우리는 원고를 교정에 대한 기술 지원을위한 Dualsystems 생명 공학 AG와 줄리아 스트로 블에서 Laimburg 연구 센터와 Mirelle 보르헤스 디아스 Schnetzer에서 크리스틴 Kerschbamer, 토마스 Letschka, 사빈 Oettl, 마고 Raffeiner 및 플로리안 Senoner 감사합니다. 이 작품은 APPL2.0 프로젝트의 일환으로 수행되었다 부분적으로 자노 / 볼 차노, 이탈리아의 자치 지방과 남부 티롤 애플 컨소시엄에 의해 투자되었다.

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

Y2H 화면에서 전위 이펙터 단백질은 다른 가상 단백질 상호 작용한다 (단계 7)로 발현 공동. 각각의 성장 효모 클론 미끼 있지만 (잠재적으로) 다른 인터랙가 포함되어 있습니다. 상호 작용하는 단백질 먹이 플라스미드에 클로닝 된 cDNA 라이브러리로 인코딩됩니다. 미끼와 먹이은 효모 전사 인자의 일부에 대한 각각의 공동 cistronically 코드를 플라스미드. 미끼 (이펙터) 및 먹이 플라스미드 부호화 인터랙 사이의 물리적 상호 작용의 경우에는, 두 개의 전사 인자 부품합니다 (DNA 결합 도메인 및 활성 영역)이 결합되고, 리포터 유전자의 발현이 유도된다. 효모는 histidine- 및 아데닌 고갈 SD 선택 플레이트에 성장 할 수있다. 먹이 cDNA 라이브러리의 종류가 선별 이펙터에 의존하고 따라서 선택되어야한다. 먹이 미끼 벡터뿐만 아니라 효모 균주는 호환되어야한다. 이 화면에서, LEXA DNA는 도메인과 GAL4 활성화 domai 바인딩N 호환 효모 전사 인자 유닛으로 사용 하였다. cDNA의 라이브러리를 개별적으로 지정 수득 상업적 제조하거나 구성 될 수있다. cDNA에 먹이 라이브러리의 제조는이 프로토콜의 일부가 아니다. 이 프로토콜에서, 아 X의 domestica에 잎의 RNA에서 자체 제작, 표준화 된 cDNA 라이브러리를 사용하고 pGAD-HA (41)에 클로닝. 효모 균주를 발현 이펙터 (미끼)는 먹이 라이브러리로 형질 전환하고, 클론 histidine- 및 아데닌 고갈 SD 선택 플레이트에 선정되었다. 효모 식민지에서 플라스미드 DNA를 추출, 박테리아에 대한 열 기반 DNA 플라스미드 미니 키트는 효모 용해 (8 단계)를 개선하기 위해 유리 구슬을 사용하여 기계 중단 단계와 조합하는 것이 좋습니다. 이 플라스미드 정제, 미끼와 먹이 벡터는 상대적으로 낮은 농도에서 동시에 정제 할 것입니다. 그러나, 플라스미드 DNA의 양은 시퀀싱 재치 통해 상호 작용 파트너를 식별하기에 충분심 전 플라스미드 전파 (단계 8.4). 대안으로, 단계 8.4 정제 DNA 유능한 대장균에 형질 전환 될 수 있고 (예, pGAD-HA의 경우에는를 암피실린) 먹이 벡터 매개 항생제 내성으로 선택한. 선택된 E. 콜로니 만 pGAD-HA 라이브러리 플라스미드를 운반 대장균 및 고 수율 플라스미드 정제는 이들 클론에 수행 될 수있다. pLexA-N과 pGAD-HA 구조의 성공적인 변환 NMY51의 트립토판과 류신 영양 요 구성을 보완합니다. 조작자 및 단백질 (pGAD-HA에 부호화) 사이의 상호 작용은 NMY51 균주의 리포터 시스템의 활성화에 이르게. 자동 기동의 경우 NMY51 인해 NMY51 리포터 시스템의 원하지 않는 활성을 pGAD-HA는 TRP-의 Leu-그의 아데을 결여 선택적 플레이트상에서 성장 빈 라이브러리 벡터와 함께 pLexA-N을 발현 이펙터로 형질 40. 자기 활성화는 w 될 수 있습니다eak과의 부재하에 일어날 수 TRP-의 Leu-그의 또는 활성화가 강하고 TRP-의 Leu-그의 아데 플레이트 (41) 상에 성장에 의해 특징 지어 질 수있다. 자기 활성화는 실제 Y2H 화면에서 위양성 클론의 엄청난 배경을 일으킬 수 있습니다. 이 문제를 방지하려면 미끼와 자기 활성화 시험하는 이펙터 발현 벡터 공동 형질 전환 된 빈 라이브러리 벡터로하고, 실시해야합니다. 이 실험 설정에서, 리포터 유전자 발현은 유도해서는 안된다. 자동 활성화 (즉, 선택적 접시에 성장) 시험에서 볼 경우, 배지 3- 아미노 -1,2,4- 트리아 졸 (45) (3-AT)의 다른 농도로 보충 될 수있다. 3-AT는 imidazoleglycerol 인산 탈수 효소 (HIS3), 히스티딘 생합성 46 중 중요한 효소의 억제제이다. 3-AT와 보충, Y2H 화면 47시 자기 활성화의 약한 영향을 줄일 수 있습니다48. 3-AT의 다른 농도를 테스트해야합니다. 이 프로토콜에서, 1-40 mM의 AT-3을 사용 하였다. 자동 활성화의 억제에 이르게 최저 농도는 이후 Y2H 화면에서 사용되어야한다. 공동 변환의 SD-TRP-레우 플레이트 클론의 충분한 개수를 포함 할 경우, 자동 활성화 분석의 선택적 플레이트는 평가 될 수있다. 표시의 ≥로 90 mm (직경) 페트리 접시 당 500 콜로니 충분하다. 정확한 형질 감염 효율을 확인하기 위해서는 공동 형질 전환 효모의 희석액을 제조하고, SD-TRP-레우 플레이트 상을 확산 권장한다. 자기 활성화를 감소시키기 위해, 이펙터는 pLexA-C 단백질의 C 말단에 LEXA 태그 융합 미끼 발현 벡터에 클로닝 할 수있다. 렉스-A 태그의 방향은 자기 활성화 (24)를 감쇠 할 수 있습니다. 그러나, 모든 경우에 감소 또는 자체 활성을 폐지 할 수 없다. 형성빨간색 또는 붉은 식민지가 약하거나 거짓 긍정적 인 상호 작용을 나타냅니다. 그것은, 단백질 - 단백질 상호 작용에 관해서 NMY51의 ade2 리포터 유전자는 활성화되는 선회 블록이 효모 균주 40에서 빨간색 색소의 축적. 강한 인터랙 운반 콜로니 백색 동안 상호 작용이없는 경우, NMY51는 적색이다. 선택 접시에 식민지 색상의 관찰 따라서 각각의 식민지가 true- 또는 위양성 인터랙 경우 판단하는 또 다른 중요한 힌트를 제공합니다. 