Name: high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines
Uploaded: 2020-11-09T15:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines at JoVE.com

K.M.R, S.D.M, M.U. 및 D.L.D는 모두 Promega Corporation의 직원입니다.

1. 선택적 세포 생존율 형광 분석을 통한 용균 형식의 HiBiT CRISPR 표적 단백질을 사용한 종말점 분해 연구
<ol><li>포유동물 부착성 또는 현탁 세포주의 제조 및 도금<ol><li>계대 노화 및 세포 성장에 사용되는 적절한 세포 배지에서 희석하여 세포 밀도를 2.22 x 105/mL로 조정합니다.</li>
		<li>실험 및 제어 조건당 최소 3웰의 플레이트에 세포를 분주합니다. 세포 현탁액 웰당 90μL(20,000개 세포)를 96웰 백색 플레이트에 분주합니다. 384웰 형식의 경우 세포 현탁액 웰당 36μL(8,000개 세포)를 384웰 백색 플레이트에 분주합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>화합물의 제조 및 첨가<ol><li>연속 희석된 PROTAC 또는 분해제 시험 화합물 플레이트를 100% DMSO 중 최종 농도 1,000배로 준비합니다. 그런 다음 세포 배양 배지에서 최종 농도의 10배로 희석합니다. 동일한 부피의 DMSO를 배지에 첨가하여, DMSO 화합물이 없는 대조군으로서 사용되도록 한다.</li>
		<li>96웰 포맷의 경우 10μL의 10x 화합물 및 대조군 용액을 90μL의 세포에 추가합니다. 384웰 형식의 경우 4μL의 10x 화합물 및 대조군 용액을 36μL의 세포에 추가합니다.</li>
		<li>플레이트를 37°C 및 5%CO2 의 인큐베이터에서 원하는 시간 동안 또는 이들의 성장에 최적인 조건에서 배양한다. 참고: 이것은 종말점 분석이므로 여러 시점을 테스트하려면 위의 1.1.2단계에 설명된 대로 각 시점에 대해 별도의 분해판을 준비해야 합니다. 화합물 매개 분해를 검출하기 위한 배양 시간은 매우 다양하며 화합물 농도에 따라 달라질 수 있습니다. 제안된 초기 시점은 6시간 및 24시간입니다.</li>
		<li>선택적 세포 생존율 측정 없이 종말점 발광 검출을 측정하는 경우 아래 1.3단계로 직접 진행합니다. 세포 생존율 측정으로 멀티플렉싱을 수행하는 경우 아래의 다음 섹션 1.4로 진행하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>세포의 용균 측정<ol><li>HiBiT 용균 측정 직전에 용균 완충액 1mL당 용균 기질 20μL와 LgBiT 단백질 10μL를 추가하여 2x 용균 검출 시약을 준비합니다. 피펫팅 오류를 설명하기 위한 추가 부피(즉, 웰 수 + 10%)를 포함하여 분석할 웰 수에 대해 충분한 2x 검출 시약을 준비합니다.</li>
		<li>준비된 용균 검출 시약을 세포에 첨가하십시오. 96웰 형식의 경우 100μL의 세포를 포함하는 각 웰에 100μL의 2x 용해 검출 시약을 추가합니다. 384웰 형식의 경우 40μL의 세포를 포함하는 각 웰에 40μL의 2x 용균 검출 시약을 추가합니다. 플레이트를 마이크로플레이트 와류 혼합기에서 350rpm에서 10-20분 동안 혼합합니다.</li>
		<li>96웰 또는 384웰 플레이트에서 발광을 읽을 수 있는 루미노미터에서 발광을 측정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>선택적 세포 생존율 멀티플렉싱 참고: 이 단계는 시중에서 판매하는 CTF(CellTiter-Fluor) 키트를 사용하여 수행됩니다( 재료 표 참조).<ol><li>원하는 종말점 측정 30-40분 전에, 2 mL의 분석 완충액에 10 μL의 기질을 첨가하여 6x 세포 생존율 검출 시약 용액을 준비합니다. 피펫팅 오류에 대한 추가 부피(즉, 웰 수 + 10%)를 포함하여 분석할 각 웰에 대해 충분한 6x 시약을 준비합니다.</li>
		<li>준비된 시약을 웰에 첨가하십시오. 96웰 포맷의 경우 이미 100μL 부피가 포함된 각 웰에 20μL의 6x 시약을 추가합니다. 384웰 형식의 경우 40μL의 세포를 포함하는 각 웰에 8μL의 6x 시약을 추가합니다. 마이크로플레이트 와류 혼합기에서 간단히 혼합한 다음, 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>원하는 측정 종말점(즉, 처리 후 6시간 또는 24시간, 1.2.3단계)에서 96웰 또는 384웰 형식으로 형광(380-400nmEx/505nmEm)을 판독할 수 있는 기기에서 형광을 측정합니다.</li>
		<li>용균 완충액 1mL당 용균 기질 20μL와 LgBiT 단백질 10μL를 추가하여 2x 용균 검출 시약을 준비합니다. 피펫팅 오류를 설명하기 위한 추가 부피(예: 웰 수 + 10%)를 포함하여 분석할 웰 수에 대해 충분한 2x 검출 시약을 준비합니다.</li>
		<li>준비된 용균 검출 시약을 웰에 첨가하십시오. 96웰 형식의 경우 이미 120μL 부피가 포함된 각 웰에 120μL의 2x 용균 검출 시약을 추가합니다. 384웰 형식의 경우 이미 48μL 부피가 포함된 각 웰에 48μL의 2x 용균 검출 시약을 추가합니다. 플레이트를 마이크로플레이트 와류 혼합기에서 10-20분 동안 혼합합니다.</li>
		<li>96웰 또는 384웰 플레이트에서 발광을 판독할 수 있는 루미노미터에서 발광을 측정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>분해 및 세포 생존율의 정량화<ol><li>측정된 시점에서 DMSO 컨트롤의 상대 조명 단위(RLU)의 평균을 구합니다. 이 값을 표적의 기준 단백질 수준으로 사용하여 동일한 시점에서 테스트된 다른 모든 처리를 이 값으로 정규화하여 분별 분해를 계산합니다. 예를 들어, 6h에서 DMSO 대조군 웰에 대한 평균 RLU가 10,000이고 6h에서 주어진 화합물 처리에 대한 RLU가 5,000인 경우, 분별 분해는 5,000 ÷ 10,000 = 0.5로 계산됩니다(방정식 1). 방정식 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>분수 RLU에서 백분율 저하를 결정합니다. 방정식 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ02.jpg"></li>
		<li>특정 시점에서 분수 RLU 또는 분해 %를 플롯하여 화합물의 활성 순위를 매깁니다.</li>
		<li>임의로, 모든 처리로부터의 값을 DMSO 대조군과 비교하여 세포 생존율 분석 측정을 위한 상대 형광 단위(RFU) 데이터를 분석한다. DMSO 대조군에 비해 임의의 처리에 대해 RFU의 유의한 감소가 관찰되는 경우, 분해 데이터는 세포 생존율의 손실에 대한 단백질 수준의 변화를 결정하기 위해 세포 생존율 분석 데이터에 추가적으로 정규화될 수 있다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. HiBiT CRISPR 표적 단백질의 실시간 동역학 분해 및 선택적 세포 생존율 발광 분석
