세포 내 세균 성 지역 사회, 또는 IbC, 실험 요로 감염을 부여 된 쥐에서 관찰 되었습니다., 또는 요로. 그(것)들은 또한 인간 적인 UTI 환자의 소변 퇴적물에서 보였습니다. 우리가 오늘 기술하고 있는 기술은 실험적으로 감염된 마우스에서 단 하나 IpC를 격리하는 쪽입니다.
입 마이크로 파이프 기술은 감염된 마우스 방광에서 세포 내 박테리아를 격리하기 위한 유일한 현재 유효한 기술입니다. 유리 입 파이펫을 준비하려면 유리 모세관 튜브의 양쪽 끝을 단단히 꼬집어 서 튜브의 중간을 열화염 원위로 앞뒤로 균일하게 회전합니다. 유리가 부드러워지면 열원에서 모세관을 제거하고 즉시 유리를 분리합니다.
뽑은 모세관의 이상적인 최종 길이는 단일 방광 상피 세포를 분리하기 위한 적절한 내부 직경을 보장하기 위해 당겨지지 않은 모세관보다 3~ 5cm 더 깁니다. 유리가 식으면 유리 모세관의 중간이 좁고 튜브 내부가 여전히 비어 있는지 확인하십시오. 한 손으로 뽑아낸 모세관의 큰 끝을 집어 들고, 가장 좁은 지점에서 모세관을 잡기 위해 집게를 사용하여 포셉이 모세혈관을 단단히 잡을 수 있도록 하십시오.
집게를 빠르게 비틀어 가장 좁은 지점에서 당겨낸 모세관을 스냅합니다. 그런 다음 입 마이크로피펫 크기의 모세관을 100mm 페트리 접시에 넣고 UV를 30분 동안 살균합니다. 방광을 수확하려면 마우스를 수핀 위치에 놓고 70 %의 에탄올로 복부 부위를 살균하십시오.
에탄올 멸균 포셉과 외과 가위를 사용하여, 요도 개구부 위에 초기 1센티미터 횡단 피부 절개를 하고 마우스의 상반신쪽으로 대각선으로 절개를 확장하여 복막의 함량을 노출시키는 마우스의 전체 전방을 따라 V자 형 절단을 만듭니다. 새로운 살균 도구를 사용하여 마우스의 골반 부위 근처의 지방 패드를 부드럽게 밀어 내포하여 방광이 튀어 나와 정점에 노출된 방광을 파악합니다. 방광에 단단한 그립을 유지, 방광을 해제하고 방금 절개 된 방광의 개구에 둥근 집게의 한 샤프트의 끝을 삽입하기 위해 요관과 요도를 잘라.
정점을 잡고 둥근 집게를 거의 완전히 닫은 집게를 풀어 놓고, 두 번째 한 쌍의 집게를 사용하여 방광의 입의 바깥쪽 끝을 둥근 집게에서 멀리 끌어당기고 둥근 집게의 다른 끝을 통해 방광을 안쪽으로 돌립니다. 그런 다음 두 번째 한 쌍의 집게를 사용하여 집게 끝에서 반전 된 방광을 차가운 PBS의 1 밀리리터로 부드럽게 동축시하십시오. 그리고 거꾸로 된 방광의 바깥쪽에 있는 내부 상피 세포 층을 두 쌍의 깨끗한 집게로 부드럽게 긁어냅니다.
모든 세포가 긁어지면, 끌어당겨진 유리 모세관의 풀이 없는 끝을 흡기 튜브의 고무 플러그에 삽입하고 튜브의 다른 열린 끝에 1 밀리리터 파이펫 팁의 좁은 끝에 단단히 맞습니다. 파이펫을 1밀리리터 파이펫 팁의 열린 넓은 끝에 단단히 맞추고 긁힌 셀 서스펜션을 해부 현미경 으로 배치합니다. 20~40배율을 사용하여 IbC를 큰 형광 골재로 식별하고 유리 모세관의 미세한 끝을 1초 동안 PBS의 신선한 튜브에 찍어 모세관 작용을 통해 원치 않는 부피의 섭취를 줄입니다.
IBC가 관심을 가지면 서서히 모세관 튜브의 개방된 끝을 IBC쪽으로 가져와 서두를 달래는 파이펫에 매우 작은 흡입력을 적용하여 IBC를 유리 모세혈관으로 안내합니다. 그런 다음 모세혈관을 빈 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 이동하고 약간의 양압을 적용하여 방울과 IBC를 튜브로 추방합니다. 해부 현미경을 통해 수집 관에 단일 절연 IBC의 존재를 확인하는 것 외에도, 절연 된 IBC의 순도는 공초점 현미경검사법에 의해 확인 될 수있다.
고립 된 세포는 대장균과 비로 플라킨 모두에 대해 얼룩져야하며 크기가 50에서 120 마이크로 미터 사이여야합니다. 격리 후, 개별 IBC에서 세균 세포의 존재 및 생존성은 게놈 등가물의 식민지 형성 단위 정량화 또는 정량적 중합효소 연쇄 반응을 통해 확인할 수 있다. 특히, 동일한 프로토콜로 분리된 감염되지 않은 상피 세포는 정량화 가능한 양의 박테리아를 보여주지 않는다.
또한, 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 분석은 개별적으로 분리되고 풀로 풀린 IBC의 범위에서 세균 유전자의 존재를 확인한다. 입 마이크로피펫이 액체를 쉽게 집어 들고 추방할 수 있도록 항상 보장하십시오. 입 마이크로 피펫이 가려진 느낌이 들면 모세관 또는 전체 장치를 변경하는 것을 주저하지 마십시오.
이 구강 마이크로 파이프 팅 기술은 우리가 직접 및 구체적으로 실험 UTI 동안 형성 세포 내 인구를 연구 할 수 있습니다. 이 기술 없이, 그 세포 내 인구와 오염 하 고 세포 외 박테리아에 의해 열세 될 것 이다. 일부 다른 전염성 제제는 우리가 이 응용 프로그램에서 사용한 대장균보다 더 쉽게 에어로졸화되거나 전송될 수 있습니다.
이러한 경우 사용 중인 응용 프로그램에 따라 필터를 추가하거나 튜브를 확장하는 것과 같은 일부 추가 컨트롤이 보증될 수 있습니다. 이 입 마이크로파이프팅 기술을 사용하여 분리된 IbCs는 QRTPCR 또는 RNA 염기서열분석과 같은 다른 다운스트림 단일 세포 분석에서 사용될 수 있다.