이는 적응 또는 미끼의 특성 및 상호 작용 특성에 대해 특정 시험 설정을 변경할 필요가 결국. 지금까지 개선 및 공통 Y2H 유도체 다수의 기술은 다른 호스트 시스템들에서 다소 어려운 단백질 상호 작용 분석을 허용하기 위해 설립되었다. Stynen 등의 알에 의한 검토. 49 해결하는차은 Y2H, 그것의 개선과 적응의 다양한 측면을 설명하고, 따라서 적절한 상호 작용 분석을 선택하는 방법에 대한 유용한 정보를 제공합니다. Y2H 화면과 파생 기술은 널리 이진 단백질 상호 작용의 확인이 필요한 곳마다 서로 다른 연구 분야에 이용되고있다. 중요한 컨트롤 등 미끼 자기 활성 테스트 및 상기 식별 된 상호 작용 단백질의 일대일 변환 재로서 수행하더라도 Y2H 거짓 결과가 26, 50, 51를 제조하기 쉽다. 모델로 효모 모든 상호 작용 연구에 적합하지 않다. 효모는 반드시 모든 단백질의 24에 해당하는 번역 후 변형 및 폴딩을 지원하는 셀룰러 환경을 구성하지 않습니다. 또한, Y2H 설정에서, 단백질은 과잉 발현되고, 발현 제어 아니다자연 프로모터에 의해 주도했다. Y2H 반드시 자연 세포 내 목적지되지 않습니다 핵에 단백질 상호 작용 파트너를 강제로. 상호 작용의 기본 세포 상황에 따라서 효모에 의해 반영되지 않을 수 있으며-위음성 또는 위양성 결과가 발생할 수 있습니다. 대부분의 Y2H는 선택적 원칙으로 효모의 영양 요구의 보완을 기반으로합니다. 이것은 영양 선택은 고감도 특징으로하지만, 다른 비교하여 감소 된 선택성 비용 (예를 들면, 발색 기자) (49)를 분석한다. 환원성 자동 활성화 (상기 참조) 또는 다른 제약이 특정 이펙터 발생할 경우 Y2H 적절한 분석 25 아니다. 표 1 및도 1에서, 자기 활성화 시험의 예상되는 결과를 나타내었다. 실제 상호 작용 (예, 위음성)의 부재는 단백질 독성, 잘못된 번역 단백질에 의해 발생할 수 있습니다상호 작용 (24)에 필요한 처리, 상호 작용의 입체 장애, 먹이 도서관에서 소수의 상호 작용 파트너, 미끼의 막 지역화 또는 누락 된 구성 요소. 이것은 새로이에게 추천 pGAD-HA로 서브 클로닝, cDNA를으로부터 식별 된 상호 작용하는 단백질의 전장 유전자를 증폭하고, 상기 생성 pGAD-HA 내로 구성 변환하여 일대일 상호 작용 분석을 수행하는 미끼 발현 NMY51 변형. 먹이 라이브러리에 존재하는 관찰 인터랙은 더 큰 단백질의 단편 될 수 있기 때문에이 작업이 필요합니다. 그러나, 각각의 전체 길이 유전자에 대한 정보는 상당한 게놈과 transcriptomic 시퀀스 데이터를 사용할 수있는 경우에만 접근 할 수있다. 여기에 설명 된 자기 - 활성화 분석의 변형 프로토콜은 일대일 분석에 적용 할 수 있고, 미끼와 인터랙 간의 상호 작용을 재현성이어야한다. 아 X의 domestica에의 TCP의 전사 인자와의 상호 작용이 담배 속 benthamiana에 이분자 형광 보완 (BiFC)와 함께 란타에서 확인되었다 (28) (이 프로토콜의 일부)를 원형질체. 이펙터 단백질 ATP_00189는 식물 병원균 P.의 말리에서 파생되었다. 란타 BiFC에 따라서 아 X의 domestica에 전사 인자 ATP_00189 상호 작용을 확인하기 위해 선택되었다 이전에 Y2H (28)에서 확인. BiFC은 리포터 시스템을 &lt;활성화하기 위해 핵으로 작용 단백질의 세포 내 전위를 필요로하지 않는 단백질 - 단백질 상호 작용 분석법 인SUP 클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 52. 또한,에서의 란타의 발현 및 수정 기계 모방의 공장 호스트의 식물 세균 이펙터 사이의 자연스러운 상호 작용의 환경을 제공합니다. 그러나 BiFC를 사용하여 글로벌 화면이 가능하지 않습니다. 신중하게 해결해야 프로토콜의 여러 단계가 있습니다. 이자 (단계 4) 유전자를 증폭 할 때, 프라이머가 식물 DNA에 결합하는 것을 배제하는 것이 중요하다. 따라서, 비 - 감염된 식물 DNA는 대조군으로 포함되어야한다. 관심의 유전자의 서열은 삽입 방향의 복제에 사용되는 효소 EcoRI 및 SalI로 제한 효소 부위를 포함 할 수 없습니다. 순서가 이러한 사이트에 포함되어 있으면 복제에 대해 서로 다른 제한 효소를 선택해야합니다. 효모 변환은이 프로토콜 동안 중앙 방법입니다. 형질 전환 효율은 효모 세포의 능력 그들의 생존, 성장 상태 및 형질 감염 reag의 품질에 따라천만에 53, 54. 제안 된 프로토콜를 들어, 높은 변환을 수행 할 때 (4 ° C로 유지) 이주보다 오래되지 신선한 판에서 효모를 사용하는 것이 좋습니다. 선택적 액체 문화가 된 한천 플레이트에서 콜로니를 접종 할 때 종종 형질 전환 효모의 성장이 지연된다. 이 플레이트로부터 직접 효모를 사용하여 실제 실험을위한 접종 액으로서 선발 배양을 사용하지 않는 것 또한 유용하다. 낮은 효율성 특정 먹이 단백질 (잠재적 인 인터랙)의 과소 대표 될 수 있습니다 미끼 발현 효모에 먹이를 형질 따라서 전체 화면을 왜곡 할 수 있습니다 때. 이 프로토콜에서, Y2H에서 ~ 15 만 CFU / μg의 형질 전환 DNA의 효모 형질 전환 효율은 잘했다. Y2H 기술의 결함과 단점을 파악하고, 중요하고 적절한 방식으로 결과를 해석하면 CORR 그리기에 필수적이다요법 결론. Y2H 분석 및 유도체는 수년간 사용되어왔다과 다른 미끼 특성에 대하여 많은 개선과 개조 후의 한 상호 작용의 세포 내 위치 파악은 상호 작용을 위해 요구 될 수있는 것으로 예상 결합 파트너 및 기타 요인 (참고 Y3H 55, 56, 57). 최근, 어레이 기반 Y2H 스크린할까요 58 수백만 대 다수 베이트 자동화 고 처리량 분석 있도록 개발되었다. 미래는 대부분 다른 연구 분야에서 복잡한 신호 전달 경로와 상호 작용 체의 해명 수 있도록이 분석에 자동화 및 높은 처리량 접근 방식에있다.