참고: 동역학 스크리닝 및 분해를 수행하는 능력은 세포에서 LgBiT 단백질 공동 발현을 필요로 하며, 이는 이전에 18,19,63에서 설명되었습니다. 이는 LgBiT 벡터의 일시적인 형질감염, BacMam LgBiT의 사용 또는 LgBiT 안정한 세포주에 HiBiT CRISPR 삽입을 수행함으로써 달성될 수 있다.
<ol><li>부착 세포주의 도금.<ol><li>흡인에 의해 세포 플라스크에서 배지를 제거하고, DPBS로 세포를 세척하고, 0.05% 트립신-EDTA로 세포를 해리시키고, 세포가 플라스크 바닥에서 해리되도록 합니다. 현탁 세포주의 경우, 섹션 2.2로 진행한다.</li>
		<li>혈청 함유 세포 배양 배지를 사용하여 트립신을 중화하고, 혼합하여 세포를 수집 및 재현탁하고, 세포 현탁액을 원뿔형 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>세포를 125 x g 에서 5분 동안 회전시킵니다. 세포 배양 배지를 폐기하고 동일한 부피의 새로운 세포 배양 배지에 재현탁합니다.</li>
		<li>세포를 분석 플레이트로 플레이트화하고 실험 및 제어 조건당 최소 3중 웰을 사용합니다. 세포 밀도를 추정하기 위한 96웰 형식 계수의 경우 분석 배지에서 밀도를 2 x 105 cells/mL로 조정하고 96웰 플레이트에서 웰당 100μL(20,000개 세포)를 분주합니다. 세포 밀도를 추정하기 위한 384웰 포맷 계수의 경우 분석 배지에서 밀도를 4.44 x 105 cells/mL로 조정하고 웰당 18 μL(8,000개 세포)를 분주합니다.</li>
		<li>플레이트를 37°C, 5%CO2 에서 밤새 또는 이들의 성장에 최적인 조건에서 배양한다.</li>
	</ol></li>
	<li>현탁 세포의 도금<ol><li>10% FBS와 1x Endurazine(스톡 시약의 1:100 희석)이 보충된 CO 2 독립 배지에서 세포 밀도를2.22 x 105 cells/mL로 조정합니다.</li>
		<li>세포를 실험 및 제어 조건당 최소 3웰의 분석 플레이트로 플레이트화합니다. 96웰 포맷의 경우 웰당 90μL(20,000개 세포)를 분주합니다. 384웰 형식의 경우 웰당 36μL(8,000개 세포)를 분주합니다. 참고: 신호-배경(S:B) 발광이 낮은 현탁 세포주의 경우(예: 클론이 아닌 CRISPR 풀로 작업할 때) 도금된 세포 수를 96웰 형식의 경우 최대 100,000세포/웰 또는 384웰 형식의 경우 40,000세포/웰까지 늘려 발광을 증가시킬 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>LgBiT를 발현하는 HiBiT CRISPR 세포를 사용한 운동 분해 분석<ol><li>2.2.의 도금 단계에서 포함되었던 Endurazine을 이미 함유하는 현탁 세포의 경우, 단계 2.3.3으로 바로 진행한다. 부착 세포주의 경우 Nano-Glo 엔두라진 용액을 준비하십시오. 96-웰 형식의 경우, 10% FBS가 보충된CO2-비의존적 배지에 스톡 시약 1:100을 희석하여 엔두라진의 1x 용액을 준비합니다. 384-웰 형식의 경우, 10% FBS가 보충된CO2-독립적 배지에 스톡 시약 1:50을 희석하여 엔두라진의 2x 용액을 준비합니다.</li>
		<li>부착 세포의 각 웰에 엔두라진 용액을 첨가하십시오. 96웰 포맷 흡입 배지의 경우 1x 엔두라진 용액 90μL를 추가합니다. 384웰 형식의 경우 18μL의 세포에 18μL의 2x 엔두라진 용액을 추가합니다. 분해 분석은 384웰 형식의 배양 배지와CO2 독립 배지의 50:50 혼합물에서 수행되므로 배지를 흡입하지 마십시오.</li>
		<li>엔두라진을 함유하는 현탁액 또는 부착성 세포 플레이트를 37°C 및 5%CO2 의 인큐베이터에서 2.5시간 동안 배양하여 발광이 평형을 이루도록 한다.</li>
		<li>CO2-비의존적 배지에서 10x 농도의 시험 PROTAC 적정을 제조하고 96-웰 플레이트의 각 웰에 10 μL 또는 384-웰 플레이트의 경우 4 μL를 첨가한다. 효능이 알려지지 않은 화합물의 경우 가장 높은 지점에서 1-10 μM의 최종 농도가 시작점으로 권장됩니다.</li>
		<li>0-48시간 동안 37°C로 사전 평형화된 광도계에서 발광의 동역학 측정값을 수집합니다. 측정 시간 증분은 각 실험에 대해 사용자 정의 할 수 있지만 권장되는 초기 실험은 24 시간 동안 5-15 분마다 발광 측정입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>최종 동역학 측정 후 선택적 세포 생존율 동일 웰 멀티플렉스 분석 참고: 이 분석은 시중에서 판매되는 CellTiter-Glo(CTG) 키트( 재료 표 참조)로 수행됩니다.<ol><li>CTG 시약을 실온으로 평형화합니다.</li>
		<li>동역학 분석의 마지막 시점에서 분해 측정 후 플레이트의 웰당 시약 100μL(96웰 플레이트) 또는 40μL(384웰 플레이트)를 추가하고 플레이트 셰이커에서 500-700rpm(96웰 플레이트) 또는 마이크로플레이트 와류 혼합기(384웰 플레이트)에서 5분 동안 혼합합니다.</li>
		<li>플레이트를 실온에서 30분 동안 배양하여 세포 용해 및 HiBiT 신호의 퀀칭을 허용합니다.</li>
		<li>제조업체의 권장 사항에 따라 광도계의 총 발광을 측정하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>키네틱 분해 프로파일의 정량화<ol><li>수집된 운동 발광 측정을 사용하여, 각 PROTAC 농도에 대한 원시 RLU를 시간 경과에 따른 유리 퓨리마진 농도의 변화를 설명하기 위해 매 시점마다 평균 DMSO 조건을 복제하도록 정규화한다. 방정식 1을 사용하여 분수 RLU를 계산합니다. 방정식 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>분해 곡선에서 방정식 2를 사용하는 단일 성분 지수 감쇠 모델을 각 곡선의 초기 분해 부분에 데이터가 고원에 도달하는 지점까지 피팅합니다. 참고: 성능 저하가 관찰되기 전에 약간의 지연이 있을 수 있으므로 처음 몇 개의 데이터 포인트를 피팅에서 제외하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 방정식 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ03.jpg"></li>
		<li>방정식 2에서 분해 속도 상수를 나타내는 파라미터 ƛ와 남아있는 단백질의 최소량의 Plateau를 결정합니다.</li>
		<li>분해된 단백질의 최대 분획량인 Dmax를 계산하고 1-고원으로 계산합니다.</li>
		<li>시간 독립적 분해 효능 곡선을 결정하기 위해 PROTAC의 각 농도에 대한 Dmax를 플로팅합니다.</li>
		<li>화합물의 효능을 분석하기 위해 2.3.5에서 플롯에 대한 Dmax50 값을 결정하십시오. 알림: 특정 시점에서 DC50을 결정하려면 선택한 시간에 각 농도에 대해 계산된 분해 백분율을 플로팅하십시오. DC 50 t=4 h 또는 DC50 t=12 h로 지정할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

