입증된 기술은 저비용 기기를 사용하여 체관부가 풍부한 감귤 조직을 신속하게 처리하므로 노동 집약적인 프로토콜과 특수 실험실 장비가 필요하지 않습니다. 이를 통해 감귤류 바이로이드, 바이러스 및 박테리아의 신속한 다운스트림 검출 및 관리가 가능합니다. 이 방법은 처리량을 늘리고 테스트 서비스의 품질과 균일성을 개선하여 감귤 산업에 도움이 되고 잠재적으로 보육 및 현장 운영에서 질병을 진단하고 치료하는 데 도움이 될 수 있습니다.
감귤류 식물은 병원균에 감염되어, 전 세계적으로 상당한 경제적 손실을 초래한다. Budwood Tissue Extractor 또는 BTE와 같은 고급 병원체 검출 기술은 대규모 나무 생산을 위해 병원균 테스트를 거친 전파 물질을 생산하는 데 필요합니다. 감귤류 샘플로 테스트 및 검증되었지만 이 방법은 다른 많은 작물에 대한 진단 실험실 및 현장 작업에 적용할 수 있습니다.
이 기술을 수행하는 초보자는 프로토콜을 숙지하고 지침을 정확하게 따르고 인내심을 가져야 합니다. 시작하려면 휴대폰 앱 테스트 트래커를 사용하여 트리를 선택하고 근거리 무선 통신(NFC) 칼라 태그를 휴대폰에 대고 트리 정보를 태그에 로드합니다. 3-4 개의 감귤류 버드 우드 샘플을 버드 우드 조직 추출기 (BTE), 호환 가능한 비닐 봉지 캐리어에 넣고 클립으로 닫습니다.
텍스트에 설명된 단계에 따라 샘플의 품질을 확인한 후 전화 앱 Test Tracker를 사용하여 트리의 NFC 칼라 태그를 스캔하고 샘플 백의 NFC 클립 태그와 연결합니다. 적절하게 소독된 흄 후드 내부에서 조직 추출기 베이스 뒷면의 스위치를 뒤집습니다. 상자 왼쪽의 스위치가 상단에서 눌려져 있는지 확인하고 깜박이는 녹색 LED가 챔버가 준비되었음을 나타낼 때까지 기다립니다.
BTE 챔버를 준비하려면 O-링을 사용하여 빈 샘플 백을 후면 노즐에 고정하여 챔버 후면에 부착합니다. 블레이드에 마모 흔적이나 손상의 흔적(예: 블레이드가 플라스틱으로 계속 절단되거나 팁이 절단됨)이 있는지 검사합니다. 블레이드의 화살표가 단일 잠금 기호와 일치하는지 확인하고 챔버 바닥의 공기 방출이 O 기호 쪽으로 향하도록 합니다.
챔버 개구부 위에 투명 뚜껑을 놓습니다. 챔버 오른쪽의 트랙을 사용하여 투명 BTE 슬라이드를 챔버에 밀어 넣고 챔버 바닥의 잠금 장치를 슬라이드에 들어갈 수 있는 한 밀어 넣습니다. 플런저 캡이 슬라이드 상단에 장착되어 있는지 확인하십시오.
BTE 챔버를 BTE 베이스에 로드하려면 BTE 베이스 노즐이 챔버 후면으로 돌출된 상태에서 준비된 챔버를 베이스에 놓습니다. 노란색 표시등이 깜박이기 시작할 때까지 NFC 클립 태그의 흰색 스티커를 상자 오른쪽의 Z로 천천히 원을 그리며 움직여 샘플을 BTE 베이스에 로드합니다. 샘플을 베이스에 부착한 후 샘플 백에 구멍이 없는지 확인합니다.
그런 다음 샘플 백 위에 O-링을 놓아 BTE 노즐 전면에 고정합니다. 사용하지 않은 주사기 세트를 넣으려면 먼저 주사기 세트를 찢습니다. 그런 다음 사용하지 않은 주사기 세트를 저울 타워에 놓습니다.
빨간색 표시등이 깜박이기 시작하거나 눈금에 0이 표시되면 주사기 세트를 제거합니다. 유체가 하단 주사기에 남아 있는지 확인하면서 주사기에서 필터가 있는 플런저를 제거합니다. 플런저를 종이 타월이나 타워에 올려 놓고 표면에 닿지 않도록 합니다.
마지막으로 출구 포트를 주사기에 넣고 90도 돌려 주사기를 슬라이드 출구 포트에 부착합니다. 버드우드 샘플 처리를 시작하려면 상단 검은색 버튼을 눌러 기계를 시작합니다. 가방에서 버드 우드 스틱 하나를 잡고 BTE 노즐 상단에 넣습니다.
다른 손으로 챔버의 반대편에 있는 버드우드 스틱을 잡고 천천히 칼날 안으로 조금씩 내려갑니다. 버드우드를 회전시키면서 천천히 앞뒤로 움직입니다. 약간의 윙윙거리는 소리가 들리면 가지를 기계 안으로 더 깊숙이 움직여 체관부에 초점을 맞춥니다.
모든 분기에 대해 동일한 작업을 완료한 후 상단 검은색 버튼을 눌러 처리를 중지하고 표시등이 다시 노란색으로 깜박이기 시작할 때까지 기다립니다. 샘플 무게를 확인하려면 주사기를 90도 회전하고 아래로 당깁니다. 플런저를 주사기에 다시 놓고 주사기를 타워에 놓습니다.