<html> 효모 두 하이브리드 스크린 (Y2H)는 11 약 27 년전 한 개발 널리 특정한 단백질 - 단백질 상호 작용이 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10을 결정하는 다양한 분야에 사용되어 이후가 있었다 . 호스트 표적 단백질 세균성 이펙터의 물리적 상호 작용은 종종 표적 단백질의 기능 조작을위한 전제 조건이다. 이러한 상호 작용을 분석하는 것은 감염 생물학 12, 13, 14, 15의 다양한 섹터의 포커스를 이동,&quot;16, 17, 18. Y2H 화면의 원리는 두 단백질의 상호 작용은 리포터 유전자의 발현을 구동하는 기능 전사 인자의 재구성을 유도한다는 것이다. 공지 이펙터 (&gt;을&quot;미끼 &quot;)는 병진 융합 DNA의 결합 도메인 전사 인자 (DBD)와 전위의 상호 작용 파트너 (이하 &quot;먹이&quot;) 상호 작용 파트너 잠재적 라이브러리 알 때문이다. 각각의 전사 인자의 활성 도메인 (AD)에 융합에 인터랙은 소위로 복제됩니다 &quot;먹이 라이브러리.&quot;일반적으로,이 라이브러리가 만든 DBD 인코딩 미끼 벡터와 호환되는 AD를 인코딩 적절한 먹이 벡터 발현 플라스미드로 cDNA를 클로닝하여. 상호 작용의 경우, 재구성 된 전사 인자는 일반적 효모의 성장 선택 사용 리포터 유전자의 발현을 유도한다.을인터랙의 식별은 플라스미드 특이 적 프라이머와 먹이 플라스미드를 시퀀싱에 의해 달성된다. 박테리아는 조작과 호스트의 신진 대사를 공격 또는 방어 메커니즘을 회피하고 다른 세균 분비 시스템 19, 20, 21을 통해 이펙터 분자를 분비하는 다양한 전략을 개발했다. 이러한 세균 이펙터의 결합 파트너를 결정하는 것은 따라서 호스트의 조작 경로를 식별하는 첫 번째 단계입니다. 이것은 특정 병원성 메카니즘의 개선 된 이해를 이끈다. Y2H 스크린 phytoplasmoses 동안 박테리아 효과기 작용을 식별하기 위해 수행되며, 종종 Y2H는 피토 플라스마 조사 22, 23 분자 병원성 메카니즘의 상기 특성화 중요한 초기 실험이다. 그러나, 충족대부분의 출판물에서 HOD 설명은 오히려 부족하고, 이러한 기술들은 생명 공학 회사에 아웃소싱하고 있습니다. 이 방법의 가능성에 관심을 끌기 위해,이 프로토콜은 자연 호스트에 세균 이펙터 분자의 상호 작용 파트너를 식별하기 위해 단계별로 정보를 제공합니다. 넓은 사용과 Y2H 화면의 빨리 감기 접근에도 불구하고, 특정 상호 작용은 효모 시스템에서 발생하지 않을 수도 있음을 잊어서는 안됩니다. 이 효모 세포는 특정 생물학적 제한으로 &quot;생체 반응 용기&quot;의 일종으로 사용되기 때문이다. 몇몇 저자들은 장점 및 Y2H 및 그 유도체 11, 24, 25, 26, 27의 단점을 해결했다. 일반적인 고려 사항은 효모 세포 적절한를 제공 할 수 있음을, 예를 들면, 아르유전자 발현 (포스트) 번역, 또는 각각의 단백질 translocational 조건은 연구되고. 이 화면에서 위음성 결과로 이어질 수 있습니다. 긍정적 인 상호 작용을 차례로 유물 할 수 있으며 (해당 호스트에 이펙터의 경우, 즉) 자연 상태에서 발생하지 않을 수 있습니다. 더 밀접하게 관련된 생물학적 시스템에서의 상호 독립적 인 테스트와 이종 효모 발현 시스템에서의 상호 작용을 확인하는 것이 필수적이다. 본 연구에서는 비 경작 식물 병원균 말리 Candidatus 피토 플라스마 (P.의 말리)에서 이펙터 ATP_00189의 결합 파트너가 확인되었다. 결과는 애플의 증식 (28), 유럽 (29)에 영향 사과 재배 지역에서 높은 경제적 손실을 유발하는 질병의 증상 개발의 기초가되는 분자 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td><td>Applichem</td><td>A6284</td><td>for DNA preparation</td></tr><tr><td>Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td><td>Applichem</td><td>A2264</td><td>for media and buffer</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Applichem</td><td>A2942</td><td>for media and buffer</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td>for media and buffer</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosin sodium salt</td><td>Applichem</td><td>A7402</td><td>for DNA preparation</td></tr><tr><td>ammonium acetate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>9688</td><td>for DNA preparation</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Applichem</td><td>A1108</td><td>for DNA preparation</td></tr><tr><td>Isopropanol (2-Propanol)</td><td>Applichem</td><td>A3928</td><td>for DNA preparation</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>51976</td><td>for DNA preparation</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Applichem</td><td>A2760</td><td>for DNA preparation</td></tr><tr><td>Chloroform:Isoamyl 24:1</td><td>Applichem</td><td>A1935</td><td>for DNA preparation</td></tr><tr><td>Proofreading Polymerase (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; iProof)</td><td>Bio-Rad</td><td>203433</td><td>for PCR</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0271</td><td>for cloning</td></tr><tr><td>SalI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0641</td><td>for cloning</td></tr><tr><td>Column-based DNA Purification Kit (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; QIAquick)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>for cloning</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>for microbiological selection</td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8056</td><td>for self-activation assay</td></tr><tr><td>L-Arginine Monohydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3680</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>L-Isoleucine&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3642</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>L-lysine Monohydrate&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3448</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>L-Methionine&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3897</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>L-Phenylalanine&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3464</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>L-Threonine&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3946</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>L-Tyrosine&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3401</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>L-Uracile</td><td>Applichem</td><td>A0667</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>L-Valine&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3406</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>L-Adenine Hemisulfate Salt&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1596</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m Pore Filter</td><td>Sartorius</td><td>16541</td><td>for sterile filtration</td></tr><tr><td>L-Histidine Monohydrochloride</td><td>Applichem</td><td>A3719</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>L-Leucine&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3496</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>L-Tryptophane&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3410</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51483</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>D-Glucose Monohydrate&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1349</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-1</td><td>for yeast and bacteria culture</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Applichem</td><td>A2208</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td><td>Applichem</td><td>A1249</td><td>for yeast transformation</td></tr><tr><td>Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td><td>Applichem</td><td>A3478</td><td>for yeast transformation</td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A2159</td><td>for yeast transformation</td></tr><tr><td>Antibody against Lex-A tag (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Anti-LexA DNA binding region)</td><td>Millipore</td><td>06-719</td><td>for Western blot</td></tr><tr><td>Plasmid Miniprep kit (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PLN350</td><td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td></tr><tr><td>Acid Washed Glass Beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>for plasmid purification from yeast</td></tr><tr><td>Ampicillin Sodium Salt</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td>for microbiological selection</td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>Vacuum concentrator centrifuge (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Concentrator 5301)</td><td>Eppendorf</td><td>Z368245 (Sigma)</td><td>for DNA preparation</td></tr><tr><td>Bait vector (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; pLexA-N)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>for