Promega Corporation은 HiBiT 및 NanoLuc 기술 및 응용 프로그램의 특허를 양도하여 상업적 소유자입니다.

여기에서는 종말점 용균 형식 또는 생세포 동역학 모드에서 분해 화합물 활성을 스크리닝하는 두 가지 방법을 제시합니다. 이러한 접근 방식은 동일한 발광 측정 원리를 기반으로 하지만 서로 다른 수준의 세부 사항과 이해를 제공합니다. 두 접근법 중 하나의 선택은 스크리닝 목표와 복합 라이브러리의 크기에 따라 달라질 수 있습니다. 검출 가능한 분해를 관찰하기 위한 대형 화합물 스크리닝 데크 또는 1차 스크리닝의 경우, 웨스턴 블롯 또는 질량분석법과 같은 다른 종말점 접근법이 비실용적이거나 적응하기 어려울 수 있는 민감하고 효율적인 고처리량 호환성을 제공합니다14. 이들 스크린의 시작점은 제한된 수의 농도 및 시간점으로 수행될 수 있다. 테스트에 권장되는 초기 농도는 100nM-10μM 범위이며, 초기 분해제는 효능이 낮고 투과성이 좋지 않거나 경우에 따라 매우 강력한 화합물의 경우 후크 효과가 있는 것을 설명합니다. 또한 4-6 시간에 조기 발병 저하와 18-24 시간에 잠복 또는 지속적인 저하를 설정하기 위해 최소 두 개의 다른 시점을 테스트하는 것이 좋습니다. 높은 분해 효능 및 표적 메커니즘을 나타내는 화합물은 4-6시간 내에 쉽게 관찰되는 반면, 이후 시점에서만 관찰되는 분해 또는 명백한 단백질 손실은 다양한 메커니즘으로 인한 것일 수 있습니다. 단백질 손실이 세포 사멸로 인한 손실과 분리될 수 있도록 초기 및 후기 시점 모두에서 세포 생존율을 모니터링하는 것이 좋습니다. 모든 유형의 발광 또는 형광 분석과 유사하게, 라이브러리 내의 화합물이 신호를 방해하거나 억제할 가능성이 있으므로, 단백질 수준을 모니터링하기 위한 관련 없는 융합 또는 대체 접근법을 사용하는 납 화합물에 대한 직교 후속 실험은 이러한 분석에서 RLU의 손실이 표적 단백질 분해와 직접적으로 연관되어 있음을 평가하는 데 중요합니다.
장기간에 걸쳐 살아있는 세포 동역학 형식으로 스크리닝하는 능력은 배경에 대한 분석 신호에 크게 의존합니다(S:B). S:B에 기여하는 인자에는 표적 단백질 자체의 발현 수준, 펩타이드 삽입을 위해 선택된 세포주에서의 LgBiT 발현 효율, 다양한 네이티브 복합체에서 보완을위한 태그가 지정된 표적의 가용성. 우리는 Endurazine 또는 Vivazine을 사용하여 운동 모드에서 분해를 성공적으로 측정하기 위해 15의 S:B로 구성된 일반적인 컷오프 요구 사항을 설정했습니다. S:B는 엔두라진 또는 비바진 생세포 기질의 존재 하에 LgBiT 단독을 발현하는 편집되지 않은 모 세포와 비교하여 LgBiT를 공동 발현하는 HiBiT-편집된 세포의 기준선 신호를 측정함으로써 결정된다. 비바진은 더 높은 발광 신호를 생성하지만 엔두라진보다 더 빨리 붕괴되며 신호 획득을 24시간 이하로 제한할 수 있습니다. 또한 S:B는 CRISPR 풀 또는 클론 사용 여부에 따라 크게 달라질 수 있습니다. CRISPR/Cas9 엔지니어링에 더 적합하고 효율성이 높은 세포주의 표적의 경우, 편집된 세포의 이질적인 CRISPR 풀 집단은 동역학 분석을 위한 충분한 S:B를 가질 수 있습니다. CRISPR을 통한 덜 효율적인 게놈 통합으로 인해 S:B가 낮은 풀이 생성되는 더 어려운 세포주의 표적의 경우, 편집된 집단을 풍부하게 하고 동역학 분석을 위해 충분히 높은 S:B를 달성하기 위해 CRISPR 클론을 분리해야 할 수 있습니다. 이러한 시나리오 중 하나라도 S:B가 엔두라진 또는 비바진 기질로 15 미만이면 종말점 용균 스크리닝이 권장됩니다.
정량적 파라미터를 사용한 분해 프로파일의 결정을 포함하여 화합물의 더 나은 이해 및 특성화를 위해, 살아있는 세포에서의 실시간 동역학 분석이 권장되는 스크리닝 접근법14,18입니다. 위에서 논의한 종말점 분석과 마찬가지로 초기 키네틱 스크리닝은 고처리량 방식으로 100nM-10μM 범위의 제한된 수의 농도로 수행할 수 있습니다. 384웰 형식에서는 100개 이상의 화합물을 단일 플레이트에서 한 농도로 삼중으로 쉽게 스크리닝할 수 있습니다. 결과적인 분해 프로파일은 관찰된 분해 정도뿐만 아니라 분해 속도, 분해 기간 및 단백질14,18의 잠재적 회수에 대한 지침을 제공합니다(그림 2 및 그림 3). 분해 프로파일의 모양도 귀중한 정보를 제공합니다. 특이적이고 강력한 분해제는 종종 시간18,53 만에 고원으로 표적 단백질의 초기 빠른 손실을 보이는 반면, 전사 피드백 또는 화합물 독성과 같은 다른 메커니즘은 일반적으로 시간이 지남에 따라 단백질의 더 선형적인 손실을 초래합니다. 이러한 세부 사항과 뉘앙스는 종말점 용균 분석에서 누락되며 24-48시간에 걸친 실시간 분석을 통해 신규 또는 알려지지 않은 화합물 세트 내에서 실제 Dmax를 캡처하는 시간을 예측할 필요가 없습니다.
실시간 동역학은 또한 화합물 효능, 화합물 농도가 초기 분해 속도에 미치는 영향을 더 잘 이해하기 위해 효율적인 용량 반응 스크리닝을 허용하고 둘 이상의 매개 변수를 기반으로 화합물의 순위를 매길 수 있는 가능성을 제공합니다. 분해 효능의 고전적인 측정에는 명백한 분해 최대값을 기반으로 특정 시점의 DC50 계산이 포함됩니다. 대조적으로, 효능을 평가하기 위한 당사의 동역학적 접근 방식은 시간18에서 언제 발생하는지에 관계없이 각 농도에서 실제 분해 최대값을 통합합니다. 우리는 이러한 운동 분해 효능 측정을 Dmax5018이라고 부릅니다. 이러한 방식의 분석은 더 낮은 농도에서 더 천천히 분해를 시작할 수 있으므로 처리 후 Dmax에 도달하는 데 더 오랜 시간이 걸리는 화합물을 설명합니다. 분해 속도와 Dmax 모두에서 화합물의 순위를 매기는 것이 특히 유익할 수 있습니다. 가장 강력한 분해자의 경우 이것은 느리지 만 강력한 분해 물질을 빠르고 강력한 분해 인자와 더욱 구별합니다. HiBiT CRISPR 세포주를 활용한 용균 및 생세포 키네틱 스크리닝은 표적 단백질 분해, 화합물 기능에 대한 보다 포괄적인 그림을 제공하고 주요 분해 매개변수의 향상을 통해 초기 활성 평가에서 다운스트림 화학적 최적화에 이르는 스크리닝 프로세스를 가능하게 하는 강력한 접근 방식입니다.

