Name: utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis
Uploaded: 2016-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis at JoVE.com

RO1 - GM108970 (SLG)와 F31-NS087837 (CW) :이 작품은 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

연구 윤리의 진술 : 여기에 설명 된 동물을 포함한 모든 실험은 규칙과 동물 관리에 UNC위원회의 규정과 관리 및 실험 동물의 사용을위한 NIH 기준이 적용됩니다. 1. 준비 및 해리 두피 뉴런의 도금 <ol><li> CO에 의해 자궁 경부 전위 다음 2 흡입을 초과 임신 여성을 안락사. 각 반구에서 배아 일 15.5 (E15.5) 마우스 및 microdissect 피질의 두개골에서 전체 뇌를 제거합니다. Viesselmann 등의 알 (8)를 참조하십시오 배아 마우스 피질의 미세 절제에 관한 자세한 지침. </li><li> 멸균 1.6 ml의 마이크로 튜브에 해부 미디어 1 ㎖에는 4 개 이상의 피질을 배치합니다. 10 배 트립신의 120 μl를 추가하고 관 3 반전 - 혼합 5 회. </li><li> 혈구를 사용하여, 세포는 세포 배양 접시를 시드 계산합니다. 주 : 1 피질 반구가 제공하는 approximately 삼백만 세포. <ol><li> SDS 방지 SNARE 복잡한 생화학 분석의 경우, 35mm 접시 당 육백만 세포를 판과 상태에 따라 두 가지 요리를 이용한다. 주 :이 여러 조건을 비교하면 6 웰 플레이트를 사용함으로써 단순화된다. </li><li> 분지 분석 들어 질산 접시 뉴런 150,000의 밀도로 축삭 분지 판 DIC 이미징, 35mm 접시 당 250,000 세포의 밀도로 순환 된 커버 세척 하였다. 이 밀도는 인구 과잉을 방지하고 분석을 단순화합니다. </li></ol></li><li> 라이브 셀 TIRF 현미경의 경우, 실온에서 nucleofection 솔루션에 형질 전환 당 이백 만 신경을 재현 탁. <ol><li> 제조 업체 프로토콜 (9)에 따라 nucleofector와 VAMP2 - pHlourin 발현 플라스미드 및 electroporate 10 μg의 포함 된 마이크로 튜브에 세포 현탁액 100 μl를 추가합니다. </li><li> 형질 즉시 트립신 담금질 매체의 500 μl를 추가 한 후, 서재에서 큐벳 및 플레이트 세포 현탁액을 제거35mm PDL 코팅 유리 바닥 접시 당 400,000 세포의 SITY. </li></ol></li><li> 플레이트 혈청이없는 배지 2 ㎖의 모든 대뇌 피질의 뉴런. </li></ol> 2. SNARE 복합체 형성의 분석 참고 : SDS 방지 SNARE 복합체 처리 원래 아래에 자세히 설명 수정과 (10)를 기술 된 바와 같이 분석 하였다. 여기에 사용 된 것과 검증 된 대안 항체를 들어, 자료 섹션을 참조하십시오. <ol><li> 이전의 용해에 1 시간 동안 250 NG / ㎖ netrin-1 또는 가짜 제어 시험 관내 (DIV)에 E15.5 대뇌 피질의 뉴런 2 일 자극한다. </li><li> 처리 샘플, 37 ° C 4 ° C로 냉각 원심 분리기 및 설정 수조 온도 100 ° C의 열 블록에 이전. </li><li> 인큐베이터에서 세포 요리를 제거하고 얼음에 배치합니다. <ol><li> 세척 당 2 분 - 세포에서 대기음 매체는 2 ~와 ml의 얼음 추위 인산염 완충 식염수 (PBS) 1 부드럽게 2 번 교체합니다. </li><li> 이 분석을 위해, 콘드 당이 우물을 사용ition. </li><li> 조건의 첫 번째 우물에서 대기음 PBS와 250 μl의 균질화 버퍼로 교체합니다. 얼음에 세포를 균질화, 5 분간 얼음에두고, 다음 셀 리프터를 사용. </li><li> 동일한 조건의 다음 잘에서 PBS를 기음과 우물에 최근 균질 혼합물을 추가합니다. 이 단백질의 농도를 증가시킬 것이다. 모든 조건에 대해 반복합니다. </li><li> 완료되면, 피펫 얼음에 미리 냉각 된 1.6 ml의 마이크로 튜브에 균질 액을 1 % 트리톤-100의 최종 농도에 도달하기 위해 20 % 트리톤-100을 추가한다. 거품을 최소화하면서 1000 μL 피펫으로 10 시간 혼합 씹다. </li></ol></li><li> 2 분 단백질을 가용화하는 얼음 튜브 부화. 4 ° C에서 6010 RCF에서 10 분 동안 배양, 원심 분리기에 이어 비 가용성 물질을 펠렛합니다. 얼음에 새로운 냉장 1.6 ML 튜브에 해물 뜨는 이동합니다. </li><li> 브래드 포드 분석 (11)를 사용하여 단백질 농도 분석을 수행하고 FINA에 샘플을 희석B-Mercaptethanol (BME)으로 보충 된 1 % 트리톤 -100 5 배 샘플 버퍼가 보충 균질화 완충액 남은가 5mg / ml - 3 L의 단백질 농도. </li><li> 이 튜브에 균등하게 각 실험 샘플을 나눈다. 30 분 (SNARE 복합체), 30 분 (SNARE 단량체) 100 ° C에서 다른 37 ° C에서 하나의 샘플을 인큐베이션. 용액의 샘플을 유지하기 위해 간헐적 튜브 전환. </li><li> SDS-PAGE로 분리 할 준비가 될 때까지 -20 ℃에서 동결 된 샘플. 100 ° C에서 5 분 동안 끓인 이전 샘플 재비 표준 기술을 사용하여 전기 영동을 통해 샘플을 실행하지만, RT에서 37 ° C 샘플을 해동 종래. </li><li> 샘플의 실행 중복 (30 - 샘플 당 단백질 40 μg의) 8 %와 15 % 겔 모두; 15 %의 SNARE 단백질 단량체 (SNAP-25 ~ 25kDa, VAMP2 ~ 18kDa, 신택-1 ~ 35kDa)을 정량화하는 데 사용되는 반면, 8 %는 단지의 이상적인 분리를 제공합니다. 염료 라인이 STAC 통해까지 70 V에서 전원을 유지90V에 왕 젤 증가 전압. 염료 전원이 소모 될 때까지 젤을 실행합니다. </li><li> 단량체을 유지하려면 45 분 70 V에서 20 % 메탄올 (메탄올)을 첨가하여 차가운 전송 버퍼를 사용하여 얼음에 0.2 μm의 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 전송합니다. </li><li> O 2 시간 동안 덮여 접시에 건조 막 / RT에서 N (O / N이 최상의 결과를 제공한다). </li><li> 블록은 RT에서 1 시간 동안 10 %의 소 혈청 알부민 (BSA)의 복합 막을 스네어. </li><li> 회전 진탕 기에서 4 ° C에서 1,000 프로브 O / N : 1의 희석 (특정 SNARE 복합체 구성 요소 인식) 일차 항체를 준비합니다. <ol><li> 트리스 완충 식염수 플러스 0.1 % 트윈 20 (TBS-T) 5 분마다 3 번에 말을 씻어. </li></ol></li><li> 1의 희석에 형광 차 항체 솔루션을 준비 : 20,000 1 %의 TBS-T에서 BSA와 프로브를 RT로 덮여 1 시간에 대해. 1 시간 후 단계를 반복 2.12.1. </li><li> 형광 스캐닝 시스템의 이미지도 말은 소프트웨어 스위트를 장착하고 SNARE 단백질의 공동 모두 정량화직사각형의 ROI를 그리기위한 제조업체의 지침을 사용하여 (각각 25 kDa의 18 kDa의, SNAP-25, VAMP2 35 kDa의에서 면역 밴드와 신택-1) mplex (40kDa 위의 면역 밴드)와 단량체 밴드. </li></ol> TIRF 현미경을 통해 3 이미징 Exocytic 이벤트 이 프로토콜은 온도, 습도, CO (2), epifluorescent 조명하는 고배율 / 높은 개구 수 (NA) TIRF 목적 자동화 된 XYZ 스테이지를 구비 한 반전 TIRF 현미경을 유지하는 환경 챔버를 포함 특수 현미경 장비를 필요로하고, 참고 민감한 전하 결합 소자 (CCD) 검출기. 