我々のプロトコルは、培養ゼブラフィッシュニューロンおよび幼虫における過酸化水素バイオセンサーの使用を記述する。このプロトコルは、研究者が正常な生理学および病態生理学における活性酸素種の役割を解剖するのに役立つ。この技術の主な利点は、生きている動物および培養細胞における過酸化水素のリアルタイム検出である。
この方法は、げっ歯類モデルシステムのような他の動物に適用することができます。カバーリップを調製するには、100%エタノールに保存された酸洗浄カバーリップを使用してください。鉗子を使用して貯蔵容器からカバースリップを1つ取り除き、それを炎にして残留エタノールを取り除きます。
35ミリメートルの培養皿の中に角度を付けてカバースリップを完全に乾燥させます。ポリ-D-リジンまたはPDL、または作業ソリューションを準備します。PDLを各カバースリップの中央に適用し、溶液が端に広がらないようにし、室温で20〜30分間PDLをインキュベートします。
PDLが乾燥していないことを確認します。PDLを0.5ミリリットルの無菌水で洗い、プレートを完全に乾燥させます。ラミニン作業溶液を準備します。
そして、各カバースリップの中心にそれを適用し、エッジへの溶液の拡散を避けるようにしてください。加湿インキュベーターで37°Cでプレートを2〜6時間インキュベートし、ラミニン溶液の乾燥を避けます。プレートのレチナル神経節細胞またはRGCで胚解剖を行うために、35ミリメートルの組織培養皿を4個用意してラベル付けし、70%エタノールの4ミリリットルで満たします。
E2 メディア 1.E2 メディア 2.そしてE2メディア3は、解剖の日に。
食器を冷蔵庫に入れておきなさい。ゼブラフィッシュ胚が受精後34時間である場合、ラミニンでコーティングされた培養皿を培養器から取り出す。そして、カバースリップを0.5ミリリットルの1X PBSで3回洗います。
最後の洗浄後、各培養皿に4ミリリットルのZFCM+培地を加えます。プレートの乾燥は避けてください。調理した冷蔵培養料理を取り出し、室温に平衡させます。
15マイクロリットルのZFCM+培地で4~6個のPCRチューブを充填します。インキュベーターからゼブラフィッシュ胚を取り出し、70%エタノールを含む35ミリメートルの組織培養皿に胚を5〜10秒間浸漬して殺菌する。ピペットの移入を用いて、胚をE2培地1皿に移し、無菌E2培地を含有して過剰なエタノールを洗い流す。
その後、胚をE2培地2皿に移し、鋭利な鉗子でそれらの色素を取り除く。最後に、胚をE2培地3皿に移し、切り出しを行う。一対の細かい鉗子を使用して、鉗子の1つで卵黄に前から胚を配置し、保持する。
そして、他の鉗子と黄身嚢に尾後部を取り外します。鉗子で首をつかみ、脳と目をE2メディアに露出させるために頭を外します。細かい鉗子の先端で、頭蓋組織を第2鉗子で下に押さえながら、頭から目をそっと転がします。
ZFCM+穏やかにp20ピペットで上下にトリチュレートして細胞の解体を解除するために、ZFCM+を含む以前に調製されたチューブの1つに4つの目を移します。解約セルを使用して ZFCM+をカバーリップの中心に移動します。振動を吸収するためにポリスチレンフォームラックの22°Cでベンチトップの培養を維持します。
イメージングの日に、RGC軸索の成長を検証するために顕微鏡下の細胞をチェックしてください。生細胞イメージングの場合、培養皿から生細胞イメージングチャンバにカバーリップを移します。DICの目的OG-590ロングパスレッドフィルターとEMCCDカメラを搭載した反転顕微鏡を使用してください。
イメージングの前に、ZFCM+培地をZFCM-10X目的で細胞を配置した後に置き換え、油浸し目的を使用して60倍の倍率で画像を取得します。追加の 1.5 倍の倍率を使用します。まずDIC画像を取得します。
そして、画像roGFP2-Orp1は、適当なフィルタセットを用いた。最初の画像セットを撮った後、異なる治療溶液を含むメディアとメディアを交換します。pHおよび浸透性の変化を避けるために、イメージングの30分ごとにメディアを交換する必要があります。
インビボイメージングの場合、メチレンブルーなしで0.003%フェニルチオ尿を含むE3培地で22〜24時間受精後胚を保持する。メディアを交換し、毎日死んだ胚を取り除きます。所望の年齢で、35ミリメートルガラス底培養皿に1%アガロースで胚を麻酔し、取り付ける。
胚は、画像化の対象領域に応じて、後方、腹側、または横方向に向けることができる。アガロースが固まった後、メチレンブルーなしでE3培地で皿を満たすが、0.016%トリカインで。イメージング用の顕微鏡を設置します。
逆レーザー走査共焦点顕微鏡を使用して、アガロースドロップの底に取り付けられた胚を画像化します。roGFP2-Orp1を励起し、所望のエミッションフィルターで対応する画像を取得する。胚の所望の部分を通して5マイクロメートルのセクション厚さのzスタックを獲得する。
イメージング後、微細な鉗子でアガロースから胚を取り除き、必要な年齢になるまでフェニルチオ尿素を用いてインキュベーターおよびメチレンブルーフリー培地に保管します。過酸化水素バイオセンサーおよび培養ゼブラフィッシュRGC拡張軸索の代表的な画像をここに示す。細胞体、軸索、および成長コーンは、個々のニューロンではっきりと見えます。
培養媒体に過酸化水素を添加すると比値が増加し、この系でリアルタイム変化を検出できることを示す。過酸化水素レベルの定量は、ゼブラフィッシュ胚全体の過酸化水素レベルを決定 B.To パネルに示され、mRNAを1つの細胞段階で注入し、すべての組織がroGFP2-Orp1バイオセンサーを発現させる。ゼブラフィッシュ幼虫の頭部領域は、2つの異なる時点で示され、レチナの過酸化水素レベルに焦点を当てています。
受精後2日および受精後5日間のゼブラフィッシュ胚中の過酸化水素の基底レベルを測定した。受精後2日で、受精後5日に比値が有意に低かった。さらに、各動物は、その過酸化水素含有量の異なるレベルの増加を示した。
目を取り除く細かい鉗子を使用し、ピペットと目の穏やかな解離は、この手順で最も重要なステップです。このプロトコルは、ROSシグナル伝達に関与する因子を調査するために薬物治療を続けることができる。