표적 단백질 분해는 소분자 약물 발견에서 가장 빠르게 성장하는 영역 중 하나로 부상했으며, 암 치료를 위한 면역 조절 분자 접착제 화합물(예: IMiD)의 치료 성공과 키메라 화합물 1,2,3,4,5,6,7,8을 표적으로 하는 단백질 분해의 유망한 초기 임상 시험 데이터에 의해 크게 강화되었습니다. 9,10,11,12. 표적 단백질 분해 화합물은 표적 단백질을 E3 리가아제 기계 단백질 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12와 근접하게 가져옴으로써 기능합니다. . 이 화합물-유도된 표적 단백질의 E3 리가아제는 유비퀴틴 프로테아좀 경로(UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12를 통한 표적 단백질 유비퀴틴화 및 분해를 유도합니다. . 역사적으로 저분자 약물 발견 스크리닝 프로그램은 활성을 평가하고 화합물의 순위를 매기기 위해 초기 생화학 분석에 의존해 왔습니다. 그러나, 이는 프로테아좀을 통한 분해 가 세포 사건 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17의 캐스케이드에 의존하는 표적 단백질 분해제에게 중요한 도전을 제시했으며, 18. 성공적인 표적 분해에 필요한 단백질 복합체의 여러 경로와 복잡성으로 인해 초기 화합물의 조기 스크리닝 및 분류를 위한 세포 분석 접근법이 필요합니다. 현재, 세포 환경의 맥락에서 고처리량 방식으로 표적 단백질 분해를 모니터링하는 기술의 가용성은 심각하게 부족하다14. 여기에서는 분해제 화합물 10,11,18,19로 처리한 후 발광 측정을 통해 표적 단백질의 손실을 모니터링하기 위해 CRISPR/Cas9 내인성 태그가 붙은 HiBiT 표적 세포주18,19,20을 사용하여 실시간 키네틱 라이브 셀 또는 종말점 용해 분해 활성 평가를 위한 프로토콜을 제시합니다.
치료 표적의 성공적인 분해를 달성하고 약물성 프로테옴을 확장하기 위해, 원형질막, 리소좀, 미토콘드리아 막, 세포질 및 핵21-57에 국한된 단백질을 포함하여 파괴를 위한 광범위한 단백질을 표적화할 수 있는 수많은 접근법 및 유형의 분해제가 등장했습니다. 가장 광범위하게 연구된 화합물의 두 가지 주요 부류는 분자 접착제와 시메라 2,4,5,6,7,12,26을 표적으로 하는 단백질입니다. 분자 접착제는 1가이므로 일반적으로 크기가 더 작으며 E3 리가아제 성분 2,12,26에 결합할 때 표적 단백질과의 새로운 단백질:단백질 상호작용 인터페이스를 촉진합니다. 이들은 가장 일반적으로 Cereblon (CRBN) E3 리가 아제 성분 2,12,26,55,56,57에 결합하는 분해 인자입니다. 최근 DCAF1558,59,60 및 DDB145에 대한 CDK/Cyclin 모집과 같은 다른 E3 리가제 기계를 활용하는 흥미로운 새로운 사례는 이러한 종류의 화합물의 확장 가능성을 보여줍니다. 대조적으로, PROTAC는 표적 결합 리간드로 구성된 더 큰 2가 분자이며, 대부분 억제제이며 화학 링커를 통해 E3 리가 아제 핸들 1,3,4,5,7,13에 연결됩니다. 이와 같이, 이들 화합물은 E3 리가아제 및 표적 단백질 1,3,4,5,7,13 모두에 직접 결합할 수 있다. 수많은 단백질이 이러한 2가 분자를 통해 분해되는 것으로 나타났으며 가장 많이 사용되는 E3 리가아제 핸들은 CRBN 또는 Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13을 모집합니다. 그러나, 단백질 분해 설계를 표적으로 하는 키메라에서 E3 리가제 모집에 사용할 수 있는 핸들의 수가 빠르게 증가하고 있으며, 다양한 표적 클래스를 분해하고 세포 또는 조직 유형 특이성을 향상시킬 수 있는 잠재력을 가진 이 계열의 화합물의 기능이 확장되고 있습니다.24,48,61,62 . 한계 친화력에도 불구하고 표적 단백질에 관여하기 위한 최소한의 요구 사항과 결합하여, 분해 화합물은 약물성 프로테옴을 확장할 수 있는 가능성을 가지고 있습니다.
