단백질의 기능을 알아내는 일반적인 기술은 그것을 삭제하고 무슨 일이 일어나는지 보는 것입니다. 그러나 필수 단백질로는 그렇게 할 수 없습니다. 그것은 필수적이다, 세포는 죽는다.
그래서 당신은 그 단백질을 제거하고 세포 죽음 직전에 무슨 일이 일어나는지 엿볼 수있는 방법이 필요합니다. 단백질 고갈은 빠를 수 있으므로 이차 효과가 없습니다. 단백질만 제거하고 원하는 경우에만 고갈되도록 구체적이어야 합니다.
그리고 그 단백질을 제거하는 것 이외에 다른 방법으로 세포에 영향을 미치지 않아야 합니다. 변형을 준비 한 후, 희석이 필요한 것을 결정하기 위해 하룻밤 문화를 사용합니다. 이 정보를 사용하여 0.1에서 0.2 사이의 OD600을 사용하여 충분한 새로운 문화를 설정하고 섭씨 30도에서 성장하십시오.
연기 후드에 의도한 시료 부피의 30~50%에 해당하는 메탄올을 15밀리리터 튜브에 추가합니다. 튜브를 단단히 닫고 라벨을 붙인 다음 건조한 얼음위에 놓아 차갑게 식힙니다. 다음으로, 샘플의 장기 저장을 위한 1.5 밀리리터 튜브를 라벨로 표시하고 얼음 위에 놓아 식힙니다.
얼음에 샘플 당 물 적어도 1 밀리리터를 냉각. 사전 배양의 시작을 위한 표적 광학 밀도가 도달하면, 차가운 메탄올을 포함하는 미리 준비된 튜브로 샘플을 전송한다. 튜브를 잠시 반전시키고 드라이 아이스에 다시 놓습니다.
이것은 유도되지 않은 제어 샘플입니다. 즉시, 최종 농도가 10 마이크로몰러가 될 수 있도록 베타 에스트라디올을 추가한다. 혼합을 위해 힘차게 소용돌이.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 최적의 시간 동안 베타 에스트라디올을 배양하여 이전과 같이 문화를 계속 성장시합니다. 베타 에스트라디오인큐베이션 시간은 가장 중요한 단계이며 모든 단백질에 최적화되어야 합니다. 너무 짧고 고갈이 불완전하고 느립니다.
너무 길고 단백질 수준은 auxin을 추가하기 도 전에 떨어질 것입니다. 배양밀리리터당 0.5 마이크로리터의 파이펫을 배양하여 나중에 추가합니다. 이전에 설명한 대로 고르지 않은 배양에서 샘플을 수집합니다.
즉시 750 마이크로 몰러의 최종 농도에 IAA를 추가하고 혼합 격렬하게 소용돌이. 믹싱 후 가능한 한 빨리 타이머를 시작합니다. 실험 설계에 따라 샘플을 수집합니다.
그런 다음 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 샘플중 어느 것도 동결되지 않았는지 확인합니다. 있는 경우, 지속적으로 반전하면서 손에 부드럽게 데워.
모든 샘플을 채취하고 동결되지 않은 후 원심분리기는 3, 500회 G, 섭씨 4도에서 2분간 분리합니다. 메탄올과 중간 크기의 믹스를 붓고 샘플을 얼음 위에 다시 놓습니다. 그런 다음, 1 밀리리터의 물에 세포 펠릿을 다시 중단하고 이 현탁액을 얼음에 표시된 튜브로 옮기습니다.
원심분리기는 세포를 격퇴하기 위해 15, 000배 G 이상의 속도로 짧게 합니다. 그 후 튜브를 얼음에 다시 놓고 액체를 흡인시합니다. 이 연구에서는, 분해는 효모 세포의 물질 대사에 영향을 주지 않고 특이하고 효율적인 단백질 고갈을 달성하기 위하여 조정됩니다.
저풍스플리케소말 Prp2 및 Prp22 단백질은 베타 에스트라디올을 사용하여 20분 동안 배양 전 20분 후에 20% 미만으로 고갈되고, 이어서 15분 동안 auxin을 섭취합니다. 더 긴 사전 잠복기는 더 빠른 고갈로 이끌어 내지만, 또한 auxin 추가 의 앞에 바람직하지 않은 단백질 고갈을 보여줍니다. 이에 비해, 더 풍부한 Dcp1은 동일한 치료로 약 30%로 고갈된다.
그러나, 60분 전 배양 시간 때문에 보조가 첨가되기 전에 고갈의 비용으로 동일한 보조 처리로 13%로 고갈됩니다. 인큐베이션 전 시간을 최적화하고 시간 포인트 사이에 시간을 놓치지 마세요. 다음에 해야 할 일은 귀하의 질문에 따라 달라집니다.
우리는 문화의 10 mils 견본이 단백질, DNA, 또는 RNA 분석을 위해 충분하다는 것을 것을을 발견했습니다. 샘플링 프로시저는 ChIP에도 쉽게 적응할 수 있습니다. 이제 단백질을 고갈하는 신속하고 구체적인 방법이 있습니다.
따라서 필수 단백질의 기능도 찾을 수 있습니다. 프로토콜은 매우 안전합니다. 메탄올은 유일한 위험한 화학 물질입니다.
그것을 분배하는 동안주의하십시오. 메탄올이 대부분의 니트릴 장갑을 통과할 수 있기 때문에 연기 후드로 두 쌍의 장갑을 착용하십시오.