Y2H</td></tr><tr><td>Prey vector (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; pGAD-HA)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>for Y2H</td></tr><tr><td>Control prey vector (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; pLexA-p53)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>for Y2H</td></tr><tr><td>Control bait vector (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; pACT-largeT)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>for Y2H</td></tr><tr><td>Electrocompetent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td><td>Invitrogen</td><td>C640003</td><td>for cloning</td></tr><tr><td>Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&amp;Delta;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; NMY51)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>for Y2H</td></tr><tr><td>Plastic paraffin film (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Parafilm M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>for yeast and bacteria culture</td></tr><tr><td>Gas permeable sealer (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; BREATHseal)</td><td>Greiner</td><td>676 051</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>PCR Cycler (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; T100 Thermal Cycler)</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>for PCR</td></tr><tr><td>quantitative PCR Cycler (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195</td><td>for quantitative PCR</td></tr><tr><td>Microcentrifuge (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Centrifuge 5417 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5417 R</td><td>general lab equipment</td></tr><tr><td>Centrifuge (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Centrifuge 5804 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>general lab equipment</td></tr><tr><td>Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td><td>5Prime</td><td>2500010</td><td>for PCR and DNA works</td></tr><tr><td>Scalpell</td><td>Swann-Morton</td><td>0301</td><td>for DNA preparation</td></tr><tr><td>Sterile filter (0.22 &amp;micro;m; Polyethersulfone)</td><td>VWR-International</td><td>514-0073 (European Catalogue number)</td><td>for yeast and bacteria culture</td></tr><tr><td>Petri dishes &amp;Oslash; 90 mm&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td>for yeast and bacteria culture</td></tr><tr><td>Petri dishes &amp;Oslash; 150 mm&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639161</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>Photometer (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; BioPhotometer)</td><td>Eppendorf</td><td>550507804</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>Photometer Cuvettes</td><td>Brand</td><td>759015</td><td>for yeast culture</td></tr><tr><td>Water Bath (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Water Bath Memmert WB7)</td><td>Memmert</td><td>WB7</td><td>for yeast transformation</td></tr><tr><td>Western Blot Equipment</td><td>Bio-Rad</td><td>diverse</td><td>for protein detection</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>5Prime</td><td>2201210</td><td>for cloning</td></tr><tr><td>Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 mL; 1,000 mL; 2,000 mL) and breathable cotton plugs (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232793, Z232858, Z232866</td><td>for yeast and bacteria culture</td></tr><tr><td>Shaking Incubator (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; GFL 3031)</td><td>GFL</td><td>3031</td><td>for yeast and bacteria culture</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Binder</td><td>KB 53 (E3.1)</td><td>for yeast and bacteria culture</td></tr><tr><td>Ice Maker (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Ice Maker IF 825)</td><td>Omniwash</td><td>IF 825</td><td>general lab equipment</td></tr><tr><td>0.2 mL, 1.5 mL and 2.0 mL Reaction Vials (Polypropylene)</td><td>Eppendorf</td><td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td><td>general lab equipment</td></tr><tr><td>Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10 - 1,000 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf</td><td>diverse</td><td>general lab equipment</td></tr><tr><td>Spreader</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SPR-L-S01</td><td>for yeast and bacteria culture</td></tr><tr><td>Vortex shaker (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; MS 3 Minishaker)</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>general lab equipment</td></tr><tr><td>T4-Ligase</td><td>Thermo Fisher</td><td>EL0011</td><td>for cloning</td></tr><tr><td>Fridge (4 &amp;deg;C) (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Liebherr Medline FKEX 5000)</td><td>Liebherr</td><td>81.767.580.4</td><td>general lab equipment</td></tr><tr><td>Freezer (-20 &amp;deg;C) (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Liebherr Comfort Professional G5216)</td><td>Liebherr</td><td>G5216</td><td>general lab equipment</td></tr><tr><td>Graduated Cylinder (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Brand)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z327352; Z327417; Z327441&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>general lab equipment</td></tr><tr><td>Serological Pipettes (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S55701</td><td>for yeast and bacteria culture</td></tr><tr><td>Mechanical Pipettor (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Pipetboy acu 2)</td><td>Integra-Biosciences</td><td>155000</td><td>general lab equipment</td></tr><tr><td>Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td><td>Molecular Bio Products</td><td>5510-11</td><td>for bacteria transformation</td></tr><tr><td>Electroporator (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Eporator)</td><td>Eppendorf</td><td>4309000019</td><td>for bacteria transformation</td></tr><tr><td>Gel and Blot imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; ChemiDoc MP System)</td><td>Bio-Rad</td><td>1708280</td><td>general lab equipment</td></tr><tr><td>Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 mL)</td><td>VWR-International&amp;nbsp;</td><td>525-0403 (European Catalogue number)</td><td>general lab equipment</td></tr><tr><td>Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 mL)</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>general lab equipment</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT; 1 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>P2325</td><td>for ligation</td></tr><tr><td>adenosine triphosphate (ATP, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; ATP Solution (10 mM))</td><td>Ambion&amp;nbsp;</td><td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td><td>for ligation</td></tr><tr><td>Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2021 Sigma&amp;nbsp;</td><td>for yeast culture (ready-made mix)</td></tr></tbody></table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