단백질 손실의 세포 역학과 치료 후 잠재적인 단백질 회수를 특성화하는 것은 분해 화합물 기능 및 효능을 이해하는 데 중요합니다. 웨스턴 블롯 항체 분석 또는 질량분석법을 사용하여 관련 세포 시스템에서 내인성 단백질 수준 변화를 연구하는 것이 가능하지만, 이러한 접근법은 고처리량 스크리닝 형식에 적응하기 어렵거나, 정량화 능력이 제한적이거나, 많은 시점에서 운동 변화를 측정하는 능력이 있습니다14. 이러한 문제를 해결하기 위해 자사는 내인성 단백질 수준의 변화를 모니터링하기 위한 플레이트 기반 세포 발광 시스템을 개발했으며, 이 시스템은 11개 아미노산 태그인 HiBiT의 CRISPR/Cas9를 통해 주요 분해 표적18,19,20의 유전자좌에 게놈 삽입을 활용합니다. 이 펩타이드는 결합 파트너 인 LgBiT에 대한 높은 친화력으로 보완되어 기질 18,19,20,63의 존재하에 밝은 발광을 생성하여 이러한 태그가 부여 된 내인성 단백질을 세포 또는 용해물 18,19,20,63에서 발광시킵니다. . 루미노미터 기기로 측정한 상대 조명 단위(RLU)는 태그가 지정된 표적 단백질 수준 18,19,20,63에 정비례합니다. 안정화된 루시퍼라아제 기질의 개발로 24-48시간 프레임에 걸친 실시간 운동 단백질 수준 측정이 가능합니다(18,53,64). 이를 통해 초기 분해 속도, 분해 최대(Dmax) 및 화합물 처리 후 회복(18,53)의 정량 분석을 포함하여 주어진 화합물 농도에서 임의의 주어진 표적에 대한 완전한 분해 프로파일을 결정할 수 있습니다. 그러나 분해 화합물의 대규모 라이브러리를 스크리닝하는 경우 다양한 약물 농도와 지정된 시간에 384웰 형식으로 종말점 분석을 쉽게 수행할 수도 있습니다.
이 원고에 제시된 프로토콜은 모든 유형의 분해제에 적용 가능한 표적 단백질 분해 화합물에 대한 세포 스크리닝 전략을 나타냅니다. 그러나 이러한 프로토콜과 함께 HiBiT CRISPR 세포주의 사용은 단백질 분해에 국한되지 않고 화합물 또는 심지어 내성 메커니즘의 영향을 연구하기 위해 처리 후 조절될 수 있는 내인성 표적 단백질 수준을 모니터링하기 위한 일반적인 도구입니다 20,65,66. 이러한 발광 기반 검출 방법의 전제 조건은 CRISPR 내인성 태그가 부착된 HiBiT 표적 세포주이며, 이는 내인성 표적 발현 및 천연 프로모터 조절18,19,20을 유지하면서 민감한 발광 검출을 가능하게 하기 때문에 중요합니다. 게놈 태그 삽입을 위해 CRISRP/Cas9를 활용하는 데 있어 상당한 발전이 이루어졌으며, 특히 확장성 20 및 검출 민감도가 높으며, CRISPR 풀 또는 이형접합체 또는 동형접합 대립유전자 삽입18,19,20이 있는 클론을 포함한 다양한 형식에서 이루어졌습니다. 내인성 태깅 대신에 세포에서 HiBiT 또는 다른 리포터 융합체의 외인성 발현의 사용이 가능하지만, 단백질 과발현14,18을 갖는 시스템을 사용하여 상당한 주의를 기울여야 한다. 이는 표적 분해 후 활성화된 잠재적인 전사 피드백 루프를 포함하여 진정한 화합물 효능 및 단백질 회복 역학(14,18)을 이해하는 인공물로 이어질 수 있습니다. 또한 효능이 낮은 초기 단계의 화합물을 놓칠 수 있으며 스크리닝에서 위음성으로 나타날 수 있습니다. 단백질 손실은 화합물 유도 독성 및 세포 사멸로 인해 발생할 수 있으므로 여기에 설명된 프로토콜에는 분해 프로토콜과 쌍을 이루는 적극 권장되지만 선택적인 세포 생존율 발광 또는 형광 분석이 포함되어 있습니다. 프로토콜에는 용균 종말점과 라이브 셀 키네틱 스크리닝이라는 두 가지 주요 섹션이 있습니다. 이러한 각 섹션 내에는 종말점 또는 동역학 형식의 멀티플렉스 세포 생존율 측정을 위한 옵션이 포함되어 있습니다. 태그가 부착된 내인성 단백질의 변화를 모니터링하려면 세포에서 LgBiT를 보완해야 합니다. 따라서, 키네틱 스크리닝 섹션은 이것의 도입을 위한 중요한 프로토콜을 참조하며, 이는 일시적 또는 안정한 발현을 통해 달성될 수 있고, 살아있는 세포 발광 측정을 수행하는 데 필수적이다. 여기에 제시된 모든 접근 방식은 화합물의 신속한 순위 순서 및 활성 평가를 허용하여 초기 단계의 화합물 스크리닝 노력과 납 분해자의 보다 신속한 식별을 가능하게 합니다.
이 프로토콜은 HiBiT CRISPR 세포주와 함께 분해 화합물을 연구하도록 설계되었습니다. 수많은 표적에 대한 HiBiT CRISPR 삽입의 생성을 위한 프로토콜은 최근의 여러 간행물18,19,20에 요약되어 있다.