이 프로토콜은 100 배 1.49NA TIRF 목표 고체 491 nm의 레이저 및 전자 배가 CCD (EM-CCD)를 장착 한 완전 자동화 된 거꾸로 현미경을 사용합니다. 모든 장비는 이미징과 레이저 제어 소프트웨어에 의해 제어된다. envir 이전에 처음으로 촬상 프로토콜 전력onmental 실, 무대, 조명, 컴퓨터, 카메라. <ol><li> 이미징 소프트웨어 내에서 선택의 목적. 대물가 제자리에 있으면, 칼라 주위 대물 히터를 고정. </li><li> 그 목적은 단 슬롯에 무대 인큐베이터을 확보하기 전에 완전히 내려 확인합니다. 유출을 방지하기 위해 균등 단계 인큐베이터 입구에 증류수를 붓는다. </li><li> 배양 시스템을 켭니다. 이산화탄소 탱크 밸브를 열어 압력이 제조업체의 지침에 따라 시스템에 적합한 확인합니다. 실을 5 % CO 2, 37 °의 C에 도달하는 시간을 허용합니다. 촬상 접시를 첨가하기 전에, 대물 물 응축을 피하기 위해 인큐베이터에서 빈 접시를 배치했다. </li><li> 레이저 소스의 전원을 켭니다. </li><li> 오픈 스테이지 인큐베이터와 렌즈에 침지 기름을 추가 할 수 있습니다. 인큐베이터에서 샘플을 놓고 안정성 무기 또는 접시의 무게와 안정. 오일 샘플의 바닥에 닿을 때까지 대물을 올린다. Switc투과광 조명에 시간과 접안를 통해 신경 세포의 초점면을 찾을 수 있습니다. </li><li> 레이저 소프트웨어를 시작하고 레이저 제어 소프트웨어에 연결합니다. 위드와 목적이 사용되는 선택 조명을 설정 (100X 1.49 NA TIRF 권장). 샘플의 설정 굴절률 (셀 ~ 1.38). 491 nm의 레이저에 대해 &quot;TTL&quot;를 취소하여 레이저 강도를 조정합니다. 40 % - 다음 20 사이의 값으로 다시 아래로 가져 (100) 슬라이더를 조정합니다. &quot;TTL&quot;을 다시 확인. </li><li> 투과광 조명에 다시 샘플에 초점을 맞 춥니 다. 이미징 소프트웨어로 이동하여 491 nm의 레이저 조명 및 오픈 셔터를 선택합니다. 미세 천장에 레이저의 초점을 조절하고 제거 응축기와 닫힌 필드 다이어프램의 중앙 지점을 중심. 그래서하지 스크래치 렌즈에 거꾸로 광학 벤치에 콘덴서를 배치합니다. </li><li> 콘덴서를 교체하고 110 nm의 TIRF 소프트웨어 및 설정 침투 깊이 (PD)로 이동합니다. TIRF의 ILLUM에 위드 조명에서 전환이미징을위한 ination 모드. </li><li> epifluorescent 광원으로 위드 표면 형광을 사용하여 접안을 통해 발현 세포 VAMP2-phluorin를 찾을 수 있습니다. <ol><li> 촬상 파라미터 (노출 시간, 게인 및 레이저 파워) (예 photobleaching에 및 광독성 줄이는 최소 노출 시간 및 레이저의 강도를 사용하여 노이즈 비율과 동적 범위의 신호를 최대화하도록 조정 : 50 ~ 노광 - 100 밀리 초, 15로 - 30 30 % 최대 레이저 파워)에서 얻을 수 있습니다. </li><li> 셀 당 설정 연속 자동 초점. 인수는 5 분 동안 매 0.5 초마다 발생으로 설정 timelapse에 이미지를 획득. netrin 1 자극 조건, 층류 후드에서 세포의 접시-1 NG netrin 500 / ㎖를 추가로 촬상 전에 1 시간 동안 인큐베이터에 접시를 반환한다. </li></ol></li><li> , ImageJ에 오픈 이미지 스택&gt; 열기&gt; 파일 이름 (그림 창에 파일을 드래그하거나 파일로 이동하여 셀 영역 및 시간 당 정상화 exocytic 이벤트의 빈도를 정량화하기0; 2A 인셋 1). <ol><li> 평균 강도 : 소포 융합 이벤트를 나타내지 않는 안정된 형광 신호를 제거하려면 이미지&gt; 스택&gt; Z-프로젝트&gt; 프로젝션 유형을 사용하여 전체 스택의 평균 Z 투영을 만듭니다. &gt; 프로세스를 사용하여 timelapse에&gt; 이미지 계산기 각 이미지에서 이미지 1을이 평균 이미지를 빼기 : 스택 작업 : 이미지 2를 새롭게 생성 된 평균 Z 투영을 뺍니다. 이 exocytic 이벤트 (- 3 그림 2A 삽입 된 2)를 강조한다. </li><li> 눈으로 exocytic 융합 이벤트를 계산합니다. Exocytic 이벤트 급속 VAMP2-phluorin 플라즈마 막 (도 2A 인셋 6) 내에 확산으로 확산 회절 제한된 형광 신호의 모양으로서 정의된다. </li><li> &gt; 이미지를 사용하여 첫 번째 이미지를 강조 조정&gt; 임계 값&gt; 전체 셀이 임계 값 (- 8 그림 2A 삽입 된 7)를 강조 표시 될 때까지 슬라이더를 조정 임계 값 명령을 사용하십시오. </li><li> 아나에서lyze, SetMeasurements을 선택하고 영역 표시 라벨을 확인합니다. (- 8 그림 2A 삽입 된 7)을 측정하기 위해 지팡이 추적 도구를 눌러 &#39;m&#39;을 사용하여 역치 휴대 영역을 선택합니다. </li><li> 모두 exocytic 융합 이벤트 카운트 환승, 스프레드 시트 셀 면적을 측정하고, 경과 촬상 시간 exocytic 이벤트 / 2 mm / 시간의 수 (도 2A 인셋 9)를 산출한다. </li></ol></li></ol> 4. 미분 간섭 대비 (DIC) 축삭 분기의 Timelapse입니다 현미경 참고 : DIC 이미징에 대한 일반적인 접근 방식에 대한 전체 프로토콜 및 데모 (12)을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 DIC를 이용하지만, 다른 투과광 현미경 법 (예 : 위상차)를 동일한 목적으로 사용될 수있다. <ol><li> 2 DIV에서, 사전 예열 환경 챔버에 형질 감염되지 않은 신경 세포를 포함하는 장소의 유리 바닥 이미징 요리는 습기 ENV를 유지하기 위해5 % CO 2, 37 ° C로 ironment. 최고의 이미지 품질과 해상도를 A A 60X 계획 - 고차 색지움 장착 현미경, 1.4 NA DIC 대물 렌즈와 높은 NA 콘덴서를 사용한다. </li><li> 투과광 조명을 사용하여 접안을 통해 신경 세포를 찾기 위해 초점면을 조정합니다. </li><li> 이미징 소프트웨어의 다중 영역 취득 기능을 이용하여 검색 및 적어도 106 세포의 XYZ 위치를 저장한다. 무대를 위치 있도록 최상의 결과를 위해 시야 내에서이자 맞는 뉴런. <ol><li> 250 NG로 자극 / ㎖ netrin-1를 눌러 &#39;다중 영역 획득을 시작&#39;. 순차적으로 필요에 따라 수집 및 재 초점을 일시 중지, 24 시간 동안 각각의 위치에서 매 20 초 영상을 획득. </li></ol></li><li> 다중 차원 데이터&gt; 열린 파일 이름을 검토&gt; 앱을 사용하여 이미징 소프트웨어에서 이미지를 검토합니다. 안정적인 축삭 분기 (20 μm의 길이) 이미징 세션 동안 그 형태를 확인합니다. stableaxon의 branc을 측정하기 위해 선 그리기 도구를 사용하여끝으로 축삭의 기지에서 시간은 20 μm의 길이 자격이 충족되어 있는지 확인합니다. <ol><li> 막 돌기 초기 지점의 길이가 20 ㎛의 지점에 도달하면 이후뿐만 아니라 netrin 자극 후의 프레임 번호 형성 영역에서 시작할 때 스프레드 시트, netrin 자극 후에 프레임 번호를 기록한다. </li><li> 브랜치마다의 형성 시간을 계산하기 위해 20 초만큼 돌출 형성 분기 간의 프레임 수를 곱한다. </li></ol></li></ol> 5. 독소 노는 및 고정 세포 면역 형광 <ol><li> 2 DIV에서 250 NG와 실험 조건에서 신경 세포를 치료 / ㎖-netrin 1 및 / 또는 10 nM의 보툴리눔 효과적으로 / ㎖ netrin- ng를 SNARE 매개 세포 외 유출 (13), 플러스 (250)을 억제 절단 스네어 단백질 SNAP25 및 독소 (BoNTA) 1. 