저울이 샘플을 자동 감지한 후 녹색 LED가 깜박이면 샘플 무게가 적절한 범위 내에 있음을 나타냅니다. 빨간색 표시등이 깜박이면 너무 낮음을 나타냅니다.ample 무게, s를 반복amp르 처리. 무게가 너무 높으면 일부 s를 제거하십시오.amples, 노란색 LED의 깜박임이 느려집니다.
샘플을 균질화하려면 샘플이 들어 있는 주사기에서 플런저를 제거합니다. 유체를 주사기에 밀어 넣고 플런저를 다시 삽입합니다. 플런저를 밀어 버퍼를 통과시키고 고무 튜브를 통해 메쉬 필터를 통해 빈 주사기로 수액을 심습니다.
샘플이 균질한 녹색 액체가 될 때까지 버퍼와 식물 수액을 한 주사기에서 다른 주사기로 3-4회 앞뒤로 밀어 샘플을 혼합합니다. 잘 균질화되면 메쉬 필터가 없는 주사기에 식물 수액 샘플을 밀어 넣고 고무 튜브와 필터가 있는 주사기를 분리합니다. 그런 다음 주사기에서 식물 수액 샘플을 2 밀리리터 멸균 마이크로 원심 분리기 튜브로 배출합니다.
영구 마커를 사용하여 백 번호로 샘플을 표시 한 후 나중에 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 10번째 샘플이 처리된 후 BTE 탈착식 챔버를 소독하고 녹색 LED가 파란색으로 바뀌는 대신 계속 깜박입니다. 챔버를 분해하고 모든 오염 물질을 청소하려면 투명 플라스틱 덮개, 투명 챔버 슬라이드 및 챔버 슬라이드의 막힌 포트를 제거하십시오.
그런 다음 챔버 바닥의 공기 방출 밸브를 열린 자물쇠 표시로 돌립니다. 챔버 구성 요소를 설정 초음파 세척기에 넣은 후 뚜껑이 뜨는 것을 방지하기 위해 뚜껑이 있는 욕조에 챔버를 놓습니다. 초음파 세척기를 15 분 동안 작동시킵니다.
챔버 구성 요소를 건조 스테이션으로 이동하기 전에 수조에서 챔버 구성 요소를 최소 30초 동안 헹굽니다. 건조를 시작하려면 에어건을 챔버 상부 개구부의 홈과 일직선으로 놓고 건의 방아쇠를 눌러 약 30초 동안 공기를 분배합니다. 에어건을 챔버의 상단 노즐 쪽으로 돌리고 방아쇠를 누른 후 각 노즐 입구의 세 개의 완전한 원을 천천히 추적합니다.
에어건을 BTE 중앙에 놓고 가장 안쪽 지점에서 시작하여 방아쇠를 누른 상태에서 에어건이 슬라이드를 가리킬 때까지 움직입니다. 전체 챔버의 앞면과 뒷면에 공기를 빠르게 흐르게 하여 지표수를 외부에서 제거합니다. 감귤류 조직 처리를 위한 BTE와 통상적인 실험실 프로토콜의 비교는 두 경우 모두에서 260 나노미터에서 흡광도를 측정함으로써 결정된 추출된 핵산 농도가 비슷하다는 것을 나타내었다.
260 및 280 나노미터에서의 흡광도의 비로서 측정된 BTE에 의해 추출된 핵산의 순도는 낮은 단백질 오염으로 높았다. 감귤류 NADH 탈수소효소 유전자의 mRNA를 표적으로 하는 RT-qPCR에 의해 분석된 핵산 완전성은 BTE 및 표준 수동 프로토콜 둘 다에 대해 매우 유사하였다. 기존의 실험실 절차에서는 시료당 손으로 자르는 데 거의 7분에서 10분이 걸렸고, 동결 건조, 분쇄 및 원심분리를 포함한 조직 처리에 더 많은 시간이 필요했습니다.
그러나, BTE는 준비, 칭량 및 세척 단계를 포함하는 3분 내에 핵산 추출을 위해 각각의 샘플을 처리하였다. 첫 번째 BTE 샘플 처리로부터의 72개의 건강한 샘플 중 어느 것도 시험된 감귤 병원체에 대한 증폭 곡선을 생성하지 않았으며, 이에 의해 감귤 조직의 BTE 처리를 검증하였다. 두 번째 BTE 샘플 처리에서, 2개의 도입된 혼합 감염된 샘플과 함께, 추출된 핵산은 배치 1 및 5에서 상이한 감귤류 바이러스 및 바이로이드의 존재를 나타내었다.
그러나 헤드 사이의 교차 오염이나 위양성 또는 음성 결과는 감지되지 않았습니다. 가공하는 동안 가지를 한 곳에 너무 오래 두면 가지가 너무 깊숙이 절단되어 막힐 가능성이 높아지고 무세포 섬유 물질이 수집될 수 있습니다. 일단 처리되면 재료는 대부분의 DNA 및 RNA 추출 및 정제 프로토콜에 사용할 준비가 되며 식물 병원체에 대한 모든 분자 검출 분석으로 테스트할 수 있습니다.
Budwood Tissue Extractor를 개발함으로써 처리량이 많은 영역과 숲 전체 스크리닝의 문이 열렸습니다. Leaf Tissue Extractor와 함께 뿌리와 꽃자루와 같이 이전에 처리하기 어려운 것으로 간주되었던 식물 조직을 대규모로 처리할 수 있습니다.