<table><tbody><tr><td>CellTiter-Glo 2.0 reagent</td><td>Promega</td><td>G9241</td><td>Cell Viability luminescent assay</td></tr><tr><td>CellTiter-Fluor Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G6080</td><td>Cell Viability fluorescent assay</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-independent medium</td><td>ThermoFisher</td><td>18045-088</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>For compound dilution and control</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Seradigm</td><td>89510-194</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>HEK293 LgBiT stable cell line</td><td>Promega</td><td>N2672</td><td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td></tr><tr><td>HiBiT CRISPR mammalian cell line</td><td>Promega</td><td></td><td>&lt;u&gt;https://www.promega.com/crispr-tpd&lt;/u&gt;</td></tr><tr><td>Hygromycin B solution</td><td>Gibco</td><td>10-687-010</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>LgBiT BacMam</td><td>Promega</td><td>CS1956C01</td><td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td></tr><tr><td>LgBiT Expression Vector</td><td>Promega</td><td>N2681</td><td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td></tr><tr><td>Luminometer Plate Reader</td><td></td><td></td><td>Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td></tr><tr><td>NanoGlo Endurazine live cell substrate</td><td>Promega</td><td>N2570</td><td>Kinetic HiBiT reagent</td></tr><tr><td>NanoGlo Vivazine live cell substrate</td><td>Promega</td><td>N2580</td><td>Kinetic HiBiT reagent</td></tr><tr><td>NanoGlo HiBiT Lytic Detection system</td><td>Promega</td><td>N3030</td><td>Enpoint lytic HiBiT reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td><td>ThermoFisher</td><td>11058-021</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Tissue culture plates, white, 96 well plate</td><td>Costar</td><td>3917</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Tissue culture plates, white, 384 well plate</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td>Cell culture</td></tr></tbody></table>

high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines

분자 접착제 또는 단백질 분해 표적 키메라를 포함한 표적 단백질 분해 화합물은 소분자 약물 발견에서 흥미로운 새로운 치료 방식입니다. 이 종류의 화합물은 유비퀴틴-프로테아좀 경로(UPP)를 통해 유비퀴타이닝하고 궁극적으로 표적 단백질을 분해하는 데 필요한 E3 리가아제 기계 단백질을 근접하게 가져와 단백질 분해를 유도합니다. 그러나 고처리량 방식으로 표적 단백질 분해를 프로파일링하는 것은 분해를 달성하는 데 필요한 세포 경로의 복잡성을 고려할 때 여전히 매우 어렵습니다. 여기에서는 발광 단백질을 생성하기 위해 LgBiT 단백질에 대한 높은 친화도를 보완하는 11개 아미노산 HiBiT 태그와 함께 표적 단백질의 CRISPR/Cas9 내인성 태깅을 사용하는 프로토콜 및 스크리닝 전략을 제시합니다. 내인성 태그가 있는 이러한 CRISPR 표적 세포주는 발광판 기반 리더를 사용하여 발광 신호를 모니터링하여 실시간, 키네틱 라이브 셀 또는 종말점 용해 모드에서 화합물 유도 분해를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 다양한 형식에 대해 권장되는 스크리닝 프로토콜을 간략하게 설명하고 속도, Dmax, DC 50, Dmax50의 주요 분해 매개 변수 계산 및 세포 생존율 분석을 통한 멀티플렉싱에 대해서도 설명합니다. 이러한 접근법은 초기 단계 화합물의 신속한 발견 및 분류를 가능하게 하는 동시에 관련 세포 배경에서 표적 단백질의 내인성 발현 및 조절을 유지하여 선도 치료 화합물의 효율적인 최적화를 가능하게 합니다.