제어 조건으로 처리되지 않은 뉴런의 한 세트를 남겨주세요. 주의 : 준비하고 사용하는 경우 BoNTA는 눈과 호흡기 보호의 사용을 필요로솔루션을 제공합니다. 가능한 한 빨리 생물학적 물질 및 오토 클레이브 등 모든 오염 물질을 유지한다. </li><li> 3 DIV (24 시간 후 처리) 흡인 미디어, 즉시 PHEM 수정 (자세한 내용은 표 1 참조) 중 적어도 1 ml의 교체에서 37 ° C로 예열. 실온에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. </li><li> (4 ° C에서 파​​라 필름 및 저장과 향후 사용 인감을위한) PBS로 3 배를 씻어. </li><li> 장소 어두운, 가습 염색 실 커버 슬립과 (10 % 트리톤-100 재고에서 만든) PBS에서 갓 희석 0.2 % 트리톤-100에서 10 분 동안 세포막을 Permeabilize 하시려면. </li><li> permeabilization 솔루션을 제거하고 PBS와 1X의 50 μl를 씻어. 30 분 동안 블록 ~ PBS (BSA-PBS)에 10 % 소 혈청 알부민의 50 μl의 10 %가 RT에서 PBS에 당나귀 혈청 삶은. </li><li> 다시 1X PBS로 씻어. 실온에서 1 시간 동안 1 % BSA-PBS에서 : (신경 세포의 신원을 확인하기 위해 1000 βIII의 tubulin의 1) 차 항체의 50 μL에 커버 슬립을 품어, 어두운 데에서. </li><li> PBS로 3 배 5 분 세척을 수행합니다. 튜 불린 (1 : 400)에 대한 스펙트럼-별개의 이차 항체의 50 μL에 커버 슬립을 품어, 형광 팔로이 딘 (여기에 따라 다릅니다 : 100 일에서 488 팔로이 딘 : 400, 647 팔로이 딘 1에서) 1 시간 동안 1 % BSA-PBS에서 . </li><li> 1X PBS로 3 배 5 분 세척하고 설치 미디어의 슬라이드 위에 커버 슬립을 탑재합니다. </li><li> 명확한 매니큐어로 커버 슬립과 씰의 가장자리에서 진공 초과 장착 매체. </li><li> 40 배 1.4NA의 목적, epifluorescent 기능과 EM-CCD와 거꾸로 현미경에 위드 표면 형광 이미지를 수집합니다. <ol><li> 수동 ImageJ에를 사용하여 분기 분석 할 수 있습니다. 창에 파일을 드래그하거나&gt; 열기&gt; 파일 이름 (그림 4A 인세 1에게) 파일로 이동하여 ImageJ에있는 이미지 열기 스택. </li><li> 라인&gt; 분할 줄을 사용하여, 소마 (- 3도 4a 인세 2)에서 연장이 가장 긴 신경 돌기로 정의 축삭을 추적. </li><li>분석&gt; 도구&gt; 투자 수익 (ROI) 관리자를 사용하여 관심 영역으로 추적 축삭을 저장합니다. 추적 및 길이에 신경 돌기 ≥20 μm의 정의 각 축삭 지점을 저장합니다. 분석 (- 4도 4a의 삽입 3)에서 (직접 축삭에서 돋의 outgrowths) 만 주요 지점을 포함합니다. </li><li> 를 눌러 &#39;m&#39;은 관심의 저장 영역을 측정하고 μm의 길이를 계산하기 위해 스프레드 시트로 픽셀 단위로 길이를 전송합니다. </li><li> 100 μm의 길이 엑손 당 분기 수를 얻기 위하여 100 μm의 분할에서 엑손의 길이만큼 길이가 ≥20 ㎛의 축삭 분기 수를 나눈다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Axon branching is a fundamental neurodevelopmental process and underpins the vast neuroconnectivity of the mammalian nervous system. Understanding the mechanisms involved in localized plasma membrane expansion is integral to our understanding of both normal and pathological neurodevelopment. The use of a multipronged approach incorporating both population level and single cell level methodologies enhances reproducibility and increases spatial and temporal resolution without compromising population level analysis. At the single cell level, utilizing both fixed and live cell approaches to examine netrin-dependent axon branching provides a three-fold benefit: the ability to collect a large sample size across multiple experiments, temporal resolution with DIC imaging, and spatiotemporal resolution of exocytic fusion using TIRF microscopy. 
The SDS-resistant SNARE complex assay allows a measurement of SNARE activity that accounts for the heterogeneity of cortical neurons in culture. SNARE complexes are extremely stable; whereas most other protein complexes are dissociated by the addition of SDS. SNARE complexes are SDS resistant, though not temperature resistant. This property makes quantifying the amount of both the SNARE complex and SNARE monomers possible. Due to the necessity of running multiple SDS-PAGE gels at varying acrylamide percentages, seeding cells at a density no less than 6 million per well in order to acquire sufficient amounts of protein is important. As this assay requires common laboratory reagents, the ability to perform western blots and the antibodies for endogenous SNARE proteins, this is a relatively cost effective and simple method for producing quantifiable data on exocytic SNARE complex formation. Although omitted from this protocol, this method may be used in conjunction with a variety of pharmacological manipulations and multiple cell types. The main limitation to this method is the necessity for a relatively high number of cells. Those working in model systems where cell number and thus protein is limiting should take this into consideration.
