여기에서 우리는 박테리아가 존재하는 것으로 의심되는 많은 조직 모형에 광범위한 응용이 있는 생검 방광 조직 내의 박테리아의 검출을 위한 강력한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술의 주요 장점은 편견이 없다는 것입니다. 그것은 박테리아 종 존재의 우선 지식 없이 조직 내 박테리아를 검출 하는 연구원수 있습니다.
이 기술은 박테리아가 재발하는 요로 감염을 가진 여자의 방광 벽을 침략했는지 확인하고 조직 관통 항생제의 선택과 같은 치료 선택을 알리는 것을 도울 수 있습니다. 방광 조직을 위해 디자인된 동안, 이 기술은 최소한의 최적화를 가진 거주자 세균성 인구를 가진 그밖 조직에 광범위하게 적용될 수 있습니다. 이 기술에 새로운 개별은 커버 슬립 배치 및 화상 진찰으로 투쟁할 수 있습니다.
커버슬립 배치를 최적화하여 거품을 줄이고 귀중하지 않은 샘플에 대한 이미징을 연습하는 데 중점을 둡니다. 이 절차를 입증하는 데 도움이 자쉬카란 Gadhvi, 내 실험실에서 대학원생이 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 빈 연기 후드를 청소하거나 70 %의 에탄올로 생체 안전 캐비닛을 적절하게 장착하십시오.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 모든 버퍼및 시약을 준비합니다. 다음으로, 70%에탄올로 코플린 항아리 5개청소하고 항아리를 건조하게 합니다. 항아리가 건조할 때, 여기에 표시된 대로 라벨을 붙이고 적절한 용액의 100 밀리리터로 채웁니다.
연기 후드에 생검 당 2 개의 슬라이드를 수직 슬라이드 랙에 놓습니다. 수직 슬라이드 랙을 Xylenes 1 코플린 항아리에 10분간 넣습니다. 그 후, 항아리에서 슬라이드 랙을 제거하고 여분의 xylenes를 제거하기 위해 종이 타월에 바닥을 얼룩.
랙을 Xylenes 2 항아리에 10분간 넣습니다. 그리고 연속에 있는 분리된 조직 단면을 각각 10분 동안 재수화합니다. 세종이 완료되면, 여분의 에탄올을 제거하고 10 분 동안 필터 살균, 이중 증류수 100 밀리리터를 포함하는 코플린 항아리에 랙을 배치하기 위해 종이 타월에 슬라이드 랙의 바닥을 얼룩.
이 세척 하는 동안, 축성화 버퍼에 10 나노 몰러프로브를 희석 하 고 염색 용액을 만들, 슬라이드 당 염색 용액의 150 마이크로 리터를 준비 해야 합니다. P1000 팁 박스의 저수지에 흠뻑 젖은 섬세한 작업 닦기 및 멸균 물을 추가하여 각 프로브에 가습 챔버를 준비합니다. 슬라이드가 앉을 수 있는 위치에 팁 홀더 카트리지를 위에 놓습니다.
마지막 세척이 완료되면 슬라이드 랙에서 슬라이드를 제거하고 신선한 종이 타월에 배치합니다. 섬세한 작업 닦기를 사용하여 슬라이드를 말리기 위해 살때만 조심스럽게 물 속을 심지 않도록 주의하십시오. 소수성 펜을 사용하여 생검 섹션 주위에 테두리를 그리고 슬라이드 조직 측을 가습 챔버에 올려 놓습니다.
다음으로 가습 챔버를 섭씨 50도로 설정된 인큐베이터에 넣습니다. 조직 주위의 소수성 테두리에 의해 만들어진 사각형이 채워지고 상자를 부드럽게 닫을 수 있도록 염색 용액의 50~150마이크로리터가 조직 위에 직접 입점한다. 어둠 속에서 섭씨 50도에서 하룻밤 을 배양하십시오.
인큐베이터가 창이 있는 경우 알루미늄 호일을 덮고 어두운 환경을 만듭니다. 다음 아침, 가습 챔버에서 슬라이드를 제거하고 섬세한 작업 닦아 남아있는 혼성화 솔루션을 신속하게 멀리 심지. 그런 다음 측면을 수직 염색 랙에 넣습니다.
스테인링 랙을 알루미늄 호일 포장 된 코플린 항아리에 넣고 10 분 동안 미리 데워진 세척 버퍼의 100 밀리리터가 들어 있습니다. 새로운 코플린 항아리에 신선한 세척 버퍼와 함께이 세척 단계를 두 번 더 반복합니다. 이러한 세척 단계에서는 Hoechst 33342의 스톡 용액을 1 대 1000의 비율로 세척 버퍼로 희석하여 카운터 얼룩을 준비하십시오.