질병 발현의 분자 메커니즘을 해결했습니다 것은 식물 과학 병리와 증상의 발전을 이해하는 것이 중요합니다. 박테리아는 자신의 이익을 위해 자신의 호스트 신진 대사를 조작하기 위해 다른 전략을 진화했다. 이 박테리아 조작은 종종 심각한 증상 개발 또는 영향을받는 식물의 죽음과 연결되어있다. 호스트 조작에 책임이있는 특정 박테리아 분자를 결정하는 것은 미생물 연구의 중요한 분야가되고있다. 불리는이 박테리아 분자의 식별 한 후 &quot;이펙터,&quot;그들의 기능을 규명하는 것이 중요하다. 직접적인 방법은 이펙터의 기능은 효모 두 하이브리드 (Y2H) 화면을 통해 자연 호스트에서의 단백질 바인딩 파트너를 식별하는 것입니다 결정합니다. 일반적으로 호스트는 실리 알고리즘의 모든 의해 충분히 예상 할 수없는 수많은 잠재적 인 바인딩 파트너를 항구. 따라서 PERFO 할 수있는 최선의 선택표현 호스트 단백질의 전체 라이브러리에 대한 가상 이펙터로 화면을 RM은. 원인이 에이전트가 피토 플라스마와 같은 uncultivable 경우는 특히 도전이다. 이 프로토콜은 피토 플라스마에 감염된 나무가 우거진 호스트 공장, 잠재적 인 이펙터의 증폭 및 Y2H 화면과 식물의 분자 상호 작용 파트너의 후속 식별에서 DNA 정제에 대한 단계별 지침을 제공합니다. Y2H 화면은 일반적으로 사용되는 경우에도, 비용의 Y2H 서비스를 제공 바이오텍 회사에이 기술을 조달하는 경향이있다. 이 프로토콜은 표준 실험실 기술을 사용하여 임의의 품위를 갖추고 분자 생물학 실험실에서 Y2H을 수행하는 방법에 대한 지침을 제공합니다.

