우리의 프로토콜은 배양 된 제브라피시 뉴런과 애벌레에 과산화수소 바이오 센서의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 연구원이 일반적인 생리학 및 병리 생리학에 있는 반응성 산소 종의 역할을 해부하는 것을 도울 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 동물과 배양 된 세포에서 과산화수소의 실시간 검출입니다.
이 방법은 설치류 모델 시스템과 같은 다른 동물에 적용할 수 있습니다. 커버립을 준비하려면 100% 에탄올에 저장된 산성 세척 커버립을 사용하십시오. 집게를 사용하여 저장 용기에서 하나의 커버슬립을 제거하고 화염을 일으켜 잔류 에탄올을 제거합니다.
35mm 배양 접시 안에 비스듬히 배치하여 커버슬립을 완전히 건조시합니다. 폴리-D-리신 또는 PDL 또는 작업 솔루션을 준비합니다. 각 커버슬립의 중앙에 PDL을 적용하여 용액이 가장자리에 퍼지지 않도록 하고 실온에서 20~30분 동안 PDL을 배양합니다.
PDL이 건조되지 않았는지 확인합니다. 멸균 수의 0.5 밀리리터로 PDL을 세척하고 접시가 완전히 건조하게하십시오. 라미닌 작업 솔루션을 준비합니다.
그리고 각 커버 슬립의 중심에 적용하여 가장자리에 솔루션이 확산되는 것을 방지하십시오. 가습된 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2~6시간 동안 플레이트를 배양하고 라미닌 용액의 건조를 피하십시오. 플레이트 망막 신경절 세포 또는 RGCs에서 배아 해부를 수행하려면 4 개의 35 mm 조직 배양 접시를 준비하고 라벨을 붙이고 70 %의 4 밀리리터로 채웁니다.
E2 미디어 1. E2 미디어 2. 그리고 E2 미디어 3, 해부의 날에.
냉장고에 요리를 보관하십시오. 제브라피시 배아는 수정 후 34시간 인큐베이터에서 라미닌으로 코팅된 배양 요리를 섭취하십시오. 그리고 1X PBS의 0.5 밀리리터로 커버 슬립을 세 번 씻으시다.
마지막 세척 후 각 문화 요리에 ZFCM+미디어 4밀리리터를 추가합니다. 접시를 말리지 마십시오. 준비된 냉장 문화 요리를 회수하고 실온에 평형하게 해보세요.
ZFCM+미디어의 15마이크로리터로 4~6개의 PCR 튜브를 채웁니다. 인큐베이터에서 제브라피시 배아를 회수하고 배아를 살균하기 위해 5-10초 동안 70%에탄올을 함유한 35mm 조직 배양 접시에 배아를 담급합니다. 파이펫의 전송을 사용하여, 여분의 에탄올을 씻어 멸균 E2 미디어를 포함하는 E2 미디어 하나의 접시에 배아를 전송.
그런 다음 배아를 E2 미디어 2 접시로 옮기고 날카로운 집게로 축을 제거합니다. 마지막으로, 배아를 E2 미디어로 옮기면 3개의 접시를 사용하여 해부를 수행합니다. 한 쌍의 미세 한 포셉을 사용하여 포셉 중 하나를 사용하여 노른자에 배아를 앞쪽으로 배치하고 보유합니다.
그리고 다른 집게와 노른자 낭에 꼬리 후방을 제거합니다. 집게로 목을 잡고 머리를 떼어 뇌와 눈을 E2 미디어에 노출시하십시오. 미세 한 집게의 끝으로, 두 번째 집게와 함께 두개골 조직을 아래로 잡고 있는 동안 머리에서 눈을 부드럽게 굴려.
ZFCM+를 포함하는 이전에 준비된 튜브 중 하나에 4개의 눈을 옮기는 것은 세포를 해리하기 위하여 p20 파이펫으로 위아래로 부드럽게 세트리트합니다. 분리된 셀을 커버립의 중심으로 ZFCM+를 전송합니다. 진동을 흡수하기 위해 폴리스티렌 폼 랙에서 22도의 벤치 탑에서 배양을 유지합니다.
