Name: optogenetic activation of afferent pathways in brain slices and modulation of responses by volatile anesthetics
Uploaded: 2020-07-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics at JoVE.com

저자는이 프로젝트에 대한 기술 지원 및 지침에 대해 Bryan Krause에게 감사드립니다.
이 연구는 국제 마취 연구 학회 (IMRA에서 AR), 국립 보건원 (R01 GM109086에서 MIB) 및 미국 위스콘신 주 매디슨에있는 위스콘신 대학교 의과 대학 마취학과의 지원을 받았습니다.

<ol>
	<li>Baumgart, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+inhibits+synaptic+vesicle+exocytosis+through+reduced+Ca2++influx,+not+Ca2+-exocytosis+coupling.">Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).</li><li>Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+inhibits+the+neurotransmitter+release+machinery.">Isoflurane inhibits the neurotransmitter release machinery.</a> Journal of Neurophysiology. 102 (2), 1265-1273 (2009).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+anesthetics+with+neurotransmitter+release+machinery+proteins.">Interaction of anesthetics with neurotransmitter release machinery proteins.</a> Journal of Neurophysiology. 109 (3), 758-767 (2013).</li><li>Crick, F., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+consciousness.">A framework for consciousness.</a> Nature Neurosciences. 6 (2), 119-126 (2003).</li><li>Koch, C., Massimini, M., Boly, M., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+correlates+of+consciousness:+progress+and+problems.">Neural correlates of consciousness: progress and problems.</a> Nature Reviews Neurosciences. 17 (5), 307-321 (2016).</li><li>Dehaene, S., Changeux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+approaches+to+conscious+processing.">Experimental and theoretical approaches to conscious processing.</a> Neuron. 70 (2), 200-227 (2011).</li><li>Friston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theory+of+cortical+responses.">A theory of cortical responses.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 360 (1456), 815-836 (2005).</li><li>Mashour, G. A., Hudetz, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-Up+and+Top-Down+Mechanisms+of+General+Anesthetics+Modulate+Different+Dimensions+of+Consciousness.">Bottom-Up and Top-Down Mechanisms of General Anesthetics Modulate Different Dimensions of Consciousness.</a> Frontiers in Neural Circuits. 11, 44 (2017).</li><li>Voss, L. J., Garcia, P. S., Hentschke, H., Banks, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Effects+of+General+Anesthetics+on+Cortical+Network+Activity+Using+Ex+Vivo+Preparations.">Understanding the Effects of General Anesthetics on Cortical Network Activity Using Ex Vivo Preparations.</a> Anesthesiology. 130 (6), 1049-1063 (2019).</li><li>Redinbaugh, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamus+Modulates+Consciousness+Via+Layer-Specific+Control+of+Cortex.">Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex.</a> Neuron. 105 (4), 0896 (2020).</li><li>Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REBUS+and+the+Anarchic+Brain:+Toward+a+Unified+Model+of+the+Brain+Action+of+Psychedelics.">REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics.</a> Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).</li><li>Mak-McCully, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+cortical+and+thalamic+activity+during+non-REM+sleep+in+humans.">Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans.</a> Nature communications. 8 (1), 15499 (2017).</li><li>Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consciousness+and+anesthesia.">Consciousness and anesthesia.</a> Science. 322 (5903), 876-880 (2008).</li><li>Sanders, R. D., Maze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenergic+trespass+in+anesthetic+and+sedative+states.">Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states.</a> Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).</li><li>Hemmings, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+Comprehensive+Understanding+of+Anesthetic+Mechanisms+of+Action:+A+Decade+of+Discovery.">Towards a Comprehensive Understanding of Anesthetic Mechanisms of Action: A Decade of Discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 40 (7), 464-481 (2019).</li><li>Nourski, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+Predictive+Coding+across+Awareness+States+under+Anesthesia:+An+Intracranial+Electrophysiology+Study.">Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study.</a> Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propofol+disrupts+functional+interactions+between+sensory+and+high-order+processing+of+auditory+verbal+memory.">Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory.</a> Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).</li><li>Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+cortical+network+activity+by+the+general+anesthetic+isoflurane.">Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane.</a> British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).</li><li>Lee, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+frontal-parietal+communication+by+ketamine,+propofol,+and+sevoflurane.">Disruption of frontal-parietal communication by ketamine, propofol, and sevoflurane.</a> Anesthesiology. 118 (6), 1264-1275 (2013).</li><li>Ferrarelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+in+cortical+effective+connectivity+during+midazolam-induced+loss+of+consciousness.">Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).</li><li>Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+inhibition+of+frontal-to-parietal+feedback+connectivity+is+a+neurophysiologic+correlate+of+general+anesthesia+in+surgical+patients.">Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients.</a> PLoS.One. 6 (10), 25155 (2011).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+Properties+in+Transitions+of+Consciousness+during+Propofol-induced+Sedation.">Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16791 (2017).