실제 Y2H 화면이 수행 할 수 있습니다 전에 미끼 자기 활성화를 위해 테스트해야합니다. 이는 빈 먹이 라이브러리 벡터와 함께 베이트 발현 벡터 변환 선택적 접시에 성장을 확인함으로써 달성된다. 섹션 5. 베이트 플라스미드 TRP 보완하고 먹이 S. cerevisiae의 NMY51 40 레우 영양 요구 플라스미드에 설명 된대로 phytoplasmal 단백질 ATP_00189 자기 활성화를인지를 분석하기 위하여, 자기 활성화 시험을 수행 하였다. 성공적인 공동 변환 따라서 TRP와 레우가없는 선택적 판에 성장을 특징으로한다. 미끼와 먹이 단백질의 상호 작용 NMY51의 자신과 에이드 영양 요구의 보완에 연결됩니다. 상호 작용의 부재 미끼로 자기 활성화가 나타나면, 효모는 자신과 에이드가없는 선택적 접시에 성장한다. 강하고 약한 자기활성화가 발생할 수 있습니다. 미끼의 강한 자기 활성화 TRP-레우 - 그의 - 에이드 고갈 선택 접시에 공동 형질 전환 된 효모의 성장을 특징으로한다. 약한자가 활성화에 성장에 이르게 TRP-레우 - 그의하지만 TRP-레우 - 그의 - 에이드 고갈 선택 접시에. 적절한 양성 대조군에는 자기 활성화 분석의 결과를 해석 불가결하다. 상기 자기 활성화 분석의 예상 결과의 요약과 그 해석은 표 1에 제공 그림 1에서 시각화된다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> 그림 1 : Y2H 화면을 수행하기 전에 미끼의 미끼 자기 활성화 테스트의 예. , 약한자가 활성화 플러스 빈 먹이 천칭 자리 : S. cerevisiae의 NMY51은 양성 대조군 (교류 왼쪽 패널)와 같은 (플렉스-p53의) 먹이 (PACT-largeT) 미끼 상호 작용과 공동 형질 전환공예 벡터 (중간 패널 : DF) 및하지 자체 활성화 미끼 플러스 빈 먹이 라이브러리 벡터 (오른쪽 패널 : GI). , TRP, 레우와 그의 (중간 패널 : B, E, H) : 공동 형질 전환 된 효모가 TRP와 레우 (A, D, G, 상단 패널) 부족 SD 접시에 배양하고, TRP, 레우을, 자신과 에이드 (낮은 패널 : C, F, I). 미끼 벡터가 TRP의 영양 요구와 먹이 벡터 NMY51 (SD-TRP-레우에 성장)의 레우의 영양 요구를 보완으로 매체 부족한 TRP와 레우에 선택, 성공적인 공동 변환에 대한 긍정적 인 컨트롤입니다. 미끼 먹이 또는 미끼 자동 활성화의 상호 작용의 경우, NMY51의 리포터 발현은 켜져 있고 그와 ADE 영양 요구 (SD-TRP-의 Leu-그의 아데에 성장)를 보완한다. 약한자가 활성화는 SD-TRP-레우 - 자신의 접시에 성장이 특징입니다 (가운데 패널, DF). 미끼의 약한자가 활성화 전에 미끼를 분석 감소해야Y2H 화면에서 선택 배지에 3-AT를 첨가하여 예. 아미노산 고갈 함께 표시됩니다 &quot;-&quot;각 미디어의 이름으로. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> 없음 </td><td> 식민지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td></tr><tr><td> 없음 </td><td> pGAD-HA </td><td> 더 성장하지 </td><td> 식민지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> 없음 </td><td> 식민지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> 식민지 </td><td> 식민지 </td><td&gt; 식민지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td></tr><tr><td> pLexA-p53의 </td><td> PACT-largeT </td><td> 식민지 </td><td> 식민지 </td><td> 식민지 </td><td> 식민지 </td><td> 식민지 </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> 식민지 </td><td> 식민지 </td><td> 식민지 </td><td> 더 성장하지 </td><td> 더 성장하지 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 미끼 자기 활성화 분석에 예상 결과. S. cerevisiae의 NMY51의 변환은 공동 형질 전환 미끼 먹이의 특성에 따라 선택적 미디어에 차동 성장을 산출한다. 선택적 접시에 성장은 30 ° C에서 72 시간 배양 후 다른 벡터 조합 (AF)의 변화에 ​​따라 평가 하였다. 약한자가 활성화는에 효모의 성장을 특징으로 SD-TRP-레우 - 자신과 SD-TRP-레우 - 그의 - 에이드 선택 작은지면에 성장에 의해 강한 자기 활성화상호 작용 파트너의 부재하에 에스. pLexA-N 인코딩 phytoplasmal 이펙터 ATP_00189는 NMY51 자신과 에이드의 부재에서 성장하는 형질 전환 미끼 벡터의 무능력을 특징으로 자기 활성화를 발생하지 않습니다. 미끼에 따라 Y2H 화면이 선택적 접시에 성장하는 수많은 효모 클론을 얻을 수 있습니다. 모든 클론을 분석하고 가능한 중복 검사해야합니다. 정규화 된 cDNA 라이브러리가 사용 된 경우에도, 인터랙 많은 다른 클론 표현 가능성이 높다. 라이브러리 클로닝 기법에 따라, 전체 유전자의 단편을 일부 잡아 벡터에 삽입하는 것도 가능하다. (cDNA의부터) 증폭과 인터랙의 전체 길이 유전자를 서브 클로닝하고 일대일 Y2H 분석 (도 2)에서의 상호 작용을 시험하기 노보을 해제하는 것이 바람직하다. <img aLT = &quot;그림 2&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2 : Y2H 실험에서 미끼와 먹이 사이의 상호 작용의 예. 효모 두 하이브리드 (Y2H) 화면을 수행하고 긍정적 인 인터랙 클론의 플라스미드를 정제 하였다. 먹이 벡터는 서열하고, 아 X의 domestica에 호스트 상호 작용 파트너 MdTCP24 및 MdTCP25이 확인되었다. 부정적인 제어 MdTCP34 (있는 더 인터랙가 Y2H 라이브러리 화면에서 확인되지 않았다)으로 병렬로 서브 클로닝 하였다. 전장 유전자 먹이 벡터 (공동 cistronically 활성 도메인 AD 표현) 내로 서브 클로닝 사과의 cDNA로부터 증폭되었다 새로이 DNA의 결합 도메인 (BD)에 접속 세균 이펙터 ATP_00189 표현 베이트 벡터로 공동 - 형질 전환. 이 수치는 28에서 가져옵니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 버전입니다.