TIRF microscopy-based imaging of exocytic events in single neurons allows the visualization of individual exocytic fusion events of VAMP2-pHluorin producing quantifiable data that can be categorized spatially or temporally. For example, exocytic events can be compared throughout the entire neuron or to specific cellular locations such as the soma, the axon or other neurites. Furthermore the frequency of fusion for single exocytic events at various cellular locations can be calculated from frame rate. This imaging protocol may be performed on any commercially available inverted TIRF system equipped with a stage incubator, an appropriate laser source, and an EMCCD camera, although adjustments to laser power and exposure time are necessary on a per cell basis. This protocol can be used in conjunction with any cell type that is suitable for transfection, although dividing cell lines must be seeded appropriately to allow for the isolation of single cells for imaging. Careful consideration of post processing for images is recommended, as the high level of background noise in live cells can make identifying fusion events difficult. Utilizing the z-projection function in ImageJ, we created average z projections of image stacks then subtracted the resulting image from the original stack. This process significantly decreased background, increasing the signal-to ratio, and simplifying identification of fusion events. 
Time lapse DIC imaging is a simple and effective method for long-term spatiotemporal examination of neuronal morphogenesis in vitro. As transmitted light illumination has little negative impact on neurons, this approach can, in theory, be utilized for long timecourses on the order of days. Utilizing the multi area acquisition function increases the number of cells that can be simultaneously imaged, but this number will be constrained by the chosen frame rate and the distance between regions of interest. Thus, balancing the desired number of cells and required frame rate for the phenomena of interest to optimize the experimental throughput is necessary. 
In both live cell imaging protocols, the use of a stage incubator, which maintains CO2, humidity and temperature, allows for acute stimulation or pharmacological manipulation in real time though we did not take advantage of this possibility. Thus the live cell imaging approaches outlined here allow an effective means by which the spatial and temporal aspects of netrin dependent axon branching, and other cellular phenomena can be examined in real time.
Our SNARE complex biochemistry assays and live cell imaging produced quantifiable measures of population level and single cell level changes. Fixed cell immunocytochemistry, coupled with pharmacological manipulations of exocytic activity allowed us to both retrieve temporal information about axon branching and connect branching to the requirement of exocytosis. Dependent on which pharmacological manipulation is desired, it may be necessary to perform a concentration assay, to identify the most effective but least cytotoxic dose possible for cells of interest. These assays require relatively few cells and only three DIV, making them both cost and time effective.
Together, the assays outlined above are powerful tools in elucidating the roles of specific proteins in exocytic fusion and axon branching. Using this approach coupled with a genetic knockout model of the E3 ubiquitin ligase TRIM9, we showed that TRIM9 acts as a regulator of exocytosis through an interaction with SNAP25, and thus constrains axon branching7. In sum, our multi-pronged strategy to examine membrane addition during axon branching is likely to be instrumental in dissecting detailed molecular and cellular mechanisms governing plasma membrane expansion necessary to neuronal development and cell shape change.