</li><li>Murphy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propofol+anesthesia+and+sleep:+a+high-density+EEG+study.">Propofol anesthesia and sleep: a high-density EEG study.</a> Sleep. 34 (3), 283-291 (2011).</li><li>Murphy, C., Krause, B., Banks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+of+isoflurane+on+cortico-cortical+feedback+afferent+responses+in+murine+non-primary+neocortex.">Selective effects of isoflurane on cortico-cortical feedback afferent responses in murine non-primary neocortex.</a> British Journal of Anaesthesiology. 123 (4), 488-496 (2019).</li><li>Raz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+effect+of+isoflurane+on+top-down+versus+bottom-up+pathways+in+sensory+cortex.">Preferential effect of isoflurane on top-down versus bottom-up pathways in sensory cortex.</a> Frontiers in System Neurosciences. 8, 191 (2014).</li><li>Schrouff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+functional+integration+decreases+during+propofol-induced+loss+of+consciousness.">Brain functional integration decreases during propofol-induced loss of consciousness.</a> Neuroimage. 57 (1), 198-205 (2011).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li><li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-Specific+Feedforward+Circuits+between+Thalamus+and+Neocortex+Revealed+by+Selective+Optical+Stimulation+of+Axons.">Pathway-Specific Feedforward Circuits between Thalamus and Neocortex Revealed by Selective Optical Stimulation of Axons.</a> Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).</li><li>Gredell, J. A., Turnquist, P. A., MacIver, M. B., Pearce, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+diffusion+and+partition+coefficients+of+propofol+in+rat+brain+tissue:+implications+for+studies+of+drug+action+in+vitro.">Determination of diffusion and partition coefficients of propofol in rat brain tissue: implications for studies of drug action in vitro.</a> BJA: British Journal of Anaesthesia. 93 (6), 810-817 (2004).</li><li>Benkwitz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+EC50+amnesic+concentration+of+etomidate+and+its+diffusion+profile+in+brain+tissue:+implications+for+in+vitro+studies.">Determination of the EC50 amnesic concentration of etomidate and its diffusion profile in brain tissue: implications for in vitro studies.</a> Anesthesiology. 106 (1), 114-123 (2007).</li><li>Franks, N. P., Lieb, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+actions+of+volatile+general+anaesthetics+at+molecular+and+cellular+levels.">Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels.</a> British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).</li><li>Honemann, C. W., Washington, J., Honemann, M. C., Nietgen, G. W., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partition+coefficients+of+volatile+anesthetics+in+aqueous+electrolyte+solutions+at+various+temperatures.">Partition coefficients of volatile anesthetics in aqueous electrolyte solutions at various temperatures.</a> Anesthesiology. 89 (4), 1032-1035 (1998).</li><li>Au - Segev, A., Au - Garcia-Oscos, F., Au - Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li><li>Lin, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+guide+to+channelrhodopsin+variants:+features,+limitations+and+future+developments.">A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments.</a> Experimental Physiology. 96 (1), 19-25 (2011).</li><li>Banks, M. I., Pearce, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+actions+of+volatile+anesthetics+on+GABAA+IPSCs:+dissociation+of+blocking+and+prolonging+effects.">Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects.</a> Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).</li><li>Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+measures+of+volatile+anesthetics+in+the+aqueous+phase+using+calcium+sensitive+electrodes.">Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 원고에서는 생체 외 뇌 절편에서 선택적으로 활성화 된 구 심성 경로에 대한 세포 내 및 세포 외 반응을 평가하기위한 프로토콜이 설명됩니다.
광유전학적 도구와 병렬 기록 체계를 사용하면 조사관이 먼 뇌 영역의 구심성 입력에 대한 지역 인구의 반응을 조사하는 동시에 표적 인터뉴런 개체군에서 동시에 기록할 수 있습니다. 광유전학 기술을 사용하면 구심성 돌출부의 축삭 말단이 세포체가 더 이상 부착되지 않더라도 보존되고 활성화될 수 있습니다. 이는 장거리 전기 연결의 보존이 더 이상 중요하지 않기 때문에 이전에 생체 외 슬라이스에 부과된 기하학적 제한을 완화합니다. 그러나 나머지 관심 연결을 보존하는 기하학적 평면에서 슬라이스를 준비하는 데 주의를 기울여야 합니다. 예를 들어, 피라미드 세포는 피질 기둥을 따라 수직으로 배향되고, 이들 실험에서 다중채널 프로브에 의해 측정된 유도된 네트워크 활동은 가능한 한 많이 보존되어야 하는 이러한 국부적 연결을 필요로 한다. 따라서 로컬 연결을 그대로 유지하기 위해 코로나 슬라이스가 준비되었습니다.
광유전학적 구조물 및 관련 형광 리포터 단백질을 선택할 때, 여기/방출 스펙트럼 및 현미경 광학의 특성을 고려해야 합니다. 지속적인 광 자극은 많은 채널로돕신 변이체(34)의 부분적인 불활성화를 초래할 수 있으며, 이는 여기 스펙트럼이 옵신의 그것과 중첩되지 않는 리포터 단백질을 선택함으로써 회피할 수 있다. 상이한 동역학 또는 광 민감성을 갖는 대안적인 변이체는 또한 대안적인 흥분성 또는 억제성 옵신을 사용한 조작을 포함하는 실험 패러다임(35)에 따라 선택될 수 있다. 필터 큐브는 또한 선택된 형광 리포터와 적절하게 정렬되어야 하며, 따라서 구심성 축삭 말단 또는 인터뉴런이 독립적으로 그리고 발현된 옵신을 활성화하지 않고 이미징될 수 있습니다. 바이러스 발현의 가변성을 설명하기 위해, 조사자가 리포터 단백질의 형광 출력에 의해 측정된, 임의의 광유전학적으로 유도된 활성을 바이러스 작제물의 발현 수준으로 정규화하는 것도 적절할 수 있다.
조직 절개에 대한 휘발성 마취제의 사전 계산된 농도의 전달은 여기에 설명된 방법을 사용하여 가능합니다. 적절한 생리학적으로 관련된 가스 평형 백분율을 선택할 때, 조사자는 관류 라인과 조직 사이의 용존 이소플루란 가스의 10-15% 손실을 설명해야 한다(36). 이소플루란에 적용할 수 있는 방법이 제시되었지만, 할로탄, 세보플루란 또는 데스플루란과 같은 다른 약물은 적절한 오스트발트 및 분젠 계수를 사용하여 유사하게 취급될 수 있다(보충 표 1). 휘발성 마취제의 분할 특성은 ACSF에 예측 가능하게 용해되도록 보장합니다. 그러나, 분압은 수성EC50 농도(37)보다 온도 변화에 더 민감하기 때문에, 휘발성 마취제의 가스 평형 부피 백분율은 관찰된 효과를 생체내에서 생리학적으로 관련된 투여량과 비교하기 위해 예측된 실온 밀리몰 농도로 변환되어야 한다. 뇌 조각에서 에토미데이트 또는 프로포폴과 같은 정맥 마취제를 연구하기로 선택한 경우, 평형 시간과 생리학적 관련 농도가 크게 다를 수 있으므로 연구자는 연구 중인 약물의 확산 프로파일을 고려해야 합니다.30.
이 원고에서는 생체 외 뇌 조각에서 시상 피질 회로의 별개의 구성 요소에 대한 휘발성 마취제의 효과를 테스트하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 설명 된 방법의 많은 변수와 매개 변수는 추가 조사를 위해 조작 될 수 있습니다. 예를 들어, 상이한 뇌 영역, 구심성 경로, 세포 표적 또는 휘발성 마취제는 새로운 질문에 답하기 위해 개략적인 방법을 적용함으로써 연구될 수 있다. 다른 이론 및 실험 방법과 결합하여 생체 외 뇌 조각을 사용하여 고유 한 세포 및 네트워크 구성 요소를 연구하면 동적 뇌에 대한 이해와 의식의 약리학 적 및 병리 생리 학적 변화 동안 겪는 변화에 대한 이해가 향상됩니다.