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Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

세균 이펙터 단백질 성공적인 감염의 확립에 중요하다. 이 프로토콜은 천연 식물 호스트에 세균 이펙터 단백질의 단백질 결합 파트너의 실험 식별을 설명합니다. 효모 두 하이브리드 화면을 통해 이러한 이펙터 상호 작용을 확인하는 분자 병원성 전략을 탈피하는 중요한 도구가되었습니다.

효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K 조회수.  Laimburg Research Centre.  세균 이펙터 단백질 성공적인 감염의 확립에 중요하다. 이 프로토콜은 천연 식물 호스트에 세균 이펙터 단백질의 단백질 결합 파트너의 실험 식별을 설명합니다. 효모 두 하이브리드 화면을 통해 이러한 이펙터 상호 작용을 확인하는 분자 병원성 전략을 탈피하는 중요한 도구가되었습니다. 

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A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between proteins such as transcription factors (TFs) and their DNA target. The method presented here utilizes the underlying concept of the Y1H but is modified further to study and validate protein complexes binding to their target DNA. Hence, it is referred to as the modified yeast one-hybrid (Y1.5H) assay. This assay is cost effective and can be easily performed in a regular laboratory setting. Albeit using a heterologous system, the described method could be a valuable tool to test and validate the heteromeric protein complex binding to their DNA target(s) for functional genomics in any system of study, especially plant genomics.

The modified yeast one-hybrid assay described here is an extension of the classical yeast one-hybrid (Y1H) assay to study and validate the heteromeric protein complex-DNA interaction in a heterologous system for any functional genomics study.

이성질체 단백질 복합체 -DNA 상호 작용 연구를위한 수정 된 효모 원 하이브리드 시스템

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

연구

생화학

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated biological pathways to the benefit of the bacterium. Identification of putative bacterial effector proteins has become more manageable due to advances in bacterial genome sequencing and the advent of algorithms that allow in silico identification of genes encoding secretion candidates and/or eukaryotic-like domains. However, identification of these important virulence factors is only an initial step. Naturally, the goal is to determine the molecular function of effector proteins and elucidate how they interact with the host. In recent years, techniques like the yeast two-hybrid screen and large-scale immunoprecipitations coupled with mass spectrometry have aided in the identification of protein-protein interactions. Although identification of a host binding partner is the crucial first step toward elucidating the molecular function of a bacterial effector protein, sometimes the host protein is found to have multiple biological functions (e.g., actin, clathrin, tubulin), or the bacterial protein may not physically bind host proteins, depriving the researcher of crucial information about the precise host pathway being manipulated. A modified yeast toxicity screen coupled with a suppressor screen has been adapted to identify host pathways impacted by bacterial effector proteins. The toxicity screen relies on a toxic effect in yeast caused by the effector protein interfering with the host biological pathways, which often manifests as a growth defect. Expression of a yeast genomic library is used to identify host factors that suppress the toxicity of the bacterial effector protein and thus identify proteins in the pathway that the effector protein targets. This protocol contains detailed instructions for both the toxicity and suppressor screens. These techniques can be performed in any lab capable of molecular cloning and cultivation of yeast and Escherichia coli.

