读数。

总体而言，该测定的结果旨在是初步的，因为仅测试了少量分子。计划对一系列分子进行详尽的测试，并将提供完整的手稿。此外，该合成可能适用于衍生自吡咯-2-甲醛的胺。在这种情况下，可以合成螺环吡咯烷并测试对癌细胞系的细胞毒性作用。

作者没有什么可透露的。

这项工作由教师研究委员会向KSH（美国阿苏萨太平洋大学研究和赠款办公室）的赠款资助。A.N.G. 和 J.F.M. 是学术本科生研究经验 （SURE） 奖学金的获得者。S.K.M.和B.M.R.是STEM研究奖学金（美国阿苏萨太平洋大学科学研究中心）的获得者。我们感谢Matthew Berezuk博士和Philip Cox博士对生物测定的指导。