휘발성 마취제는 한 세기 이상 동안 다양한 임상 및 학술 환경에서 유비쿼터스하게 사용되어 왔습니다. 뚜렷한 종류의 마취제는 독특하고 종종 겹치지 않는 분자 표적 1,2,3을 가지고 있지만 거의 모두 무의식을 생성합니다. 그들의 행동 효과는 상당히 예측 가능하지만 마취제가 의식 상실을 유도하는 메커니즘은 거의 알려져 있지 않습니다. 마취제는 궁극적으로 피질 시상 회로에 대한 작용을 통해 의식의 수준과 내용 모두에 영향을 미쳐 피질 계층구조 4,5,6,7,8,9 전반에 걸친 정보 통합을 방해 할 수 있습니다. 보다 광범위하게는, 피질 시상 회로의 조절은 실험적으로10 또는 약리학적으로11 변화된 의식 상태에서 역할을 할 수 있으며, 또한 수면12 및 의식의 병태생리학적 장애(13,14)에 연루될 수 있다.
마취 중 의식 상실 및 복귀의 기저에 있는 메커니즘의 파악하기 어려운 것은 부분적으로 세포, 네트워크 및 시스템 수준15에서 마취제의 비선형적이고 시너지 효과가 있는 작용에 기인할 수 있습니다. 예를 들어, 이소플루란은 선택된 뇌 영역 내의 활동을 억제하고(16,17,18), 먼 뇌 영역(19,20,21,22,23) 사이의 연결을 손상시키며, 경로 특이적 방식으로 시냅스 반응을 감소시킨다(24,25) . 분자에서 시스템 수준에 이르기까지 마취제의 어떤 효과가 의식 상실에 영향을 미치기에 필요하거나 충분한지는 불분명하다. 비 침습적 기술 19,20,26을 사용한 의식에 대한 실질적인 임상 조사 외에도 실험자는 의식 경험을 서브 서브 한 뚜렷한 세포 및 네트워크 상호 작용을 풀려고 노력하는 것이 중요합니다.
손상되지 않은 뇌에서 발견되는 복잡한 상호 작용을 단순화함으로써 생체 외 뇌 조각은 뇌의 동적 시스템의 고립 된 구성 요소를 연구 할 수있게합니다9. 감소된 슬라이스 준비는 국소 신경 회로의 비교적 손상되지 않은 해부학적 구조의 이점과 체외 조작의 다양성을 결합합니다. 그러나 최근까지 방법 론적 제약으로 인해 뇌 조각에서 장거리 입력의 시냅스 및 회로 특성에 대한 연구가 배제되었습니다27,28; 코르티코시상 섬유 관의 구불구불한 경로는 전기 자극에 의해 독립적인 구심성 경로의 활성화를 거의 불가능하게 만들었습니다.
뇌 슬라이스 준비에 대한 마취제의 효과를 조사하는 것은 추가적인 과제를 제시합니다. 온전한 호흡기 및 순환계가 없으면 마취제를 목욕에 적용해야 하며 농도는 추정된 효과 부위 농도와 신중하게 일치해야 합니다. 많은 정맥 마취제의 경우 조직의 느린 평형 속도로 인해 전통적인 약리학 적 조사가 힘들어집니다29,30. 생체 외 제제에서 휘발성 가스 마취제의 효과를 조사하는 것은 더 다루기 쉽지만 도전 과제도 제시합니다. 이들은 흡입된 분압 선량을 수성 농도로 전환시키는 것, 및 인공 뇌 척수액(31)을 통해 조직으로의 약물의 변형된 전달 시스템의 필요성을 포함한다.
여기에서는 연구자가 생체 외 뇌 절편으로의 약물 전달을 위해 휘발성 마취 이소플루란의 잘 문서화된 물리화학적 특성을 활용하고, 높은 시공간 해상도로 관심 피질 영역에 대한 경로 및 층별 입력을 활성화하고, 선택된 뉴런 집단에서 동시 층류 기록 및 표적 패치 클램프 기록을 수행할 수 있는 방법이 설명됩니다. 이러한 절차를 결합하여 조사자는 시냅스에서 로컬 네트워크 수준에 이르기까지 여러 관찰 가능한 전기 생리 학적 반응 특성에서 휘발성 마취제로 인한 변화를 측정 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2.5x broadfield objective lens</td><td>Olympus</td><td>MPLFLN2.5X</td><td></td></tr><tr><td>40x water immersion objective lens</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>95% O2/5% CO2 mixture</td><td>Airgas</td><td>Z02OX95R2003045</td><td></td></tr><tr><td>A16 probe</td><td>NeuroNexus</td><td>A16x1-2mm-100-177-A16</td><td>16-channel probe</td></tr><tr><td>AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP</td><td>Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthetic gas monitor (POET II)</td><td>Criticare</td><td>602-3A</td><td></td></tr><tr><td>ATP, Magnesium Salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td>intracellular solution</td></tr><tr><td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>007914</td><td>Cre-dependent tdTomato mouse</td></tr><tr><td>B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>008069</td><td>PV-Cre mouse</td></tr><tr><td>Belly Dancer Shaker</td><td>Thomas Scientific</td><td>1210H86-TS</td><td>for equilibration of sealed gas bags</td></tr><tr><td>Betadine solution</td><td>Generic brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Generic brand</td><td></td><td>for silver chloriding patch clamp electrode</td></tr><tr><td>Bupivicaine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride (CaCl2)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSC20010</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Capillary glass (patch clamp recordings)</td><td>King Precision Glass, Inc.</td><td>KG-33</td><td>Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm</td></tr><tr><td>Capillary glass (viral injections)</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>3.5&quot;</td></tr><tr><td>Control of junior micromanipulator</td><td>Luigs and Neumann</td><td>SM8</td><td>for control of junior micromanipulator</td></tr><tr><td>Control of manipulators and shifting table</td><td>Luigs and Neumann</td><td>SM7</td><td>for control of multichannel electrode and shifting table</td></tr><tr><td>Digidata 1440A + Clampex 10</td><td>Molecular Devices</td><td>1440A</td><td>Digitizer and software</td></tr><tr><td>E-3603 tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>14171208</td><td>for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Dot Scientific</td><td>DSE57060</td><td>intracellular solution</td></tr><tr><td>ERP-27 EEG Reference/Patch Panel</td><td>Neuralynx</td><td>Retired</td><td></td></tr><tr><td>Filling needle</td><td>World Precision Instruments</td><td>50821912</td><td>for filling patch clamp pipettes</td></tr><tr><td>Filter cube for imaging EYFP</td><td>Olympus</td><td>U-MRFPHQ</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>09801E</td><td>lay over slice template during preparation of tissue block</td></tr><tr><td>Flaming/Brown micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>2.5x2.5 Box filament</td></tr><tr><td>Gas dispersion tube</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3953312C</td><td></td></tr><tr><td>Glass