같은 튜브에, 33 나노 몰러의 최종 농도에 밀리리터 당 5 마이크로 그램의 최종 농도알렉사-555 밀 생식기 agglutinin을 추가합니다. 사용할 준비가 될 때까지 어둠 속에서 보관하십시오. 마지막 세척이 완료되면 코플린 항아리에서 슬라이드를 제거하고 섬세한 작업 닦아여분의 세척 버퍼를 부드럽게 심지합니다.
슬라이드 티슈 쪽을 종이 타월에 올려 놓고 소수성 테두리가 채워지지만 넘쳐나지 않도록 50~150마이크로리터의 카운터 얼룩을 조직 위에 직접 넣습니다. 냉동 상자 상단으로 최대 4 개의 슬라이드를 덮고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오. 그 후, 슬라이드를 염색 선반에 다시 넣고 신선한 세척 버퍼가 들어있는 코플린 항아리에 두 번 더 씻고 각 세척이 10 분 동안 지속됩니다.
그런 다음 슬라이드를 철저히 말리고 저온 박스 상단 아래에 종이 타월에 티슈 사이드를 놓습니다. 티슈 위에 직접 장착 용지 한 방울을 짜서 적절한 크기의 커버슬립을 부드럽게 위에 놓습니다. 거품을 부드럽게 누르고 커버 슬립 슬라이드가 어둠 속에서 하룻밤 동안 치료할 수 있도록 합니다.
다음 날, 뚜렷한 매니큐어의 밝은 코트와 슬라이드에 커버의 가장자리를 밀봉하고 4섭씨에서 어둠 속에 저장하기 전에 10 분 동안 어둠 속에서 건조하게. 스테인드 생검을 이미지할 준비가 되면 공초점 현미경 및 현미경과 관련된 소프트웨어를 켭타보하십시오. FISH 포지티브 슬라이드로 시작하여 컴퓨터 시각화 모드로 전환합니다.
405, 488 및 555에 대한 채널을 선택합니다. 이 경우 555인 가장 긴 파장 채널을 사용하여 핀홀을 설정합니다. 그런 다음 488 채널에서 표지된 박테리아의 시각화를 위한 현재 초점 평면을 찾습니다.
초점 평면을 변경하지 않고 신호가 포화되지 않고 배경이 과도하게 수정되지 않도록 각 채널에 대한 게인, 레이저 전력 및 오프셋을 설정합니다. 세 채널 모두에서 이미지를 획득합니다. 이 연구에서는, 조직 관련 박테리아는 16S rRNA FISH에 의하여 인간 방광 생검에서 검출됩니다.
이 프로토콜은 파라핀 임베디드 방광 생검 섹션에서 방광 점막과 관련된 박테리아의 편견없는 검출에 최적화되었습니다. 여기에 표시되는 재발성 요로 감염을 가진 여자에게서 얻은 방광 생검의 단면도에 이 프로토콜을 사용하여 실험에서 대표적인 공초점 현미경 표견입니다. 두 개의 직렬 섹션은 범용 16S rRNA 또는 스크램블 프로브와 혼성화됩니다.
조직 과 박테리아의 동일한 영역에서 찍은 이미지는 16S rRNA 프로브와 혼성화된 조직에서 깨끗하게 볼 수 있지만 스크램블 프로브는 없습니다. 거짓 긍정 결과도 가능합니다. 이 대표적인 거짓 양성에서, 자동형광 콜라겐 또는 엘라스틴에 대응하는 신호는 16S rRNA 및 스크램블 프로브 혼성 생검 섹션에서 405 및 488 채널에서 검출되어 항상 스크램블 프로브 제어를 사용하는 것의 중요성을 강조한다.
사진 표백을 방지하기 위해 프로브를 적용 한 후 빛에 대한 조직의 노출을 최소화하십시오. 이 기술은 인간 조직에서 박테리아의 편견없는 검출을 허용하지만, 종에게 특정 정보를 제공하지 않습니다. 분류 특정 프로브를 가진 멀티플렉스-FISH는 존재하는 속 또는 종을 확인하기 위하여 이용될 수 있었습니다.
이 기술이 개발되기 전에, 박테리아가 인간 재발하는 UTI 환자의 방광 벽을 침범할 수 있다는 것을 이전에 입증되지 않았습니다. 우리는 지금 어떤 세균성 종이 존재하는지 결정하기 위하여 속과 종 특정 탐사선을 이용하고 있습니다. Xylenes는 독성으로 인해 연기 후드에 사용해야합니다.
이미징 중에 레이저를 직접 들여다보지 않도록 주의해야 합니다. 레이저는 목표 아래 슬라이드를 배치하는 동안 꺼져야합니다.