Recent estimates suggest that the human brain contains 1011 neurons with 1014 synaptic connections1, highlighting the importance of axon branching in vivo. Extracellular axon guidance cues such as netrin-1 guide axons to appropriate synaptic partners and stimulate axonal branching, thereby increasing synaptic capacity2-5. Netrin-1-dependent axonal arborization involves substantial plasma membrane expansion6, which we hypothesized requires delivery of additional membrane components via SNARE complex dependent exocytic vesicle fusion7. 
Investigating the role of SNARE-mediated exocytosis in netrin-1 dependent axon branching is complicated by several factors. First, the heterogeneity of cortical neurons increases the sample size required to identify significant effects, complicating single cell techniques like imaging. Second, although biochemical techniques permit observation of changes that occur at the population level, they lack the temporal and spatial resolution necessary to localize plasma membrane expansion to the axon in the time frame of axon branching. Lastly, although axon branches form over hours, the cellular changes that contribute to axonal extension may begin within minutes and occur on the order of seconds, thus extending the temporal scope for experimental consideration. 
We outline a multi-technique approach that addresses these diverse temporal and spatial scales of exocytosis and axon branching, and thus enhances our understanding of the fundamental cellular mechanisms. Utilizing these approaches provides evidence that supports a critical role for SNARE-mediated exocytosis in axon branching.