syringe (100 mL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z314390</td><td>for filling gas-sealed bags</td></tr><tr><td>Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSG37020</td><td>intracellular solution</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Dot Scientific</td><td>DSG32040</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>GTP, Sodium Salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8877</td><td>intracellular solution</td></tr><tr><td>Headstage-probe adaptor</td><td>NeuroNexus</td><td>A16-OM16</td><td>adaptor to connect 16-channel probe to headstage input</td></tr><tr><td>Hemostatic Forceps</td><td>VWR International</td><td>76192-096</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Dot Scientific</td><td>DSH75030</td><td>ACSF,intracellular solution</td></tr><tr><td>HS-16 Headstage</td><td>Neuralynx</td><td>Retired</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol (70%)</td><td>VWR International</td><td>101223-746</td><td></td></tr><tr><td>Junior micromanipulator</td><td>Luigs and Neumann</td><td>210-100 000 0090-R</td><td>for manipulation of patch clamp electrode</td></tr><tr><td>LED Light Source Control Module</td><td>Mightex</td><td>BLS-PL02_US</td><td>optogenetic light source control</td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lynx-8 Amplifier</td><td>Neuralynx</td><td>Retired</td><td></td></tr><tr><td>Lynx-8 Power Supply</td><td>Neuralynx</td><td>Retired</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate (MgSO4)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSM24300</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>mCherry, Texas Red filter cube</td><td>Chroma</td><td>49008</td><td>for imaging tdTomato fluorescent reporter</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette holder</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9044962</td><td></td></tr><tr><td>Microsyringe pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-4</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Generic brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700A</td><td>Molecular Devices/Axon Instruments</td><td>700A</td><td>Amplifier</td></tr><tr><td>Nitrogen (for air table)</td><td>Airgas</td><td>NI200</td><td></td></tr><tr><td>Nylon mesh</td><td>Fisher Scientific</td><td>501460083</td><td>stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings</td></tr><tr><td>Nylon, cut from pantyhose</td><td>Generic brand</td><td></td><td>small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp</td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1697520</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Dot Scientific</td><td>307</td><td>For transferring tissue to rig</td></tr><tr><td>Platinum wire</td><td>VWR International</td><td>BT124000</td><td>2 cm, flattened, to make platinum harp</td></tr><tr><td>Polygon400</td><td>Mightex</td><td>DSI-E-0470-0617-000</td><td>optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSP41000</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Potassium Phosphate (KH2PO4)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSP41200</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Sapphire blade (for vibratome)</td><td>VWR International</td><td>100492-502</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-361445</td><td></td></tr><tr><td>Sealed gas bag</td><td>Fisher Scientific</td><td>109236</td><td></td></tr><tr><td>Shifting table for microscope</td><td>Luigs and Neumann</td><td>380FMU</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate (HCO3-)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSS22060</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSS23020</td><td>ACSF, intracellular solution</td></tr><tr><td>Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>013044</td><td>SOM-Cre mouse</td></tr><tr><td>Stereotaxic instrument</td><td>Kopf</td><td>Model 902</td><td>Dual Small Animal</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Staples</td><td>886833</td><td>to fix tissue block to specimen stage during slice preparation</td></tr><tr><td>Surgical drill</td><td>RAM Products Inc.</td><td>DIGITALMICROTORQUE</td><td>Microtorque II</td></tr><tr><td>Syringe (1 mL) with LuerLock tip</td><td>Fisher Scientific</td><td>309628</td><td>for application of pressure during patch clamping</td></tr><tr><td>Syringe (1 mL) with slip tip</td><td>WW Grainger, Inc.</td><td>19G384</td><td>for filling patch clamp pipettes</td></tr><tr><td>Syringe Filters</td><td>VWR International</td><td>66064-414</td><td></td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Wypall towels</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-042-427</td><td></td></tr></tbody></table>

