Bir proteinin işlevini bulmak için yaygın bir teknik onu silmek ve ne olduğunu görmektir. Ama bunu gerekli bir proteinle yapamazsın. Bu çok önemli, hücre ölür.
Yani bu proteini çıkarmanın ve hücre ölümünden hemen önce neler olduğuna dair bir bakış yakalamanın bir yolunu bulamalısınız. Protein tükenmesi hızlı olmalı, böylece ikincil bir etki elde eylemezsiniz. Bu özel olmalıdır, böylece sadece bu protein kaldırılır ve sadece istediğiniz zaman tükenmiş.
Ve bu proteini çıkarmak dışında başka bir şekilde hücre etkilememelidir. Zorlanma yı hazırladıktan sonra, ne seyreltme gerekli olduğunu belirlemek için bir gecede kültür kullanın. 0,1 ve 0,2 arasında bir OD600 ile yeterli yeni bir kültür kurmak ve 30 santigrat derecede büyümek için bu bilgileri kullanın.
Bir duman kaputunda, 15 mililitrelik bir tüpe istenilen numune hacminin %30 ila %50'sine eşdeğer bir metanol ekleyin. Tüpleri sıkıca kapatın, etiketleyin ve soğuması için kuru buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, numunelerin uzun süreli depolanması için 1,5 mililitrelik tüpleri etiketleyin ve soğuması için buz üzerine yerleştirin.
Buz üzerinde numune başına en az bir mililitre su soğutun. Ön kuluçka nın başlangıcı için hedef optik yoğunluğa ulaşıldıktan sonra, bir numuneyi soğuk metanol içeren önceden hazırlanmış tüpe aktarın. Tüpü kısa bir süre ters çevirin ve kuru buzun üzerine geri yerleştirin.
Bu uninduced kontrol örneğidir. Hemen, beta-estradiol gibi son konsantrasyon 10-micromolar ekleyin. Karıştırmak için şiddetle girdap.
Metin protokolünde belirtildiği gibi en uygun süre için beta-estradiol ile kuluçka ya da kültürü eskisi gibi büyütmeye devam edin. Beta-estradiol kuluçka süresi en önemli adımdır ve her protein için optimize edilmelidir. Çok kısa ve tükenmeeksik ve yavaş.
Çok uzun ve protein düzeyleri bile auxin eklemeden önce düşecek. Pipet kadar 0.5 mikrolitre IAA kültür mililitre başına daha sonra eklemek için. Daha önce açıklandığı gibi tükenmemiş kültürden bir örnek toplayın.
Hemen 750-mikromolar son konsantrasyona IAA ekleyin ve şiddetle karıştırmak için girdap. Karıştırmadan sonra mümkün olan en kısa sürede bir zamanlayıcı başlatın. Deneysel tasarıma göre numune toplayın.
Sonra, buz üzerinde örnekleri yerleştirin. Örneklerin hiçbirinin dondurulmamadığından emin olun. Varsa, sürekli ters çevirerek hafifçe elinde onları ısıtın.
Tüm numuneler toplandıktan ve dondurulmadıktan sonra, 3, 500 kez G ve dört santigrat derece iki dakika santrifüj. Metanol ve orta karışımı dökün ve buz üzerinde örnekleri geri yerleştirin. Daha sonra, bir mililitre suda hücre peletyeniden askıya ve buz üzerinde etiketli bir tüp bu süspansiyon aktarın.
Hücreleri püskürtmek için 15,000 kez G'nin üzerinde bir hızda kısaca santrifüj edin. Bundan sonra tüpleri tekrar buza yerleştirin ve sıvıyı aspire edin. Bu çalışmada, bozulma aksi takdirde maya hücresimetabolizmasını etkilemeden belirli ve verimli protein tükenmesi elde etmek için ayarlanır.
Düşük bolluk splioymal Prp2 ve Prp22 proteinleri beta-estradiol ile ön kuluçka 20 dakika sonra az% 20 tükenmiş, auxin ile 15 dakika takip. Daha uzun kuluçka süreleri daha hızlı tükenmesine yol açar, ancak auxin ilavesinden önce istenmeyen protein tükenmesini de gösterir. Buna karşılık, daha bol Dcp1 sadece yaklaşık% 30 aynı tedavi ile tükenmiş.
Ancak, 60 dakikalık kuluçka öncesi süre, eklenmeden önce tükenme pahasına aynı auxin tedavisi ile %13'e kadar tükenmeile sonuçlanır. Kuluçka öncesi zamanı optimize edin ve zaman puanlarınız arasındaki zamanı kaybetmeyin. Bundan sonra ne yapacağınız sorunuza bağlıdır.
10 milimetrelik kültür örneğinin protein, DNA veya RNA analizi için yeterli olduğunu bulduk. Örnekleme prosedürü de ChIP için kolayca uyarlanabilir. Şimdi proteinleri tüketmek için hızlı ve özel bir yolu vardır.
Yani temel proteinlerin işlevi bile bulunabilir. Protokol oldukça güvenli. Metanol tek tehlikeli kimyasaldır.
Dağıtırken dikkatli olalım. Bir duman başlık içinde yapın ve iki çift eldiven giymek, metanol en nitril eldiven ile alabilirsiniz gibi.