이미징 의 날에, RGC 축축의 성장을 검증하기 위해 현미경의 밑에 세포를 확인하십시오. 라이브 셀 이미징의 경우, 배양 접시에서 라이브 세포 이미징 챔버로 커버립을 전송합니다. DIC 목표 OG-590 롱패스 레드 필터와 EMCCD 카메라를 장착한 반전 현미경을 사용하십시오.
이미징 하기 전에 ZFCM+배지를 ZFCM-After를 10X 목표로 셀을 포지셔닝한 후 오일 침지 목표를 사용하여 60X 배율로 이미지를 획득합니다. 추가 1.5배 배율을 사용합니다. 먼저 DIC 이미지를 획득합니다.
이어서, 적절한 필터 세트를 사용하여 이미지 roGFP2-Orp1. 이미지의 첫 번째 세트를 촬영 한 후, 다른 치료 솔루션을 포함하는 미디어와 미디어를 교환. pH 및 진동 변화를 피하기 위해 30분마다 미디어를 변경해야 합니다.
생체 내 이미징의 경우, E3 미디어에서 22-24시간 후 수정 배아를 보관하여 메틸렌 블루없이 0.003%phenyl thiourea를 함유합니다. 미디어를 교환하고 매일 죽은 배아를 제거합니다. 원하는 나이에 35mm 유리 바닥 배양 접시에 1%아가로즈에 태아를 마취하고 장착합니다.
배아는 화상 진찰을 위한 관심의 지역에 따라서, 등등, 환기, 또는 측면에 지향될 수 있습니다. 아가로즈가 고화된 후, 메틸렌 블루없이 E3 미디어로 요리를 채우지 만 0.016 % 트리카인으로 채웁니다. 이미징을 위한 현미경을 설정합니다.
반전 된 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 아가로즈 드롭의 바닥에 장착 된 배아를 이미지하십시오. roGFP2-Orp1을 흥분시키고 원하는 방출 필터로 해당 이미지를 수집합니다. 배아의 원하는 부분을 통해 5 마이크로 미터 단면 두께로 z 스택을 획득하십시오.
이미징 후, 미세 한 포셉아가있는 아가로즈에서 배아를 제거하고 원하는 나이까지 페닐 티우레아와 인큐베이터와 메틸렌 블루 무료 미디어에 보관하십시오. 과산화수소 바이오센서 및 배양 된 제브라피시 RGC 확장 축축의 대표적인 이미지가 여기에 나와 있다. 세포 몸, 축 사, 그리고 성장 콘은 명확 하 게 개별 뉴런에서 볼 수 있습니다.
배양 매체에 과산화수소를 첨가하면 비율 값이 증가하여 이 시스템을 통해 실시간 변화를 감지할 수 있음을 보여준다. 과산화수소 수준의 정량화는 패널에 표시되어 B.To 전체 제브라피시 배아에서 과산화수소 수준을 결정하고, mRNA는 한 세포 단계에서 주입되어 모든 조직이 roGFP2-Orp1 바이오 센서를 발현하게 합니다. 제브라피시 애벌레의 머리 부위는 망막의 과산화수소 수준에 초점을 맞추고 두 개의 서로 다른 시점에서 표시됩니다.
제브라피시 배아의 과산화수소의 기저 수준을 2일 후 수정 및 5일 후 수정시 측정했다. 2일 후 수정시, 비비율값은 수정 후 5일보다 현저히 낮았다. 또한, 각 동물은 망막 과산화수소 함량이 다른 수준을 보였다.
눈을 제거하기위한 미세 한 집게를 사용하고 파이펫으로 눈의 부드러운 해리는이 절차에서 가장 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 ROS 신호에 관련되게 관련되는 요인을 조사하기 위하여 약 처리에 선행될 수 있습니다.