optogenetic activation of afferent pathways in brain slices and modulation of responses by volatile anesthetics

마취제는 부분적으로 시상 피질 회로에 대한 행동을 통해 의식에 영향을 미칩니다. 그러나 휘발성 마취제가 이러한 회로의 별개의 세포 및 네트워크 구성 요소에 영향을 미치는 정도는 불분명합니다. 생체 외 뇌 조각은 조사자가 복잡한 네트워크의 개별 구성 요소를 조사하고 유발 된 반응에 대한 휘발성 마취제의 효과의 기저에있는 잠재적 메커니즘을 풀 수있는 수단을 제공합니다. 뇌 절편에서 잠재적인 세포 유형 및 경로 특이적 약물 효과를 분리하려면 조사자가 구심성 섬유 경로를 독립적으로 활성화하고, 겹치지 않는 세포 집단을 식별하고, 수용액의 조직에 휘발성 마취제를 적용할 수 있어야 합니다. 이 프로토콜에서는 생체 외 뇌 절편에서 신피질에 대한 두 개의 독립적 인 구 심성 경로에 대한 광유전 적으로 유발 된 반응을 측정하는 방법이 설명됩니다. 세포 외 반응은 분석 네트워크 활성에 대해 기록되고 표적화 된 전체 세포 패치 클램프 기록은 소마토스타틴 및 파브 알부민 양성 인터 뉴런에서 수행됩니다. 세포 및 네트워크 반응을 조절하기 위해 인공 뇌 척수액을 통한 생리학적으로 관련된 농도의 이소플루란의 전달이 설명된다.