Bacterial pathogens secrete proteins into the host that target crucial biological processes. Identifying the host pathways targeted by bacterial effector proteins is key to addressing molecular pathogenesis. Here, a method using a modified yeast suppressor and toxicity screen to elucidate host pathways targeted by toxic bacterial effector proteins is described.

효모 독성 및 억제기 스크린을 사용하여 세균 효과 단백질에 의해 표적으로 한 호스트 통로의 확인

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

유전학

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

면역학 및 감염병학

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins with the ability to inhibit the host plant RNA silencing pathway. Unlike virus effector proteins, only several secreted effector proteins have showed the ability to suppress RNA silencing in bacterial, oomycete, and fungal pathogens, and the molecular functions of most effectors remain largely unknown. Here, we describe in detail a slightly modified version of the co-infiltration assay that could serve as a general method for observing RNA silencing and for characterizing effector proteins secreted by plant pathogens. The key steps of the approach are choosing the healthy and fully developed leaves, adjusting the bacteria culture to the appropriate optical density (OD) at 600 nm, and observing green fluorescent protein (GFP) fluorescence at the optimum time on the infiltrated leaves in order to avoid omitting effectors with weak suppression activity. This improved protocol will contribute to rapid, accurate, and extensive screening of RNA silencing suppressors and serve as an excellent starting point for investigating the molecular functions of these proteins.

Here, we present a modified screening method that can be extensively used to quickly screen RNA silencing suppressors in plant pathogens.

식물 병원균의 분비 이펙터에서 RNA 침묵 억제제의 스크리닝 및 식별

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

분할 Ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템 : 단백질 단백질 상호 작용을 확인을위한 강력한 도구

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

생물학

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

성장 저해 Phenotypes의 확인은 효모에서 세균의 종류 III Effectors 표현에 의해 유도된

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role in a variety of physiologic and disease processes, including early embryogenesis, wound healing 1, inflammation 2, 3, and host defense 4. PGRN also functions as a neurotrophic factor 5, and mutations in the PGRN gene resulting in partial loss of the PGRN protein cause frontotemporal dementia 6, 7. Our recent studies have led to the isolation of PGRN as an important regulator of cartilage development and degradation 8-11. Although PGRN, discovered nearly two decades ago, plays crucial roles in multiple physiological and pathological conditions, efforts to exploit the actions of PGRN and understand the mechanisms involved have been significantly hampered by our inability to identify its binding receptor(s). To address this issue, we developed a modified yeast two-hybrid (MY2H) approach based on the most commonly used GAL4 based 2-hybrid system. Compared with the conventional yeast two-hybrid screen, MY2H dramatically shortens the screen process and reduces the number of false positive clones. In addition, this approach is reproducible and reliable, and we have successfully employed this system in isolating the binding proteins of various baits, including ion channel 12, extracellular matrix protein 10, 13, and growth factor14. In this paper, we describe this MY2H experimental procedure in detail using PGRN as an example that led to the identification of TNFR2 as the first known PGRN-associated receptor 14, 15.

We have modified the conventional yeast two-hybrid screening, an effective genetic tool in identifying protein interaction. This modification markedly shortens the process, reduces the workload, and most importantly, reduces the number of false positives. In addition, this approach is reproducible and reliable.

성장 팩터 Progranulin와 상호 작용하는 단백질을 식별하기 위해 수정된 효모 - 2 하이브리드 시스템

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

Yeast Two-Hybrid 기법을 이용한 생체 분자 상호 작용 연구 

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the role(s) and function(s) of a specific protein-protein interaction is to compare the phenotype of the wild-type (with the relevant protein-protein interaction) and those of mutants that lack the relevant interaction. Therefore, if such mutants can be isolated, they will help to elucidate the related biological processes. The yeast two-hybrid (Y2H) procedure is a powerful approach not only to detect protein-protein interactions but also to isolate interaction-null/impaired mutants. In this article, a protocol is presented to isolate interaction-null/impaired mutants using Y2H technology. First, a mutation library is constructed by combining the polymerase chain reaction and efficient seamless cloning technology, which efficiently excludes the empty vector from the library. Second, interaction-null/impaired mutants are screened by the Y2H assay. Because of a trick in the Y2H vector, undesired mutants, such as those with frameshift and nonsense mutations, are efficiently eliminated from the screening process. This strategy is simple and can, therefore, be applied to any combination of proteins whose interaction can be detected by the two-hybrid system.

저자 스포트라이트: 효모에서 상호 작용-null 돌연변이의 향상된 분리

The interactions of biomolecules, such as protein-protein interactions, are the molecular basis of biological functions. If interaction-null/impaired mutants that specifically lack the relevant interaction can be isolated, they will greatly help to understand the function(s) of this interaction. This article presents an efficient way to isolate interaction-null/impaired mutants.

Yeast Two-Hybrid Assay를 사용한 상호 작용-null/손상된 돌연변이 분리

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...