단일 농도 종말점 용균 분해 분석을 입증하기 위해, 여러 CDK 표적 단백질; CDK2, CDK4, CDK7 및 CDK10을 HEK293 세포의 C-말단에서 HiBiT로 내인성으로 태그하고, 1μM 농도의 범키나제 대뇌 기반 PROTAC, TL12-18654 로 처리하였다(도 1A). CDK 단백질의 수준을 상이한 시점에서 측정하고, DMSO 대조군에 대한 분획 RLU를 결정하였다(도 1A). 각각의 CDK 단백질은 화합물 처리 및 다양한 시점에 반응하여 상이한 정도의 분해를 보였다(도 1A). CDK 단백질이 단백질 손실 측면에서 서로 직접 비교되는 방법을 이해하기 위해 그림 1A 의 분획 RLU를 총 분해 %로 계산하고 그림 1B의 각 시점에 대해 플롯했습니다. 이는 초기 시점인 2시간 또는 4시간에도 일부 CDK 패밀리 구성원이 시간이 지남에 따라 계속 상승하는 높은 수준의 분해를 보인다는 것을 보여줍니다(그림 1B).
동역학 분해 분석을 입증하기 위해, 각각의 BET 패밀리 멤버 단백질; BRD2, BRD3, 및 BRD4는 LgBiT 단백질18을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포의 N-말단에서 HiBiT로 내인성으로 태그되었습니다. 이어서, 이들은 세 가지 상이한 농도의 범-BET PROTACs로 처리하였다; 대뇌 기반 dBET650 (그림 2A) 및 VHL 기반 ARV-77141 (그림 2B). 운동 측정은 24 시간 기간에 걸쳐 수집되었으며, 각 농도의 프로파일로부터, BET 패밀리 구성원 반응의 차이는 쉽게 명백하다. 분해 후 화합물 처리 (그림 2A, B)보다 신속한 회복 반응을 시작하는 BRD2의 능력은 이전에 다른 pan-BET PROTAC에서 관찰되었으며, 분해 과정18에 경쟁적인 전사 피드백 반응 때문일 가능성이 높습니다.
종말점 및 동역학 분석 모두 전체 화합물 용량 반응 치료로 수행할 수 있습니다. 도 3에 나타낸 것은 4개의 상이한 분자 글루 화합물 2,26,55,57로 LgBiT 단백질을 안정적으로 발현하는 이카로스/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat 세포의 처리의 키네틱 용량 반응 분해 프로파일이다; 레날리도마이드(그림 3A), 이베르도마이드(CC-220)(그림 3B), 탈리도마이드(그림 3C) 및 포말리도마이드(그림 3D). 이러한 분해제는 화합물 간뿐만 아니라 농도 계열 전반에 걸쳐 분해 반응에서 상당한 차이를 보여줍니다(그림 3).
분해를 정량적으로 평가하고 그림 3의 화합물 순위를 매기기 위해 용량 반응 프로파일을 사용하여 분해 속도(그림 4A), Dmax(그림 4B) 및 Dmax50 값(그림 4B)을 포함한 주요 분해 파라미터를 계산했습니다. 이러한 분석은 이베르도마이드(CC-220)와 포말리도마이드가 매우 유사한 빠른 초기 분해 속도를 갖지만(그림 4A), 이베르도마이드(CC-220)는 이전에 직교 연구55,57(그림 4B)에서 볼 수 있었던 것처럼 가장 높은 효능을 가지고 있음을 보여줍니다. 이베르도마이드는 이러한 높은 효능을 나타내고 테스트된 모든 농도는 50% 이상의 분해를 나타내기 때문에 Iberdomide에 대해 얻은 Dmax50 값은 데이터를 정확하게 피팅하는 데 있어 한계에 기초한 추정치를 나타냅니다. 그림 3C, D 및 그림 4B의 그래프에서 레날리도마이드와 탈리도마이드는 Ikaros/IKZF1 표적을 테스트된 최고 농도에서 완료로 저하시키지 않습니다. 탈리도마이드에서 관찰된 분해가 거의 없기 때문에 분해 흔적을 지수 붕괴 모델에 정확하게 맞출 수 없었으므로 이 처리에 대해 분해 속도를 정량화하지 못했습니다. 가장 강력한 분해제의 경우 이베르도마이드(CC-220)55,57(그림 4B). 세포 생존율 멀티플렉스 분석은 시험된 농도에 대해 세포 생존율의 손실을 나타내지 않았다(도 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg"> 그림 1: 범키나아제 PROTAC, TL12-18654를 사용한 CDK 종점 분해 및 독성. (A) CRISPR/Cas9를 통해 C-말단에서 HiBiT와 융합된 내인성 CDK 표적 단백질의 패널을 선택하고 2시간, 4시간, 8시간 및 24시간 처리에서 1μM TL12-186 PROTAC54 로 분해를 평가했습니다. 값은 각 시점에서 측정된 DMSO 대조군에 대한 분수 RLU로 표시됩니다. 오차 막대는 3번의 기술 반복실험 평균의 SD를 나타냅니다. (B) 2, 4, 8, 및 24h 시점에서 관찰된 각 패밀리 구성원의 분해량을 나타내는 (A)로부터 계산된 CDK 표적 단백질의 패널의 분해 백분율. 오차 막대는 3번의 기술 반복실험 평균의 SD를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg"> 그림 2: BET 분해인자, dBET650 및 ARV-77141을 사용한 BET 패밀리 구성원의 동역학 분해 선택성 프로파일링. 1 nM (왼쪽), 10 nM (중간) 또는 100 nM (오른쪽) dBET650 (A) 또는 ARV-77141 (B) PROTAC의 단일 농도의 처리와 함께 CRISPR / Cas9를 통해 N- 말단에 HiBiT로 태그가 지정된 내인성 BET 패밀리 구성원 BRD2, BRD3 및 BRD4의 동역학 분해 프로파일. 값은 각 동역학 시점에서 DMSO 대조군으로부터 계산된 분수 RLU로서 표현된다. 오차 막대는 4번의 기술 반복실험 평균의 SD를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg"> 그림 3: 분자 접착제 패널 2,26,55,57을 사용한 Ikaros/IKZF1-HiBiT의 라이브 셀 동역학 분해 용량 반응 프로필. LgBiT 단백질을 안정적으로 발현하는 Jurkat 세포는 CRISPR/Cas9를 사용하여 이카로스/IKZF1의 C-말단에 HiBiT 펩타이드를 태그하도록 조작되었습니다. 세포를 4개의 상이한 분자 글루 화합물 2,26,55,57의 DMSO를 포함하는 8점 용량 반응 농도 시리즈로 처리하였다: (A) 레날리도마이드, (B) 이베르도마이드 (CC-220), (C) 탈리도마이드, 또는 (D) 포말리도미드. 발광은 총 19.5시간 동안 5분마다 측정되었습니다. (A-D)로부터의 상대 광 단위(RLU) 데이터는 단계 2.4.1에 설명된 바와 같이 분수 RLU로 변환되고 시간의 함수로서 그래프화되었다. 오차 막대는 3개의 기술 반복실험의 SD를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg"> 그림 4: Ikaros/IKZF1-HiBiT에 대한 분해 속도 및 Dmax50 계산 및 다중화 세포 상태 분석. 도 3으로부터의 운동 분해 데이터를 정량적 분해 파라미터를 계산하는데 사용하였다. (A) 분해 속도 및 (B) 분해 최대값(Dmax)은 지시된 글루 화합물 2,26,55,57에 대한 각각의 약물 농도에서 그래프로 표시된다. (b) 각 화합물에 대한 Dmax50 값은 1의 제약된 힐 기울기를 갖는 용량-반응 모델을 사용하여 계산되었으며, 이는 표적에 대한 분해 화합물의 순위를 매기는 데 사용될 수 있다. (c) 도 3B로부터의 이베르도마이드 (CC-220)55,57 분해 용량 반응을 이용한 세포 생존율 분석은 동역학 분해 측정의 완료시 종말점 측정으로서 수행되었다. 오차 막대는 3개의 기술 반복실험의 SD를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