프로토콜에 설명된 단계의 타임라인이 그림 1에 나와 있습니다. 고차 피질 영역 또는 비일차 시상 핵으로부터 도착하는 피질 입력은 비일차 시각 피질(24)의 층 1에서 부분적으로 겹치는 말단 필드를 갖는다. 독립적인 시상피질 또는 피질피질 구심성 경로를 분리하기 위해 ChR2 및 eYFP 형광 리포터를 포함하는 바이러스 벡터를 Po 또는 Cg에 주입했습니다. 주사 반경 내의 세포는 바이러스 벡터를 흡수하고, 2-4주 후에, 비특이적 양이온 채널 ChR2 및 리포터를 체세포 및 돌출 축삭 모두에서 발현한다(도 2A). 관상 동맥 조각이 수집되었습니다. 적절한 필터 큐브가 결합되면 바이러스 구축물을 발현하는 축삭이 이미지화되었습니다(그림 2B). 축삭 말단을 활성화하기 위해 ChR2를 사용하면 부착 된 소마에 대한 전제 조건없이 구 심성을 활성화 할 수 있습니다.
여기에 설명된 실험에 사용된 동물은 각각 소마토스타틴-(SOM+) 또는 파브알부민 양성(PV+) 인터뉴런에서 형광 리포터 단백질 td토마토를 발현하는 SOM-td토마토 또는 PV-td토마토 잡종 동물이었습니다. 층 2/3의 SOM+ 또는 PV+ 인터뉴런은 적절한 필터 큐브가 결합된 시각적 안내 하에 패치 클램핑을 대상으로 했습니다(층 1C). 이 인터 뉴런은 1 층에 수상 돌기를 가지고 있으며 피질 피질 입력의 대상입니다 (그림 3A).
밀봉된 백에 125mL의 3.0% 이소플루란 가스 및 175mL의 95% O2/5%CO2를 첨가한 결과, 가스의 사전 평형 농도가 1.3%가 되었다. 분배 계수에 따라 eACSF에 용해 된 가스; 실온에서 이소플루란의 예측된 기상 평형 농도는 0.6%였다(그림 2D). 이것은 가스 모니터를 통해 확인되었습니다.
조직 슬라이스를 기록 챔버로 옮기고 16x1 다중 채널 기록 프로브를 피질 층에 직각으로 배치했습니다 (그림 2E). 대물 광 경로를 통해 피질 층 1을 중심으로 한 470nm 광의 150μm 원이 전달되었으며, 세포 외 전위는 16 x 1 다중 채널 프로브를 사용하여 수집되었으며 표적 전체 세포 패치 클램프 기록은 인터 뉴런에서 수행되었습니다. 녹화 설정의 개략도는 그림 2F에 나와 있습니다.
시냅스 후 전위 (PSP)는 4 개의 2ms 펄스 (10Hz; 그림 3A). 로컬 필드 전위도 기록되었습니다 (그림 3B). 전류 소스 밀도(CSD; 그림 3C) 및 다중 단위 활동 (MUA; 그림 3D) 지역 필드 잠재력에서 추출되었습니다. 사후 분석을 수행하기 위해 여러 가지 다른 광도에 대한 10건의 시험이 사용되었습니다. CSD에서 추출된 전류 싱크의 진폭은 광도의 함수로 증가했습니다(그림 4A). 3개 파라미터 비선형 로지스틱 방정식은 경로 간 비교를 위해 데이터에 적합했습니다. PSP 진폭도 전류 싱크 진폭에 따라 증가했습니다(그림 4B).
시상피질 및 피질피질 투입에 대한 시냅스 반응은 대조군, 이소플루란(0.28mM) 및 회복 조건 동안 측정되었습니다. 피질 피질 자극에 대한 소마토스타틴 (그림 5A)의 시냅스 후 반응은 이소 플루 란 동안 억제되었으며, 전류 싱크 (그림 5B)가 유발되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61333/61333fig01.jpg"> 그림 1: 프로토콜의 중요한 단계에 대한 개략적인 개요. 맨 위로: 형질전환 동물의 육종 및 바이러스 벡터의 발현에 필요한 단계의 타임라인을 기술한다. 밑바닥: 슬라이스 준비 당일에 재료를 준비하고 실험을 수행하기 위한 단계와 타임라인을 보여 줍니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61333/61333fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61333/61333fig02.jpg"> 그림 2: 바이러스 벡터 주입 및 생체 외 코로나 뇌 절편 제제. (A) SOM-td토마토 또는 PV-tdTomato 하이브리드 마우스에 바이러스 벡터를 주입하는 개략적 표현. (B) 내측 정수리 연관 영역 (mPtA)의 관상 절편을 수확하고, 시상 피질 (상단) 또는 피질 피질 (하단) 구 심성 섬유를 층 1의 eYFP 리포터에 의해 식별했다. 이 수치는24의 허가를 받아 수정되었습니다. (C) 표면 층 1 (녹색)의 eYFP 표지 축삭 말단 및 표면 층 2/3의 td토마토 표지 SOM + 인터 뉴런 (빨간색)의 오버레이. (D) 밀봉 된 백은 50:50 용액 대 기체 혼합물로 제조되었다. (E) 16 x 1 프로브를 mPtA에 배치(검은색 윤곽선). (F) 피질 슬라이스의 기록 설정의 개략도. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61333/61333fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61333/61333fig03v2.jpg"> 그림 3: 피질 슬라이스에서 동시 세포 내 및 다중 채널 세포외 기록. (A) 층 2/3 PV+ 인터뉴런의 소마에서 기록된 전체 셀 전류 클램프 패치. 10Hz에서 청색광 (2.2mW)의 4 개의 펄스 (각각 2ms, 파란색 화살표)가 L1의 피질 피질 축삭 단자에 전달되었습니다. 10번의 시행(회색 추적)의 평균(빨간색 추적)이 표시됩니다. (B) 세포 외 16 x 1 프로브의 16 채널에서 얻은 원시 데이터. 피질 조직에 배치 된 채널은 검은 색으로 표시되고 피질 외부에있는 채널은 회색으로 표시됩니다. (C) 로컬 필드 전위 신호에서 추출한 전류 소스 밀도 다이어그램은 레이어 1의 시냅스 전류 싱크 (파란색)를 보여줍니다. (D) 로컬 필드 전위 신호에 고역 통과 필터를 적용하여 생성 된 다중 단위 활동은 하위 레이어에서 유발되는 스파이크 활동을 분리합니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61333/61333fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61333/61333fig04.jpg"> 그림 4: 두 개의 서로 다른 슬라이스로 녹음된 응답 비교. 피질 층 1에서 시냅스 반응을 불러 일으키기 위해 여러 광도를 사용했습니다. 각 시험에 대해, 유발 된 반응의 피크 진폭은 층 1 세포 외 전류 싱크와 층 2/3 PV + 인터 뉴런의 EPSP에서 추출되었다. (A) 시상 피질 및 피질 구 심성의 세포 외 반응 프로파일은 광도의 함수로서 비교된다. (B) 전류 싱크 진폭과 EPSP 진폭 간의 관계는 경로에 따라 다릅니다. 각 자극 경로 내에서 (A)와 (B)의 데이터가 동시에 수집되었습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61333/61333fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61333/61333fig05.jpg"> 그림 5: 동시 기록 중 eACSF에 용해된 이소플루란의 수조 적용. (A) 제어, 이소플루란 및 세척 조건 동안 피질 피질 구심성의 활성화시 층 2/3 SOM+ 인터뉴런에서 세포 내 전체 세포 전류 클램프 기록. 파란색 세로선은 빛 자극(2ms, 1.65mW)을 나타냅니다. (B) 층 1의 전극에서 추출한 전류 소스 밀도 트레이스. 데이터는 (A)에서 수집된 데이터와 동시에 수집되었습니다. 세척시 반응의 회복은 이소 플루 란에 의한 시냅스 반응의 억제를 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61333/61333fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="5">바이러스 주입용 마이크로피펫</td>