<table><tbody><tr><td>6-well tissue culture treated plates</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>glass coverslips</td><td>Fisher scientific</td><td>12-545-81</td><td>12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells.</td></tr><tr><td>Amaxa nucleofection solution</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td>100 ml/transfection</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector/electroporator</td><td>Lonza</td><td></td><td>program O-005</td></tr><tr><td>35 mm Glass bottom live cell imaging dishes</td><td>Matek Corporation</td><td>p356-1.5-14-C</td><td>must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells</td></tr><tr><td>Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda LS xenon lamp</td><td>Sutter Instruments Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Environmental Stage top incubator</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x 1.49 NA TIRF objective</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon EM-CCD</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Licor Infrared Imaging System</td><td>LI-COR</td><td>Odyssey CL-X</td><td>Used for scanning blots</td></tr><tr><td>Image studio software suite</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots</td></tr><tr><td>Metamorph for Olympus</td><td>Molecular devices, LLC</td><td>version 7.7.6.0</td><td>Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse</td></tr><tr><td>CELL TIRF control software</td><td>Olympus</td><td></td><td>Software used to control lasers for TIRF imaging</td></tr><tr><td>Fiji (Image J)</td><td>NIH</td><td>ImageJ Version 1.49t</td><td></td></tr><tr><td>60x Plan Apochromat 1.4 NA objective</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40x 1.4 NA Plan Apochromat objective</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal media</td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td>Base solution for both serum free and trypsin quenching media</td></tr><tr><td>Supplement B27</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td>500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td></td><td>35050-061</td><td>1 ml/50 ml Serum free media</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Bio Basic Incorporated</td><td>9048-46-8</td><td>10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes.</td></tr><tr><td>10x&amp;nbsp; trypsin</td><td>Sigma</td><td>59427C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CELLGRO</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-cm</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher scientific</td><td>CAS67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS base</td><td>Fisher scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>N-Propyl Gallate</td><td>MP Biomedicals</td><td>102747</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol Photometric grade</td><td>Acros Organics</td><td>18469-5000</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol (non optics grade)</td><td>Fisher scientific</td><td>CAS56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>B-mercaptoethonal</td><td>Fisher scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Distilled Water&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>152340-147</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>p-7886</td><td>Dissolved in sterile water at 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Botulinum A toxin BoNTA</td><td>List Biological Laboratories</td><td>128-A</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti human VAMP2</td><td>Cell signaling</td><td>11829</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-12736</td><td></td></tr><tr><td>Goat polyclonal anti human SNAP-25</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7538</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti human &amp;beta;III-tubulin&amp;nbsp;</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LI-COR IR-dye secondary antibodies</td><td>LI-COR</td><td>P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022</td><td>800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat</td></tr><tr><td>0.2 &amp;#956;m pore size nitrocellulose membrane</td><td>Biorad</td><td>9004-70-0</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher scientific</td><td>S25426A</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol Blue</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher scientific</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher scientific</td><td>O-4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher scientific</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>40% Bis-Acrylimide</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1408-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Alternative Validated Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0664</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2)</td><td>Synaptic Systems</td><td>104-211</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Monoclonal SNAP25</td><td>Synaptic Systems</td><td>111-011</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

