通过仪器工程自动化柑橘接穗加工，用于下游病原体检测

所展示的技术使用低成本仪器快速处理富含韧皮部的柑橘组织，无需劳动密集型方案和专门的实验室设备。这样可以快速检测和管理柑橘类病毒、病毒和细菌的下游。这种方法可以提高检测服务的通量，提高质量和统一性，使柑橘产业受益，并可能有助于诊断和治疗苗圃和田间作业中的疾病。

柑橘类植物受到病原体的感染，在世界范围内造成重大的经济损失。先进的病原体检测技术，如布穗组织提取器（BTE），对于生产用于大规模树木生产的病原体测试繁殖材料是必要的。虽然该方法经过柑橘样品的测试和验证，但可用于诊断实验室和许多其他作物的田间操作。

执行此技术的初学者必须熟悉协议，严格遵循说明并耐心等待。首先，使用手机应用测试跟踪器选择一棵树，并将近场通信 （NFC） 项圈标签固定到手机，以将树信息加载到标签中。将三到四个柑橘接穗样品插入布穗组织提取器或BTE，兼容的塑料袋载体中，并用夹子将其关闭。

按照文本中描述的步骤确保样品质量后，使用手机应用程序测试跟踪器扫描树的 NFC 项圈标签，并将其与样品袋上的 NFC 夹标签链接。在经过适当消毒的通风橱内，拨动组织提取器底座背面的开关。确保按下盒子左侧的开关顶部，然后等待，直到闪烁的绿色 LED 表示腔室已准备就绪。

要制备BTE室，请使用O形圈将其固定在后喷嘴上，将空样品袋连接到腔室的背面。检查刀片是否有磨损或损坏迹象，例如刀片上的切口延伸到塑料中，或尖端的切口。确保刀片上的箭头与单锁符号对齐，并且腔室底部的空气释放转向 O 符号。

将透明盖子放在腔室开口上。使用腔室右侧的轨道，将透明的BTE滑轨滑到腔室上，将腔室底部的锁推入滑轨。确保柱塞盖安装在滑块顶部。

要将 BTE 腔室装载到 BTE 底座上，请将准备好的腔室放在底座上，BTE 底座喷嘴突出到腔室的背面。通过将NFC夹标签上的白色贴纸以缓慢的圆周运动移动到盒子右侧的Z轴上，直到黄灯开始闪烁，将样品加载到BTE底座上。将样品连接到底座后，确保样品袋上没有孔。

然后将 O 形圈放在样品袋上，将其固定在 BTE 喷嘴的前面。要装载未使用的注射器套件，首先，撕裂注射器套件。然后将未使用的注射器放在秤塔上。

当红灯开始闪烁或刻度显示零时，取出注射器组。从注射器上取下带有过滤器的柱塞，同时确保液体留在底部注射器中。将柱塞放在纸巾或塔上，不要接触任何表面。

最后，通过将出口口压入注射器并将其旋转90度，将注射器连接到滑动出口。要开始处理接穗样品，请按顶部的黑色按钮启动机器。从袋子里拿一根接穗棒，把它穿过BTE喷嘴的顶部。

用另一只手抓住腔室另一侧的接穗棒，慢慢地向下插入刀片。在旋转接穗的同时慢慢来回移动接穗。当听到轻微的嗡嗡声时，将树枝更深地移动到机器中以专注于韧皮部。

完成所有分支的相同操作后，按顶部的黑色按钮停止处理，并等待指示灯再次开始闪烁黄色。要验证样品重量，请将注射器旋转 90 度并将其向下拉。将柱塞放回注射器上，然后将注射器放在塔上。

秤自动检测样品后，绿色 LED 闪烁表示样品重量在适当范围内。如果红灯闪烁，表示样品重量过低，请重复样品处理。如果重量太高，请取出一些样品，黄色LED的闪烁会变慢。

要使样品均质化，请从装有样品的注射器中取出柱塞。将液体推入注射器并将柱塞插入回去。推动柱塞通过缓冲液，植物汁液通过网状过滤器通过橡胶管进入空注射器。

通过将缓冲液和植物汁液从一个注射器来回推到另一个注射器三到四次来混合样品，直到样品变成均匀的绿色液体。一旦充分均质化，将植物汁液样品推入没有网状过滤器的注射器中，并从中分离橡胶管和带有过滤器的注射器。然后将植物汁液样品从注射器中排出到两毫升无菌微量离心管中。

使用永久性记号笔用袋号标记样品后，将它们储存在零下 20 摄氏度直至进一步使用。处理第 10 个样品后，对 BTE 可拆卸腔室进行消毒，绿色 LED 继续闪烁而不是变为蓝色。要拆卸腔室并清洁所有污染物，请拆下透明塑料盖、透明腔室滑块和腔室滑轨上的堵塞端口。

然后将腔室底部的空气释放阀转到打开的挂锁标记。将腔室组件放入设置超声波清洗机后，将腔室放入浴槽中，盖子在其下方，以防止盖子漂浮。运行超声波清洗机15分钟。

在将腔室组件移动到干燥站之前，在水浴中冲洗腔室组件至少 30 秒。要开始干燥，请将气枪与腔室上部开口的凹槽对齐，然后按下喷枪的扳机以分配空气约30秒。将气枪转向腔室的顶部喷嘴，按下扳机后，缓慢地跟踪每个喷嘴入口的三个完整圆圈。

将气枪放在BTE的中心，从最内侧开始按住扳机并移动，直到气枪指向滑块。快速将空气流过整个腔室前后，以去除外部的地表水。BTE和柑橘组织处理常规实验室方案的比较表明，在两种情况下，通过测量260纳米吸光度确定的提取核酸浓度是相当的。

BTE提取的核酸纯度为260和280纳米处的吸光度比，蛋白质污染低。通过RT-qPCR分析的靶向柑橘NADH脱氢酶基因mRNA的核酸完整性对于BTE和标准手动方案非常相似。传统的实验室程序需要将近 7 到 10 分钟的时间手工切碎每个样品，而组织处理需要更多时间，包括冷冻干燥、研磨和离心。

然而，BTE在三分钟内处理了每个样本以进行核酸提取，包括制备、称量和清洁步骤。来自第一次BTE样品处理的72个健康样品中没有一个对测试的柑橘病原体产生扩增曲线，从而验证了柑橘组织的BTE处理。在第二次BTE样品处理中，使用两个引入混合感染样品，提取的核酸在第1批和第5批中显示出不同的柑橘病毒和类病毒的存在。

然而，没有检测到头部之间的交叉污染，或假阳性或阴性结果。在加工过程中，将树枝放在一个地方太久可能会切入树枝太深，从而增加堵塞的机会，并收集无细胞纤维材料。一旦处理，该材料就可以用于大多数DNA和RNA提取和纯化方案，并且可以使用任何植物病原体的分子检测测定进行测试。

开发布穗组织提取器为高通量区域和树林范围的筛选打开了大门。与叶组织提取器一起，它允许大规模处理以前被认为难以处理的植物组织，例如根和花梗。