		</tr><tr><td>잔</td>
			<td>아이디 : 0.05 밀리미터, 외경 : 0.11 밀리미터</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>루프</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5"></td>
		</tr><tr><td>열</td>
			<td>끌다</td>
			<td>벨</td>
			<td>시간</td>
			<td>압력</td>
		</tr><tr><td>경사로 + 10</td>
			<td>20</td>
			<td>40</td>
			<td>200</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td colspan="5"></td>
		</tr><tr><td colspan="5">전체 세포 패치 클램프 기록을 위한 마이크로피펫</td>
		</tr><tr><td>잔</td>
			<td>아이디 : 1.1 밀리미터, 외경 : 1.7 밀리미터</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>루프</td>
			<td>4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5"></td>
		</tr><tr><td>열</td>
			<td>끌다</td>
			<td>벨</td>
			<td>시간</td>
			<td>압력</td>
		</tr><tr><td>램프</td>
			<td>0</td>
			<td>25</td>
			<td>250</td>
			<td>500</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 바이러스 주사 및 전체 세포 패치 클램프 기록을 위해 마이크로피펫을 당기는 데 권장되는 유리 및 매개변수. 바이러스 주사 및 전체 세포 패치 클램프 기록에 사용되는 유리와 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 마이크로 피펫을 당기는 매개 변수에 대해 설명합니다. 추가 권장 사항 또는 설정 미세 조정에 대해서는 마이크로피펫 풀러의 사용 설명서를 참조하십시오.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>슬라이싱 ACSF, sACSF (mM 단위)</td>
			<td>실험 ACSF, eACSF (mM 단위)</td>
		</tr><tr><td>나트륨</td>
			<td>111</td>
			<td>111</td>
		</tr><tr><td>나HCO3</td>
			<td>35</td>
			<td>35</td>
		</tr><tr><td>헤페스</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>증권 시세 표시기</td>
			<td>1.8</td>
			<td>1.8</td>
		</tr><tr><td>CaCl2</td>
			<td>1.05</td>
			<td>2.1</td>
		</tr><tr><td>마그네슘4</td>
			<td>2.8</td>
			<td>1.4</td>
		</tr><tr><td>KH2PO4</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.2</td>
		</tr><tr><td>포도당</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>내부 솔루션</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>K- 글루 콘산 염</td>
			<td>140</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>나트륨</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>헤페스</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>증권 시세 표시기</td>
			<td>0.1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>MgATP</td>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>나그트피</td>
			<td>0.3</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>pH = 7.2</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>표 2 : 인공 뇌척수액 및 세포 내 용액의 조성. 패치 클램프 기록을 위한 sACSF, eACSF 및 세포 내 피펫 용액에 대한 시약 및 농도가 나열되어 있습니다.
보충 그림 1: 뇌 조각을 수집하기 위해 조직 블록을 준비하기 위한 템플릿. 템플릿이 적절한 크기로 조정되고 인쇄되어 현미경 슬라이드에 접착됩니다. 커버 슬립은 템플릿 위에 접착되어 사용을 연장합니다. 조직 블록은 시상면이 아래로 향하고 분홍색 배경에 정렬 된 여과지 위에 놓이고 검은 선을 따라 관상 평면에서 수직 절단이 이루어집니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61333/61333supfig01.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: 수확된 뇌 조각을 위한 배양실. 챔버는 sACSF로 채워지고 튜브에 부착 된 구부러진 바늘을 통해 95 % O2 / 5 %CO2 가스 혼합물로 버블링됩니다. 인큐베이션 플랫폼은 플라스틱 원형 피팅 위에 뻗어있는 나일론으로 만들어집니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61333/61333supfig02.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 3: 기록실에서 슬라이스를 위한 백금 구조. 브레인 슬라이스는 피펫을 통해 기록실로 옮겨져 나일론 메쉬 위에 놓이고, 말굽 모양의 납작한 백금 와이어 조각 위에 뻗어 제자리에 슈퍼 접착됩니다. 플래티넘 하프는 녹음 중에 제자리에 고정하기 위해 브레인 슬라이스 위에 놓입니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61333/61333supfig03.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 다른 휘발성 마취제에 대한 오스트발트(λ) 및 분젠(α) 계수. 할로탄, 세보플루란 또는 데스플루란과 같은 다른 휘발성 가스 마취제의 연구를 위해 이 프로토콜을 적용하십시오. 프로토콜에 설명된 방정식을 이 표에 나열된 적절한 계수로 대체합니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61333/Supplementary_Table_1.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics at JoVE.com

Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics

생체 외 뇌 조각은 구 심성 입력에 대한 유발 반응에 대한 휘발성 마취제의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 광유전학은 시상피질 및 피질 피질 구심성을 비원발성 신피질에 독립적으로 활성화하는 데 사용되며 시냅스 및 네트워크 반응은 이소플루란으로 조절됩니다.

뇌 조각에서 구 심성 경로의 광유전 적 활성화 및 휘발성 마취제에 의한 반응의 조절

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect ...

optogenetic-activation-afferent-pathways-brain-slices-modulation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

2.1K 조회수.  University of Wisconsin. 생체 외 뇌 조각은 구 심성 입력에 대한 유발 반응에 대한 휘발성 마취제의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 광유전학은 시상피질 및 피질 피질 구심성을 비원발성 신피질에 독립적으로 활성화하는 데 사용되며 시냅스 및 네트워크 반응은 이소플루란으로 조절됩니다.

비디오: Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

연구

신경과학

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

행동분석학

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a premise for determining the role of neuron types within a neural circuit, and their significance in information encoding relative to learning. Likewise, the method can be used to test the physiological significance of two or more connected brain regions in awake and anesthetized animals. The current study demonstrates how VTA glutamate neurons modulate the firing rate of putative pyramidal neurons in the CA1 (hippocampus) of anesthetized mice. This protocol employs adeno-associated virus (AAV)-dependent labeling of VTA glutamate neurons for the tracing of VTA presynaptic glutamate terminals in the layers of the hippocampus. Expression of light-controlled opsin (channelrhodopsin; hChR2) and fluorescence protein (eYFP) harbored by the AAV vector permitted anterograde tracing of VTA glutamate terminals, and photostimulation of VTA glutamate neuron cell bodies (in the VTA). High-impedance acute silicon electrodes were positioned in the CA1 to detect multi-unit and single-unit responses to VTA photostimulation in vivo. The results of this study demonstrate the&#160;layer-dependent distribution of presynaptic VTA glutamate terminals in the hippocampus (CA1, CA3, and DG). Also, the photostimulation of VTA glutamate neurons increased the firing and burst rate of putative CA1 pyramidal units in vivo.

The current protocol demonstrates a simple method for tracing of ventral tegmental area (VTA) glutamate projections to the hippocampus. Photostimulation of VTA glutamate neurons was combined with CA1 recording to demonstrate how VTA glutamate terminals modulate CA1 putative pyramidal firing rate in vivo.

해마의 생체 내 해부학 및 기능적 추적

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...

Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of optogenetics, however, requires that safety and efficacy be demonstrated in animal models, ideally in non-human primates (NHPs), because of their neurological similarity to humans. The number of candidate vectors that are potentially useful for neuroscience and medicine is vast, and no high-throughput means to test these vectors yet exists. Thus, there is a need for techniques to make multiple spatially and volumetrically accurate injections of viral vectors into NHP brain that can be identified unambiguously through postmortem histology. Described herein is such a method. Injection cannulas are constructed from coupled polytetrafluoroethylene and stainless-steel tubes. These cannulas are autoclavable, disposable, and have low minimal-loading volumes, making them ideal for the injection of expensive, highly concentrated viral vector solutions. An inert, red-dyed mineral oil fills the dead space and forms a visible meniscus with the vector solution, allowing instantaneous and accurate measurement of injection rates and volumes. The oil is loaded into the rear of the cannula, reducing the risk of co-injection with the vector. Cannulas can be loaded in 10 min, and injections can be made in 20 min. This procedure is well suited for injections into awake or anesthetized animals. When used to deliver high-quality viral vectors, this procedure can produce robust expression of optogenetic proteins, allowing optical control of neural activity and behavior in NHPs.

As currently implemented, optogenetics in non-human primates requires injection of viral vectors into the brain. An optimal injection method should be reliable and, for many applications, capable of targeting individual sites of arbitrary depth that are readily and unambiguously identified in postmortem histology. An injection method with these properties is presented.

마취 및 깨어 있는 행동하는 비인간 영장류 뇌에서 광유전학을 위한 AAV 벡터 주사

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. Traditional in vitro electrophysiological techniques use electrical stimulation to evoke synaptic transmission. A major drawback of this method is its nonspecific nature; all axons in the region of the stimulating electrode will be activated, making it difficult to attribute an effect to a particular afferent connection. This issue can be overcome by replacing electrical stimulation with optogenetic-based stimulation. We describe a method for combining optogenetics with in vitro patch-clamp recordings. This is a powerful tool for the study of both basal synaptic transmission and synaptic plasticity of precise anatomically defined synaptic connections and is applicable to almost any pathway in the brain. Here, we describe the preparation and handling of a viral vector encoding channelrhodopsin protein for surgical injection into a pre-synaptic region of interest (medial prefrontal cortex) in the rodent brain and making of acute slices of downstream target regions (lateral entorhinal cortex). A detailed procedure for combining patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study short- and long-term synaptic plasticity is also presented. We discuss examples of experiments that achieve pathway- and cell-specificity by combining optogenetics and Cre-dependent cell labeling. Finally, histological confirmation of the pre-synaptic region of interest is described along with biocytin labeling of the post-synaptic cell, to allow further identification of the precise location and cell type.

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Here we present a protocol describing viral transduction of discrete brain regions with optogenetic constructs to permit synapse-specific electrophysiological characterization in acute rodent brain slices.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

Simultaneous Optical and Electrophysiological Monitoring of Neuronal Cells in Brain Slices

Source:&#160; Murphy, C. A., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61333">Optogenetic activation of afferent pathways in brain slices and modulation of responses by volatile anesthetics.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video outlines a method for simultaneously imaging and recording electrical activity from transgenic brain slices that contain neuron-specific fluorescent proteins. The procedure involves maintaining the brain slice in a perfusion chamber with aerated artificial cerebrospinal fluid, using a light source to excite fluorescent-labeled cells, and recording the electrical signals with a multichannel probe and patch clamp.

뇌 절편에 있는 신경 세포의 동시 광학 및 전기 생리학적 모니터링

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;
...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Optogenetic Stimulation and Electrophysiological Recording of Synaptic Events in Rat Brain Slices

Source: Kinnavane, L., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/63077">Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for studying synaptic efficiency in the lateral entorhinal cortex (LEC) by optogenetically stimulating medial prefrontal cortex (mPFC) axons and recording the responses of pyramidal neurons in the LEC. This method combines patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study synaptic plasticity.

쥐 뇌 절편에서 시냅스 사건의 광유전학적 자극 및 전기생리학적 기록

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Electrophysiology and ...