시험관 내 생화학 적 기법을 활용하는 것은. 뉴런의 인구 SDS 방지 SNARE 복합체의 양을 분석 그림 1 SNAP-25, syntaxin1A 및 VAMP2에 대한 프로브 SDS 방지 SNARE 복잡한 분석의 결과 웨스턴 블롯 다음 완료를 보여줍니다. 기저 세포막에서 TIRF 현미경 단셀의 개체 exocytic 융합 이벤트의 높은 해상도 이미지를 제공한다.도 2a-VAMP2 phluorin 매개 exocytic 이벤트를 식별하기위한 이미지 분석 방법을 보여주고있다. 소포 융합이 발생 VAMP2-phluorin은 세포막 내에서 확산되고있다.도 2b는 대뇌 피질 신경 세포에서 (초)의 시간에 걸쳐 발생하는 exocytic 이벤트의 예를 도시하고, 상기 삽입 한 번의 exocytic 이벤트를 나타낸다. 확대 된 세트는 소마, 축삭 분기 및 spati을 나타내는 축삭의 성장 콘을 표시이 분석의 알 유틸리티입니다. 원은 TIRF 현미경을 통해 볼 수있는 단일 exocytic 융합 이벤트를 나타낸다. netrin의 timelapse에 DIC 영상은 축삭 분기는 축삭 지점 형성의 타이밍을 보여준다 자극. 3 netrin 자극 다음 실시간으로 축삭 지점의 형성을 보여줍니다. 화이트 화살촉은 분기 사이트에서 초기 돌출부를 나타낸다. 블랙 화살촉 가지 팁을 주 축삭에서 측정 적어도 20 ㎛의 완전히 형성, 안정적인 분기를 나타낸다. 축삭 분기에 Netrin 따라 증가 exocytic 융합 netrin 따라 증가에 따라 발생합니다. SNARE 활동의 약리 저해와 결합 고정 된 세포의 면역 세포는 SNARE 매개 세포 외 유출이 대뇌 피질의 축삭은 분기위한 필수임을 보여줍니다. 그림 4a는, 분기 트레이싱이 PERFO의 단계 프로세스에 의해 단계를 설명<html> 에 rmed ImageJ에.도 4b는 3DIV에서 대뇌 피질의 뉴런의 대표 이미지를 보여줍니다. 다음과 같은 조건은 다음과 같습니다 치료, 250 NG / ㎖ netrin 자극, 또는 BoNTA 24 시간 동안 250 NG / ㎖ netrin 처리 하였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53743/53743fig1.jpg" /> 체외에서 정량 지표 SNARE의 형성으로 SNARE 단지의 SDS 저항을 사용하여 그림 1. SNARE 복잡한 회원 VAMP2, Syntaxin1A과 SNAP-25 및 로딩 제어 BIII의 튜 불린에 대한 프로브 대표 웨스턴 블롯. 모두 복잡하고 식별 단량체의 단백질이 표시됩니다 올무. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53743/53743fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> PG &quot;/&gt; 그림 2. 라이브 셀 이미징 및 exocytic 소포 융합 이미지 분석의 단계 개요에 의해 두피 뉴런의 Exocytic 소포 퓨전 이벤트의 정량화. (A) 단계 수동 ImageJ에를 사용하여 수행되었다있다. 이 시간이 지남에 따라 발생하는 바와 같이 (B) 삽입 된 패널은 하나의 VAMP2-pHlourin 소포 융합의 이벤트를 나타낸다. 2DIV에 VAMP2 - pHlourin을 표현하는 전체 대뇌 피질의 신경 세포의 TIRF 현미경 이미지를 갖춘 두 번째 패널. 소마, 축삭 분기 및 축삭의 성장 원추 : 아래 그림과 같이 점선 박스는 관심의 영역을 나타낸다. 관심 지역과 원은 하나의 소포의 융합 이벤트를 나타낸다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53743/53743fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53743/53743fig3.jpg" /> 그림 3. 장기 라이브 셀 DIC 이미징 netrin 자극에 응답 축삭 분지의 형성을 도시하는 피질 뉴런 Netrin 1 분기 종속 축삭. DIC 생균 화상의 타이밍을 보여준다. 화이트 화살촉은 이전의 길이는 20 μm의에 도달하는 신경 돌기에 초기 돌출 점을 나타낸다. 블랙 화살촉은 진실한 가지 (길이 ≥20 μm의)를 나타낸다. 시간 시간으로 표시 :. 분 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53743/53743fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53743/53743fig4.jpg" /> 세포 외 유출의 독소 억제와 결합 그림 4. 고정 세포 면역 형광은 세포 외 유출을 위해 필요하다는 것을 알 수 Netrin-1 의존 축삭 분기. (A)는 netrin에서 분기 축삭의 정량화에 대한 추적 및 분석 단계의 개요가 3DIV에서 대뇌 피질의 신경 세포를 자극. (B) 각 실험 조건의 3DIV에서 대뇌 피질의 뉴런의 대표 이미지 : 치료, 250 NG / ML의 netrin, 또는 10 nM의 BoNTA 독소 플러스 250 NG / ㎖ netrin 치료를 자극. 녹색은 F-액틴 (팔로이 딘은), 빨간색 βIIItubulin입니다. 화살표가 축삭 가지의 길이 ≥20 μm의 포인트를 나타낸다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53743/53743fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 해결책 </td><td> 조리법 </td></tr><tr><td> 균질화 버퍼 </td><td> 10 mM의 HEPES-NaOH로 pH를 7.4,150 밀리미터의 NaCl, 1 mM의 EGTA. 세포의 종류에 따라 달라 플러스 필요한 프로테아제 및 포스 파타 아제 억제제 </td></tr><tr><td> 배 샘플 버퍼 </td><td> 60 mM 트리스 - HCl을 pH가 6.75, 5 % (V / V) FI 머 캅토 에탄올, 2 % (w / v)의 SDS, 10 % (w / v)의 글리세롤, 0.007 % (w /v)의 브로 모 페놀 블루 </td></tr><tr><td> PHEM 정착액 </td><td> 60 mM의 파이프 pH가 7.0 25mm의 HEPES pH를 7.0, 10 mM이의 EGTA의 pH 8.0, 2 mM의의 MgCl 2, 0.12 M 자당, 4 % PFA </td></tr><tr><td> 설치 미디어 </td><td> 20 mM 트리스 pH를 8.0, 0.5 % n- 프로필 갈 레이트, 90 % 고품질 글리세롤, MilliQ를 H 2 O </td></tr><tr><td> 버퍼를 실행 10X SDS </td><td> 트리스베이스의 30.0 g, 글리신 144.0 g, 및 H 2 O의 1,000 ml의 pH가 8.3 SDS의 10.0 g을 녹여. 1 배 희석. </td></tr><tr><td> 10X 전송 버퍼 </td><td> 250 mM의 30.3 g의 트리스 1 LH 2 O에서 1.92 M 솔루션 144.1 g의 글리신을 용해; (1 L에 대한 1X 버퍼 200 ML의 메탄올 700 ml의 차가운 DI의 H 2 O를 100ml의 10 배 솔루션을 추가) </td></tr><tr><td> 혈청 무료 미디어 (SFM) </td><td> 50 ㎖ : 0.5 ml의 L 글루타민, 1 ML의 B27, 48.5 ml의로 Neurobasal 미디어 </td></tr><tr><td> 트립신 담금질 미디어 (TQM) </td><td> 50 ㎖ : 0.5 ml의 L 글루타민, 2.5 ML의 FBS, 47 ml의 NeurobASAL 미디어 </td></tr><tr><td> TRIS 완충 식염수 </td><td> 50 mM 트리스 - CL, 산도 7.5, 1 LH 2 O 150 mM의 NaCl을; (TBS-T의 경우 1 ㎖의 트윈 20을 추가) </td></tr></tbody></table> 표 1. 솔루션