이 프로토콜은 표적 단백질에 융합된 항체가 없는 내인성 단백질 검출 태그를 발현하기 위해 CRISPR/Cas9를 사용하여 조작된 살아있는 세포에서 단백질 분해 역학의 정량적 발광 검출을 설명합니다. 정량적 분해 파라미터, 속도, Dmax, DC 50 및 Dmax50을 계산하고 얻기 위한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.

HiBiT CRISPR 세포주를 사용한 표적 단백질 분해 화합물의 고처리량 세포 프로파일링

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

high-throughput-cellular-profiling-targeted-protein-degradation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.3K 조회수.  Promega Corporation. 이 프로토콜은 표적 단백질에 융합된 항체가 없는 내인성 단백질 검출 태그를 발현하기 위해 CRISPR/Cas9를 사용하여 조작된 살아있는 세포에서 단백질 분해 역학의 정량적 발광 검출을 설명합니다. 정량적 분해 파라미터, 속도, Dmax, DC 50 및 Dmax50을 계산하고 얻기 위한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.

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Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

연구

유전학

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene disruption, many of these studies have made use of complex gene knockout models. While these studies with knockout mice offer an elegant and time-tested system for investigating genotype-to-phenotype relationships, a rapid and scalable method for assessing candidate genes that play a role in AML cell proliferation or survival in AML models will help accelerate the parallel interrogation of multiple candidate genes. Recent advances in genome-editing technologies have dramatically enhanced our ability to perform genetic perturbations at an unprecedented scale. One such system of genome editing is the CRISPR-Cas9-based method that can be used to make rapid and efficacious alterations in the target cell genome. The ease and scalability of CRISPR/Cas9-mediated gene-deletion makes it one of the most attractive techniques for the interrogation of a large number of genes in phenotypic assays. Here, we present a simple assay using CRISPR/Cas9 mediated gene-disruption combined with high-throughput flow-cytometry-based competition assays to investigate the role of genes that may play an important role in the proliferation or survival of human and murine AML cell lines.

This manuscript describes a Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) CRISPR-Cas9-based method for simple and expeditious investigation of the role of multiple candidate genes in Acute Myeloid Leukemia (AML) cell proliferation in parallel. This technique is scalable and can be applied in other cancer cell lines as well.

CRISPR-Cas9-기반 경쟁 분석 실험을 사용 하 여 유전 종속성의 조사

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

암 연구학

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian cells, this technology represents a novel means to perform genome-wide genetic screens for functional genomics studies. Libraries of guide RNAs (sgRNA) targeting all open reading frames permit the facile generation of thousands of genetic perturbations in a single pool of cells that can be screened for specific phenotypes to implicate gene function and cellular processes in an unbiased and systematic way. CRISPR-Cas screens provide researchers with a simple, efficient, and inexpensive method to uncover the genetic blueprints for cellular phenotypes. Furthermore, differential analysis of screens performed in various cell lines and from different cancer types can identify genes that are contextually essential in tumor cells, revealing potential targets for specific anticancer therapies. Performing genome-wide screens in human cells can be daunting, as this involves the handling of tens of millions of cells and requires analysis of large sets of data. The details of these screens, such as cell line characterization, CRISPR library considerations, and understanding the limitations and capabilities of CRISPR technology during analysis, are often overlooked. Provided here is a detailed protocol for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 based screens.

CRISPR-Cas9 technology provides an efficient method to precisely edit the mammalian genome in any cell type and represents a novel means to perform genome-wide genetic screens. A detailed protocol discussing the steps required for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 screens is provided here.

포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

CRISPR 중재 베이스 편집기사용 BRCA1 변종 기능 평가

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

생화학

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

생물학

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

인간 CRISPR-엔지니어링 CAR-T 셀 생산

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

면역학 및 감염병학

Electroporation-Based CRISPR-Cas9-Mediated Gene Knockout in THP-1 Cells and Single-Cell Clone Isolation

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including their interplay with significant human pathogens such as the human immunodeficiency virus (HIV). Compared to other immortalized cell lines of myeloid origin, THP-1 cells retain many intact inflammatory signaling pathways and display phenotypic characteristics that more closely resemble those of primary monocytes, including the ability to differentiate into macrophages when treated with phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA). The use of CRISPR-Cas9 technology to engineer THP-1 cells through targeted gene knockout (KO) provides a powerful approach to better characterize immune-related mechanisms, including virus-host interactions. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering using electroporation to deliver pre-assembled Cas9:sgRNA ribonucleoproteins into the cell nucleus. Using multiple sgRNAs targeting the same locus at slightly different positions results in the deletion of large DNA fragments, thereby increasing editing efficiency, as assessed by the T7 endonuclease I assay. CRISPR-Cas9-mediated editing at the genetic level was validated by Sanger sequencing followed by Inference of CRISPR Edits (ICE) analysis. Protein depletion was confirmed by immunoblotting coupled with a functional assay. Using this protocol, up to 100% indels in the targeted locus and a decrease of over 95% in protein expression were achieved. The high editing efficiency makes it convenient to isolate single-cell clones by limiting dilution.

The THP-1 cell line is widely used as a model to investigate the functions of human monocytes/macrophages across various biology-related research areas. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering and single-cell clone isolation, enabling the production of robust and reproducible phenotypic data.

THP-1 세포의 전기천공법 기반 CRISPR-Cas9 매개 유전자 녹아웃 및 단일 세포 클론 분리

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including ...