전압 에 민감한 염료를 가진 광학 기록 방법은 두뇌가 어떻게 작동하는지 시각화하는 이상적인 기술로 생각됩니다. 이 방법을 통해 우리는 12 시간 동안 안정적으로 신경 역학을 기록 할 수 있었습니다. 우리는 어머니에게 귀중한 산 응용 프로그램과 같은 개발의 모든 단계에서 화학 물질로 인한 회로 변화를 감지하기 위해 응용 프로그램을 확장하려고합니다.
이 기술은 이미 잘 확립되어 있습니다. 여기에 제시된 방법을 따라 연구를 재현해 보십시오. 이 절차를 시작하려면, 스테인레스 스틸 수술 트레이에 얼음 차가운 ACSF에 참수 머리를 몰입.
1 분 이내에 뇌를 추출하고 5 분 동안 차가운 ACSF를 포함하는 비커에 놓습니다. 다음으로, 메스와 미드 라인의 뇌 섹션을 분할하고 4 %의 천 블록에 두 반구를 배치합니다. 그런 다음 두 반구가 있는 뇌 블록을 4%의 한천 블록에 놓습니다.
필터 용지로 블록에서 초과 ACSF를 닦아냅니다. 그 후 진동 플랫폼에 슈퍼 접착제를 적용합니다. 한천 블록을 위에 놓고 필터 용지로 과도한 접착제를 닦아냅니다.
뇌 천 블록 상단에서 소량의 얼음 차가운 ACSF를 부드럽게 적용하여 과도한 초접착제를 고화시키고 접착제가 뇌를 덮고 슬라이스를 방해하지 않도록 합니다. 그 후, 진동 트레이에 플랫폼을 수정하고 수정 된 ACSF를 부어. 진동을 느린 속도로 설정하고 블레이드 주파수를 최대 설정으로 설정합니다.
그런 다음 슬라이스를 시작합니다. 슬라이스 챔버의 순서를 쉽게 구별할 수 있도록 슬라이스 챔버의 모서리에 슬라이스를 순서대로 배치합니다. 일반적으로 3~5개의 슬라이스는 한 반구에서 얻을 수 있다.
다음으로, 30 게이지 바늘을 사용하여 뇌 줄기 부분을 잘라. 작은 기울어진 페인트 브러시를 사용하여 플렉시글라스 링으로 유지되는 멤브레인 필터에 슬라이스를 놓습니다. 고리를 습한 복구 챔버에 놓고 커버를 고정하여 내부 압력을 높게 유지합니다.
슬라이스를 멤브레인 필터에 배치할 때 링 내의 슬라이스의 방향과 위치를 조정하여 잘 중심이 되고 일관된 방향을 갖습니다. 표본을 섭씨 28도에서 30분 간 방치한 다음 실온에서 회복을 위해 최소 10~30분 간 둡니다. 슬라이스를 염색하려면 스테인링 솔루션 100마이크로리터를 각 슬라이스에 부드럽게 바르고 실온을 위해 20분 만에 배양합니다.
다음으로 컨테이너에 50~100밀리리터의 ACSF를 준비합니다. 얼룩액을 헹구기 위해 시편과 링을 놓습니다. 그런 다음 헹도 된 조각을 다른 인큐베이션 챔버로 옮기습니다.
실험 전에 복구를 위해 1시간 이상 기다립니다. 이 절차를 시작하려면 앰프, 컴퓨터 및 카메라 시스템을 켜고 소프트웨어를 엽니다. 50 밀리리터 튜브에 ACSF를 붓고 카보겐으로 거품을 냅니다.
연동 펌프를 사용하여 ACSF를 순환시키고 유량을 분당 약 1밀리리터로 조정합니다. 그런 다음, 실험 챔버 내부의 액체 수준이 항상 일정하게 되도록 흡입 파이펫의 높이를 조정합니다. 접지 전극을 챔버에 놓습니다.
그 후, 소량의 ACSF로 유리 전극을 채우고 전극 홀더에 놓습니다. 홀더를 조작자의 막대에 부착합니다. 앰프를 사용하여 전극 저항이 약 1 메가옴인지 확인합니다.
레코딩 세션에서, 습한 챔버에서 실험 챔버로 슬라이스를 전송한다. 링 의 가장자리를 실리콘 o 링에 단단히 누릅니다. 실험 챔버의 막 이나 바닥을 부러 뜨리지 않도록주의하십시오.
현미경의 밑에 자극전극의 끝과 필드 잠재적 기록 전극을 슬라이스에 놓습니다. 자극을 제공하여 호출된 응답을 확인합니다. 시야가 광학 기록 시스템의 오른쪽 신경 회로를 커버하는지 확인합니다.
다음으로, 카메라의 최대 용량의 약 70~80%로 흥분광 강도를 조정합니다. 형광광원을 사용하여 획득 시스템으로 초점을 조정합니다. 그런 다음 수집 후 이미지 수집 소프트웨어에서 레코딩을 시작하고 데이터를 분석합니다.
이 그림은 마우스 해마 슬라이스의 영역 CA1에서 샤퍼 콜라탈롤의 전기 자극시 대표적인 광학 신호를 나타낸다. 이러한 연속 이미지는 간격 및 측두엽 필터가 적용되기 전에 광학 신호를 나타내며, 이러한 이미지는 5x 5 입방 필터를 두 번 적용한 후 동일한 데이터를 표시합니다. 높은 프레임 속도와 높은 공간 해상도로 인해 필터의 적용은 신호를 변경하지 않았지만 단일 평가판에서 픽셀로 기록된 시간 코스에서 관찰할 수 있는 노이즈를 필터링했습니다.
다음은 마우스와 쥐 사이의 해마 슬라이스의 영역 CA1의 전형적인 반응의 비교입니다. 작은 과극 반응은 마우스 해마 슬라이스에서 24 밀리초 후에 CA1의 단상 측에서 관찰되지만, 더 거대한 과극화 반응은 쥐 해마 슬라이스에서 탈극반응을 추월했다. 슬라이스가 염색되면 12 시간 이상 지속되어야하며 다른 전기 생리학적 기록을 수행 할 수 있습니다.