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Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

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Universidad San Sebastian

Research

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Neuroscience

6.1K 조회수.  The University of North Carolina at Chapel Hill. Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change. 

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Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

연구

신경과학

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are located in the dorsal spinal cord and send their axons along stereotyped trajectories. Commissural axons initially project ventrally towards and then across the floorplate. After crossing the midline, these axons make a sharp rostral turn and project longitudinally towards the brain. Each of these steps is regulated by the coordinated activities of attractive and repulsive guidance cues. The correct interpretation of these cues is crucial to the guidance of axons along their demarcated pathway. Thus, the physiological contribution of a particular molecule to commissural axon guidance is ideally investigated in the context of the living embryo. Accordingly, gene knockdown in vivo must be precisely controlled in order to carefully distinguish axon guidance activities of genes that may play multiple roles during development.
Here, we describe a method to knockdown gene expression in the chicken neural tube in a cell type-specific, traceable manner. We use novel plasmid vectors3 harboring cell type-specific promoters/enhancers that drive the expression of a fluorescent protein marker, followed directly by a miR30-RNAi transcript4 (located within the 3'-UTR of the cDNA encoding the fluorescent protein) (Figure 1). When electroporated into the developing neural tube, these vectors elicit efficient downregulation of gene expression and express bright fluorescent marker proteins to enable direct tracing of the cells experiencing knockdown3. Mixing different RNAi vectors prior to electroporation allows the simultaneous knockdown of two or more genes in independent regions of the spinal cord. This permits complex cellular and molecular interactions to be examined during development, in a manner that is fast, simple, precise and inexpensive. In combination with DiI tracing of commissural axon trajectories in open-book preparations5, this method is a useful tool for in vivo studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance. In principle, any promoter/enhancer could be used, potentially making the technique more widely applicable for in vivo studies of gene function during development6.
This video first demonstrates how to handle and window eggs, the injection of DNA plasmids into the neural tube and the electroporation procedure. To investigate commissural axon guidance, the spinal cord is removed from the embryo as an open-book preparation, fixed, and injected with DiI to enable axon pathways to be traced. The spinal cord is mounted between coverslips and visualized using confocal microscopy.

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

A method by which gene expression in the neural tube can be downregulated in a cell type-specific, traceable manner is described. We demonstrate how in ovo electroporation of microRNA-based plasmids that elicit spatiotemporally controlled RNA interference can be used to investigate commissural axon guidance in the developing neural tube.

오픈 책 준비에 DiI 주입하여 개발 신경 튜브와 Phenotypes의 평가에 miRNA 기반 Plasmids의 비켜 Electroporation에

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

세포 배양과 병아리 배아에서 축슨 유도 수용체의 역학을 평가하기 위해 pHluorin의 사용

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking axonal projection of spinal interneurons in vertebrates, germ line-targeted reporter genes yield bilaterally symmetric labeling. Therefore, it is hard to distinguish between the ipsi- and contra-laterally projecting axons. Unilateral electroporation into the chick neural tube provides a useful means to restrict expression of a reporter gene to one side of the central nervous system, and to follow axonal projection on both sides 1 ,2-5. This video demonstrates first how to handle the eggs prior to injection. At HH stage 18-20, DNA is injected into the sacral level of the neural tube, then tungsten electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator. The egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development. Three days later (E6) the spinal cord is removed as an open book preparation from embryo, fixed, and processed for whole mount antibody staining. The stained spinal cord is mounted on slide and visualized using confocal microscopy.

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

This video demonstrates how to visualize axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the embryonic chick spinal cord utilizing in ovo electroporation of reporter genes under the control of specific enhancer elements.

활용 칙 신경 튜브에서 뉴런의 유전 정의된 그룹 Axonal 경로를 벗기기 비켜에서 Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking ...

생물학

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are increasingly viewed as an early feature of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD) and Huntington&#8217;s disease (HD). As yet unclear is the mechanism(s) by which axonal injury is induced. We reported the development of a novel technique to produce biologically active, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) that can be used to trace axonal transport of BDNF. Quantum dot-labeled BDNF (QD-BDNF) was produced by conjugating quantum dot 655 to mBtBDNF. A microfluidic device was used to isolate axons from neuron cell bodies. Addition of QD-BDNF to the axonal compartment allowed live imaging of BDNF transport in axons. We demonstrated that QD-BDNF moved essentially exclusively retrogradely, with very few pauses, at a moving velocity of around 1.06 &#956;m/sec. This system can be used to investigate mechanisms of disrupted axonal function in AD or HD, as well as other degenerative disorders.

Axonal transport of BDNF, a neurotrophic factor, is critical for the survival and function of several neuronal populations. Some degenerative disorders are marked by disruption of axonal structure and function. We demonstrated the techniques used to examine live trafficking of QD-BDNF in microfluidic chambers using primary neurons.

양자의 축삭 교통 수단의 실시간 이미징 차 뉴런에서 BDNF를 도트 표지

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는<em&gt; 생체</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

접근 방법은 등쪽 뿌리 신경절 뉴런의 정렬 및 수초를 강화하는

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

재귀 신경 회로의 연구 : 빠른 신경 돌기 확장과 기능적 신경 연결을위한 새로운 방법

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

요약

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이 비디오의 챕터

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :