이 프로젝트는 GM018568에서 건강의 국가 학회에 의해 투자 되었다. 이 프로토콜 수행 되었다 일부 센터에서 대 한 나노 시스템 (CNS), 구성원의는 국가 나노기술 조정 인프라 네트워크 (NNCI), NSF 보너스 번호 1541959에서 국립 과학 재단에 의해 지원 되는. CNS는 하버드 대학교의 일부입니다. 많은 감사 토마스 노먼과 네이 선 주 님 마음속 고 여기 고 기구의 원래 버전을 건물에 표시 된 장치를 위해 사용 하는 마스터 템플릿을 조작에 그들의 작품에 대 한 있습니다. 우리는 또한 그의 귀중 한 공동 조언을 요한 Paulsson 감사 하 고 그들의 조언과 세균 미세 기구를 지속적인된 개선에 대 한 그의 실험실의 구성원 감사.

1. PDMS 장치 캐스팅
<ol><li>먼지 없는 환경에서 PDMS 폴리머와 경화제 10:1 비율로 혼합 하 고 적어도 10 분 동안 진공에서 드.</li>
	<li>실리콘 마스터 (또는 그 아니라는 에폭시 또는 폴리우레탄 복제) 연속적인된 알루미늄 호 일의 조각에 폴리스 티 렌 페 트리 접시에 놓습니다. 붓는 다 degassed PDMS 혼합물 깊이 약 5 m m. 드가 페 트리 접시 적어도 10 분 사용에 대 한 마스터 공기 표면 거품을 휴식의 부드러운 스트림. 참고: 사용 하는 2 계층 장치 크기에 제공 되는 동반 CAD 파일5 ( 보충 파일 1참조). 플라스틱 복제 마스터 수 있습니다 degassing; 하는 동안 부분적으로 플 로트 이 경우, 깨끗 한 플라스틱 주걱으로 복제 아래로 밀어.</li>
	<li>60 ° C에서 오븐에 1 시간 이상에 대 한 PDMS를 치료 하 고 실내 온도에 냉각 하십시오. 페 트리 접시에서 마스터 및 치료 PDMS를 포함 하는 알루미늄 호 일을 제거 합니다. 조심 스럽게 껍질 마스터, 뒤쪽에서 알루미늄 호 일을 한 다음 마스터에서 PDMS를 신중 하 게 껍질. 참고: 또는, PDMS 있습니다 완 치 될 하룻밤 실 온에서. 영구적으로 1/16 인치 웨이퍼 본드 에폭시 접착제를 사용 하 여 실리콘 웨이퍼 마스터의 상대적 취약성을 극복할 수 있습니다-같은 웨이퍼 크기의 두꺼운 알루미늄 디스크.</li>
	<li>웨이퍼는 일반적으로 약간 다른 크기 ( 보충 파일 1참조) 여러 미세 장치 포함, 단일 장치는 깨끗 하 고 날카로운 메스를 사용 하 여 크기를 잘라. 참고: B. subtilis 작업 루틴에 대 한 C 또는 F 동반 CAD 파일에 표시 된 1.0 µ m 전체 셀 참호와 장치를 사용 합니다.</li>
</ol>2입니다. 펀치 및 결합 장치
<ol><li>장소 반투명의 조각 패턴된 특징의 가시성을 향상 시키기 위해 소자의 패턴된 쪽 이상 ( 재료의 표참조) 테이프. 입구 및 출구 포트 (그림 1) 보이는 유체 채널의 반대 끝에 원형 지역으로 식별 됩니다. 펀치 구멍 입구 및 출구 핀 장치에 때 그들의 가시성을 개선, 뾰족한 마커를 사용 하 여 점 후미와 출구 표시 합니다. 참고: 입구와 콘센트 핀은 혼잡 하지 있도록 모든 다른 채널은 구멍 뚫은 것, 바로 아래에 장치에 대 한 알파벳 지정자 채널 시작.</li>
	<li>패턴된 측면, PDMS 장치를 대칭 이동 하 고 장치는 0.75 m m 생 검 펀치;를 사용 하 여 표시 된 점 들을 통해 펀치 punchings을 삭제 합니다. 참고: 장치는 구멍 뚫은 것 아래로 꽃무늬 면 생 검 펀치에 의해 생성 된 구멍은 일반적으로 약간 flared 펀치는 폴리머를 입력 하기 때문에. 거꾸로 방향 장치 펀칭 패턴된 측면에 구멍 날카로운 테두리는 보장 합니다.</li>
	<li>stereomicroscope를 사용 하 여 천공된 구멍 장치 입구 및 출구 분야와 중복을 확인 합니다. 뾰족한 족집게를 사용 하 여 천공된 구멍에서 PDMS의 어떤 외부 조각을 제거.</li>
	<li>접착 테이프를 사용 하 여 깨끗 한 폴리스 티 렌 페 트리 접시로 장치 및 장소의 양쪽에서 먼지를 제거 하. 100%가 소 프로필 알코올로 습윤 및 클린 룸 지우기;으로 문 지르고 22 m m x 40 m m 커버 유리를 준비 먼지가 없는 공기 또는 질소의 흐름과 함께 건조.</li>
	<li>장소 천공된 PDMS 장치 기능 측면을 함께 청소 커버 유리는 산소 플라즈마에 청소기.<ol>
<li>플라즈마 치료 다음 설정으로 장치: 진공, 70 mTorr; O2 압력, 200 mTorr; 기간, 15 s; 전원, W. 30 플라즈마 치료 기간 완료 후 즉시 제거 장치 및 커버 유리는 플라즈마에서 청소기.</li>
		<li>PDMS 반전 고 덮개 유리의 중심에 있도록 패턴된 측면 연락처 유리; (입구와 출구 사이 실행) 먹이 채널 덮개 유리의 긴 축에 정렬 됩니다 있는지 확인 합니다. 유리에 대 한 PDMS 물개 되도록 매우 부드럽게 아래로 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>60 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 조립된 장치 오븐에 구워 베이킹 후, 수동으로 PDMS 장치에의 한 모서리에 부드럽게 밀어 유리에 접착은 확인 합니다. 참고: 장치가 결합 되 면 그것은 해야 사용할 수 24 시간 이내 폴리머 후 플라즈마 처리 시간을 증가 함께 점점 더 소수 될 것 이다.</li>
</ol>3. 미세 배관 준비
<ol><li>폴리머 주사기 펌프 스위칭 장치 도달 하는 (사용) 하는 경우 적절 한 길이를 현미경에 장착 장치 (내경 (ID) 0.02 인치, 외경 (OD) 0.06 인치) 튜브의 길이 잘라. 미세 레인으로 많은 길이 잘라.</li>
	<li>핀치 밸브에 대 한 Y 접속점 (사용) 하는 경우 절단 및 2 cm 길이의 유연한 실리콘 (0.03 인치 ID, 0.065 인치 OD) "Y"의 최고 barbs을 1 cm 길이 "Y"의 하단 바 브에 실리콘 튜브의 튜브를 연결 하 여 조립</li>
	<li>잘라 10 cm (또는 적절 한) 길이의 중합체 튜브; 하단 바 브는 "Y"의 1 cm 실리콘 튜브 세그먼트에 삽입 하 여 스위치 접점을 한 끝에 그들을 연결합니다 21g 바늘 그들의 플라스틱 주사기 어댑터와 굽은 약 90 ° 바늘 끝에서 약 9 mm에서 제거 된 다른 끝에 그들을 연결 합니다.</li>
	<li>21 G 무딘 바늘 튜브에 바늘을 삽입 하 여 스위치 장비에 주사기에서 실행 되는 튜브 세그먼트의 한쪽 끝을 연결 합니다. Y 접속점에의 입구 미 늘에 실리콘 튜브 세그먼트로 각 길이의 튜브의 다른 끝을 삽입 합니다. 참고: 장소; 핀치 밸브와 접합부를 기구의 어떤 종류를 사용 이 micropipette 팁 상자 (그림 2D)에서 쉽게 만들 수 있습니다.</li>
	<li>휴대 장치의 콘센트에서 폐기물 비 커에 폐기물 중합체 튜브의 길이 잘라. 구부러진된 21 G 바늘 위에서 설명한 대로 준비를 한 끝에 그들을 연결 합니다. 폐기물 비 커에 튜브의 다른 쪽 끝을 테이프.</li>
	<li>적절 한 양의 0.1 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 포함 하는 미디어를 준비 하 고 원하는 크기와 주사기의 번호를 작성. 준비 21 G 바늘 주사기 펌프에 유입 튜브와 로드 주사기에 부착 된 BSA 로드 주사기를 연결 합니다. 참고: 대 한 전형적인 실험 장치의 5 채널 사용 됩니다 각각 20 mL 주사기. 매체 전환 실험 5 주사기의 2 뱅크를 요구할 것 이다. 여기, 펌프 포함 하는 첫 번째 은행을 1 단계 펌프 라고 하 고 사후 스위치 매체와 두 번째 은행을 포함 하는 펌프를 2 단계 펌프 라고.</li>
	<li>높은 흐름 율에 주사기 펌프를 실행 하 여 입구 배관에서 공기를 제거 (> 500 µ L/min), 주사기 펌프 수직으로 동쪽으로 향하게 하 고 상단에 기포를가지고 주사기를 도청에 의해 시작. 일단 주사기에서 공기를 제거 주사기 펌프를 가로로 배치 및 점차적으로 누르거나 꺼내 려 하 고 공기 방울 제거 스위치 장비를 통해 주사기에서 폴리머 라인을 터치 합니다. (미디어 전환) 하는 경우에 주사기의 두 번째 은행에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.</li>
	<li>기포를 제거한 후 2 단계 주사기 펌프를 설정 (즉, 사용 될 매체와 두 번째, 스위치 후) 1.5 µ L/분, 흐름 일시 중지. 두 번째 중간 단계에 해당 하는 Y 접속점에의 분 지에 작은 바인더 클립 유연한 튜브의 세그먼트에 배치 합니다. 30 분 이상 두 번째 중간 입구 배관에서 제거에 대 한 겸손 한 흐름 속도 (예를 들어, 10 µ L/min)에서 단계 1 주사기 펌프를 실행 하려면 계속 Y 분기점의 하류.</li>
</ol>4. 세포 문화 준비
<ol><li>하룻밤, 고정 단계 원하는 매체에 대 한 관심의 긴장의 preculture 성장. 세균성 긴장을 렌더링 하는 셀 움직이지 셀 소자의 채널에서 수영 하지 않는 변이 포함 해야 합니다. 참고:이 프로토콜, 세균성 긴장은 B. subtilis 3610 포함 하는 노 파A233V 대체 (이 돌연변이 발생 헬리컬, 방지 세포 운동 성 보다 똑바로 되도록 편), PrsbV-mNeonGreen 셀 스트레스에 대 한 기자 그리고 제정 Phyperspank-mNeptune (레드) 기자 셀을 강조 표시 합니다. LB 레 녹 스 매체 예제 프로토콜에 사용 됩니다. 마이크로 실험에 대 한 일반적인 긴장 하나 이상의 형광 transcriptional 기자 및 constitutively 생산, 세포질 형광 단백질 셀의 자동된 감지를 포함 합니다. 성장 결함 하지 관찰 되었다 파운드 레 녹 스 풍부한 매체 사용 되었다, 하지만 분 비 때문에도 미세 조건 하에서 최소한의 미디어에 B. subtilis 성장 저해 수 있습니다 siderophores 중간 흐름에 의해 멀리 세척 된다. S750 중간11보고 이러한 상황에서 성장 매체, 제 2 철 염화 나트륨 시트르산의 추가 의해 복원 수 있습니다.</li>
	<li>B. subtilis 세포 실험의 아침 희석 성장 매체의 25 mL를 포함 하는 당황 하 게 250 mL 플라스 크에 1시 50분. 5-6 h 1 보다 큰 광학 밀도를 37 ° C에서 문화를 떨고에 대 한 세포 성장. 참고: 고밀도 세포 배양 바람직합니다 정지 단계 B. subtilis 세포는 작은 고 덜에서 종종 발견된 셀 때문에 체인, 장치 로드를 촉진. 다른 세균 종 최적의 로드에 대 한 다른 매체 또는 성장 조건을 요구할 수 있습니다.</li>
	<li>5 µ m 기 공 크기 필터를 장착 한 주사기를 사용 하 여 B. subtilis 셀 체인 ( 대장균 에 대 한 필요 하지 않습니다 그것과 다른 종으로 필요 하지 않을 수 있습니다)을 제거 하는 15 mL 원뿔 튜브에 세포 배양의 약 15 mL를 필터링 합니다. 참고: 상대적으로 적은 세포를 제거 한다; 여과 액은 혼 탁 한 이어야 한다.</li>
	<li>실 온에서 4000 x g에서 10 분에 대 한 필터링 된 문화 원심 상쾌한 오프와 신선한 매체의 약 500 µ L pipetting 세포 현 탁 액을 촉진 하는 데 필요한 추가 튜브에 남아 있는 잔여 표면에 뜨는 액체에서 셀 펠 릿 resuspend.</li>
</ol>5. 장치 로드
<ol><li>부드럽게 장소 빈 얇은 젤 로드 micropipette 미세 장치 콘센트 구멍에 ( 재료의 표참조) 팁.</li>
	<li>입구 구멍에 1 mg/mL BSA를 포함 하 여 미세 채널 (그림 2A)의 작성 모니터링 콘센트 구멍에 팁을 관찰 하는 매체를 주입 하 여 장치 passivate P200 micropipette와 얇은 젤 로드 팁을 사용 하 여. 약 5 분 동안 실내 온도에 장치를 품 어. 참고: BSA 에이전트로 차단 또는 패 시 베이 션 PDMS 폴리머의 소수 성 표면에 바인딩하는 것입니다 그것의 화란을 증가 하 고 감소 셀 (세포 표면 분자)를 통해 또는 다른 단백질의 바인딩을 주로 사용 됩니다.</li>
	<li>얇은 젤 로드 팁을 사용 하 여, (제 4)에서 resuspended 셀으로 각 채널 (그림 2B) 장치를 통해 셀의 진행률을 모니터링 하려면 콘센트 채널에 팁을 사용 하 여 로드 합니다. 참고: 로드 P200 micropipette 최대 200 µ L 볼륨을 설정 하 고 다음 셀의 소량 (약 절반의 양을 피 펫 팁의 얇은 단면도)를 발음 하기 전에 공기의 쿠션을 발음에 의해 촉진 된다. Resuspended 셀의 볼륨 될 필요가 없습니다, PDMS 장치 볼륨은는 micropipette의 상대적으로 작은. 우리 알고 없다 상한선의 resuspended 세포의 밀도 셀 서 스 펜 션 장치에 pipetted 수 었 어 요. 셀 덩어리 장치를 방해할 수 있습니다 하 고 철저 한 pipetting 또는 소용돌이 혼합에 의해 피해 야 한다.</li>
	<li>부드럽게 작동 장치 손상을 방지 하려면 한 번에 하나씩 콘센트 구멍에서 젤 로드 팁을 제거 합니다.</li>
	<li>10 분 (그림 2C) 약 6000 x g에서 적절 한로 터 어댑터에 벤치 탑 microcentrifuge에서 장치 원심 참고: microcentrifuge 회전자 (그림 2C)에 맞게 설계 된 사용자 정의 가공 알루미늄으로 터 어댑터 사용 되었다; 다른 분리기 모델은 적절 한로 터 어댑터와 함께 사용할 수 있습니다. 어댑터의 중요 한 기능은 측면 채널에 셀을 강요 함으로써 셀 참호의 닫힌된 끝의 방향으로 측면 힘을 제공 합니다.</li>
	<li>(그림 3) 현미경 성공적인 로드 확인 하지만 슬라이드 홀더/무대 장치를 부착 하지 않고 삽입. 참고:이 프로토콜, 60 X, 1.4 나 Ph3 기름 침수 목표가이 단계에서 모두 확인 하 고 후속 이미징에 대 한 사용 됩니다.</li>
</ol>6. 장치 조립, 평형, 및 장착
<ol><li>조심 스럽게 무대 삽입의 하단에 PDMS의 양쪽에 덮개 유리를 녹화 하 여 무대 삽입에 로드 된 장치를 탑재 (즉, 단계 삽입 장치를 부착 하기 전에 반전). 단계 삽입 장치 어셈블리를 반전 하는 PDMS 향하도록 하 고 먼지 무료 지우기 (그림 2D) 같은 부드러운 표면에 놓습니다.</li>
	<li>단계-1 주사기 펌프 35 µ L/분의 유량을 조정 입구 바늘 그리고 콘센트 바늘 삽입 한 번에 한 차선을 사용, (즉, 폐기물 비 커;를 실행 그림 2E)입니다.</li>
	<li>깨끗 한 먼지 무료 지우기와 어떤 초과 매체를 닦아 하 고 시각적으로 누수에 대 한 장치를 검사. 초과 셀 (일반적으로 혼 탁 한 줄으로 표시)과 폐기물 비 커를 향해 천천히 움직일 것 이다 중간 초승달 모양에 대 한 콘센트 튜브를 검사 합니다.</li>
	<li>모든 연결 된 차선은 폐기물 비 커에 배출 될 때까지 약 15-30 분, 35 µ L/분에 실행 되도록 장치를 허용 합니다.</li>
	<li>1.5 µ L/min로 1 단계 주사기 펌프를 설정 하 고 흐름을 일시 중지. (이 과정은 모두 압 연 장바구니에 그것을 배치 하 여도 왔) 현미경을 전체 펌프 및 장치 장치를 가져오고 위상-1 1.5 µ L/분에 중간 교류는 신중 하 게 탑재 단계 삽입 거꾸로 형광 현미경에 장치를 다시 시작 사용 하 여 입구와 출구 튜브를 라우팅하는 데 필요한 테이프.</li>
	<li>이미징 장치에 원하는 위치를 찾아서 원하는 대로 이미징 시작. 세포는 일반적으로 정상 상태 지 수 단계 성장에 도달 하는 몇 시간 (약 10 세대) 필요로 하 고 이미지 수집의 발병으로 지연 될 수 있습니다 이미징 평형 기간 후 시작 하도록 원하는. 참고: 지 수 단계에서 개최 하는 세포의 정상 성장 확인 되어야 한다 후속 이미지 분석 중 세포 분열 시간을 추적 하 고 그들은 일정 한 최소 값에 도달 했습니다 확인 하 여.</li>
</ol>7. 매체 전환
<ol><li>영상의 연속 라운드, 사이 단계 1 주사기 펌프의 흐름을 일시 중지 합니다. 2 단계 실리콘 튜브, 실리콘 튜브에 각각 Y 교차점의 위상-1 분기에 이동에서 바인더 클립 unclip 신중 하 게. 유엔-일시 중지 단계 2의 흐름 주사 통 펌프 (이 단계 3.8에서에서 1.5 µ L/min으로 설정 된) 하 고 이미지를 계속 합니다. 참고: 폴리머 하류 배관의 10 cm 길이와 1.5 µ m/min에서 Y 접속점에의 두 번째 단계 매체 약 50 분에 장치에 도달. 장치에 시간은 형광 추적 입자를 포함 하는 미디어를 사용 하 여 실험적으로 테스트 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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A., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+in+a+phosphorelay+drives+stochastic+entry+into+sporulation+in+Bacillus+subtilis.">Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis.</a> EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).</li><li>Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+microfluidic+platform+to+uncover+basic+features+of+energy+and+environmental+stress+responses+in+individual+cells+of+Bacillus+subtilis.">Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 마이크로 프로토콜이입니다 유연한 많은 단계 특정 종 또는 스트레인 또는 특정 목적에 대 한 그것의 사용을 최적화 하기 위해 변경 될 수 있습니다. 실제로,이 프로토콜에 우리는 원래 "어머니 기계" 개념4 B. subtilis와 함께 그것의 사용을 최적화 하기 위해 수정을 만들었습니다. 종종, 셀 수감 된다 참호 반면이 프로토콜 사용 하 여 2 층 셀 참호, 셀을 둘러싼 얕은 채널 단일 레이어 기능을 구성 합니다. 2 층 디자인 긴 특히 영양분 및 B. subtilis 세포에서 대사 산물의 흐름을 극대화 하는 방법으로 소개 되었다 (> 75 µ m) 참호5; 그러나, 단일 레이어 기능 자주 최적의 세포 성장에 대 한 충분 하 고 특히 때 그들은 짧은 (25 µ m)4 대장균, 일반적으로 사용 됩니다. 우리는 B. subtilis 셀 체인, 확률론에서 발생 하는 주요 먹이 채널5에서 중간 흐름에 의해 그들의 참호에서 철수는 주파수를 줄일 그들은 일반적으로 긴 참호를 사용 합니다.
추가 수정, 다른 기능 차원 (예를 들어, 채널 폭) 또는 특성 (예를 들어, 모양, 열린 끝의 수) 장치를 사용 하 여 같은 적절 한 대체 수 있습니다. 예를 들어, 셀은 참호 열 (대신 현재 프로토콜에서 하나만 끝) 양쪽에의 사용은 다른 연구1,,2021에 사용 되었습니다. 그들은 끊임없이 되 고 채워진다 (반대로 어머니 기계, 어디 오래 된 셀을 추적 하 고 새로운 세포 채널에서 올려집니다), 신생아 셀 때문에 세포 노화를 방지 하는 양쪽 끝에 열려 있는 참호 있지만 사실 이전 셀 적용 됩니다 양쪽 끝으로 일반적으로 10 세대1,21보다 적은 그들의 관측 창을 제한합니다. 우리는 일반적으로 더 이상 관측 창 (수백 세대) 어머니 기계에 의해 제공 측정도 memoryless 프로세스는 대기 시간에는 수만을 가능 하 게 추구 또는 세대의 수백 긴5. 우리는 또한 포자 형성22의 우리의 분석에서 기 하 급수적으로 성장 하지 셀 관찰 하 어머니 기계 설계를 사용. 이러한 경우, 참호 의미 수 성장을 통해 추가 셀22분석.
많은 프로토콜의 단계 용 서는 상대적으로 그 프로토콜 결과 실질적으로 영향을 주지 않고 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 다음 깨끗 한 물에 10 M 코 순차적 10 분 목욕 쥡니다 단계에 의해 커버 유리를 청소에 대 한 프로토콜의 이전 버전 이라고 하지만 우리는 좋은 장치 결합 및 운영 간단를 사용 하 여 달성 되었다 발견 소 프로 파 놀 기반 여기에 설명 된 단계를 청소. 본딩 문제 발생 덮개 유리의 청결에는 캐스트 의혹, 청소 하는 더 엄격한 프로토콜을 하는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 셀 셀 참호에 로드를 극대화 하기 위해 원심 분리 단계를 사용 하는 우리가 합리적으로 전체 로드 얻을 수 있습니다이 단계 없이 매우 집중된 셀 로드 단계에 사용 됩니다. 이 대체 전략 회전 장치를 쉽게 사용할 수 있는 원심 분리기 어댑터 없는 연구자에 대 한 특히 유용할 수 있었다. 또, 청/윤 활 에이전트 (이 프로토콜에 BSA)의 다른 농도 사용 될 수 있습니다; 우리는 정기적으로 1 mg/mL로 높은 농도 사용합니다. 어디 긴장 BSA에 민감한 있을 수 있습니다 경우에 받아들일 만한 결과 청 에이전트의 부재에도 달성 될 수 있습니다. 실제로, 미세 장치 포자 형성, 세포 기아를 요하는 검사를 사용 하 여 했다 우리가 우리 염려 했다 BSA는 셀에 대 한 잠재적인 영양 소스 역할을 수 있습니다 하 고 그래서 우리가 그것에서 생략 중간 교류 하지 않고 어떤 실질적인 관찰 불리 한 효과22.
특히, 장치를 통해 매체의 지속적인 흐름 세포 성장 술병 같은 닫힌된 시스템에 비해 약간 다른 고기를 유도 수 있습니다. 예를 들어 영양소 또는 복합 고갈 세포 중간 흐름에서 추적 화합물을 청소 자주 수 있습니다.로, 도전적 일 수 있습니다. 실제로, 우리는 기아를 통해 셀 포자 형성을 유도 하는 것이 플라스 크에 보다 미세 장치에 장시간에서는 관찰. 마찬가지로, 우리는 산화 인 산화 decoupler 카보닐기 시안 m chlorophenyl hydrazone (CCCP)를 사용 하 여 에너지 스트레스의 유도 플라스 크 문화에 보고 보다 미세 장치에 몇 높은 농도에서는 관찰 23. 따라서 일부 최적화 다른 중간 첨가제와 만족 스러운 결과 달성 하기 위해 필요할 수 있습니다.

지구상의 생명의 가장 눈에 띄는 기능 중 하나는 그것의 큰 탄력성과 다양 한입니다. 분자 생물학의 중앙 목표는 세포를 사용 하 여 유전자와 단백질 그들의 성장 및 다양 한 환경 조건에서 피트 니스를 최대화 하는 논리를 이해 하는 것입니다. 이 위해 과학자 들은 자신 있게 관찰 할 수 있어야 합니다 어떻게 개별 셀 성장 하 고 분할 하 고, 표현 하는 조건의 주어진된 세트에서 그들의 유전자, 세포 그들의 환경에서 이후의 변화에 대처 하는 방법을 지적. 그러나, 미생물학에 전통적인 분석 방법을 해결 될 수 있는 질문의 형식에 영향을 주는 기술적인 한계를가지고. 예를 들어 대량 문화 기반 분석, 년간 매우 유용 되었습니다 아직 의미 있는 셀을 변형 또는 전체 인구에 셀의 작은 부분 모집단의 동작 마스크 수만 인구 수준 데이터를 제공 하는 그들은. 가벼운 현미경 검사 법에 따라 생활 박테리아의 단일 세포 분석 단일 셀 동작을 공개 하지만 기술적으로 제한 되어 있습니다. 박테리아 성장 매체를 포함 하는 agarose 패드에 일반적으로 움직일 수 있지만 셀과 성장 군중 미세한 보기와 실질적으로 제한 하는 관측 시간1, 단지 몇 셀 사이클 후 사용할 수 있는 영양분을 고갈 2. 또한, 영양소의 로컬 고갈 및 셀 증가로 대사 부산물의 수 반하는 상승 끊임없이 측정 또는 예측 하기 어려운 방식으로 지방 세포 성장 환경 변화는. Agarose 패드를 사용 하 여 이러한 환경 변화 연구 또는 특정 변화 성장 조건3에 세포질 응답의 정상 동작에 도전 포즈.
미세 기술, 있는 액체 매체는 ﹙ 장치를 통해 지속적으로 흘러 고전적인 실험 한계에 솔루션을 제공 합니다. 성장 매체의 흐름 끊임없이 신선한 영양소와 세포를 제공 하 고 신진 대사 부산물 및 초과 셀, 매우 균일 한 성장 만드는 씻어 미세 장치 라이브 셀 현미경 검사 법에 대 한 위치에서 개별 셀을 유지할 수 있습니다. 환경입니다. 지속적인 성장 조건에서 셀의 내부 논리에의 한 시 빨리 벗어나게 보기를 허용 하는 환경 요인의 영향에서 고립에서 셀 동작을 관찰할 수 있습니다. 유체 흐름에서 세포 군집 되 고 미세 장치를 방지, 수십 또는 수백 세대에 대 한 단일 세포 계보의 관찰 가능한4,5된다. 이러한 긴 관측 시간 달리 탐지 장기 또는 드문 셀 동작 감지를 허용합니다. 세포는 스트레스의 발병 또는 소개 또는 특정 화합물의 제거 반응으로 관찰 될 수 있도록 마지막으로, 장치를 통해 흐름에 변경 될 수 있는 매체의 구성이 됩니다.
마이크로 이미 중요 한 응용 프로그램의 수를 즐겼다. 예를 들어, 그것은 조직, 기관 또는 몸 온 칩 장치는 여러 인간 세포 유형은는 vivo에서 조건6; 시뮬레이션 공동 경작에 사용 되었습니다. microstructured 환경7; 선 충 운동의 연구에 대 한 (예를 들어, 8); 박테리아 biofilms 간의 상호 작용을 검사 하 캡슐화 및 셀 또는 화학 물질 (예, 9)의 작은 볼륨의 조작에 대 한 고. 미세 장치는 또한 그들의 물리적으로 특히 (대 한 훌륭한 리뷰 참조 10 , 11), 미생물학의 분야에서 점점 인기 되 고 흐름 속성은 자연 미생물 틈새12울린. 예를 들어, 마이크로 최근에 의해 고용 되었다 미생물학 같은 목적을 위해 정확 하 게 측정 하는 셀과 성장13,14,15, 병원 체의 운동16, 분석으로 쿼럼 감지17 및 생리 적 전환18, 모니터링 및 단백질에 대 한 세19, 다른 많은 보기 사이에서. 여기에 제시 된 방법은 긴장 또는 종의 조합 보다는 오히려 단일 세균성 세포 계보의 분석을 위해 특별히 설계 되었습니다. 여기 설명 미세 장치 활용 한 변형 "어머니 기계" 디자인4, 셀 단일 파일을 재배는 닫힌된 한쪽과 한쪽 오픈; 미세 트렌치 내 세포 성장 및 사단 푸시합니다 자손 세포 오픈 엔드에서 유체 흐름으로. 우리의 분석은 일반적으로 골짜기의 닫힌된 끝에 국한 "어머니" 세포에만 초점. 우리는 이전 가벼운 현미경 검사 법 기반 단일 셀 분석 기법, 셀 immobilization agarose 패드에 등 위에 전진으로이 메서드를 고려합니다. B. subtilis 여기 모델 사용 된다, 방법은 또한 다른 세균 종에 적용 (대장균 다른 일반적인 모델 이며 다른 셀 크기 또는 형태학 일부 종 신제품의 제조를 요구할 수 있습니다 다른 치수)와. 셀을 표시 하 고 시각화 유전자 발현에 변화를 형광 기자 사용 하려면 유전자 온순한 종;의 사용 그러나, 세포 성장 및 형태학의 분석은 형광 마커 없이 가능.
현재 프로토콜 사용 하 여 사진 평판, 다른 곳에서 광범위 하 게 설명 되었습니다5; 실리콘 마스터를 조작 하는 과정 제외 마스터 제작 시설에서 쉽게 아웃소싱 수 있습니다. PDMS 장치 강화 실리콘 마스터;에서 성형을 포함 하 고 있습니다. 커버 유리;의 장치 결합 중간 스위칭; 허용을 포함 한 핀치 밸브 미세 입구 및 출구 배관 조립, 장치 passivating 세균성 세포를 준비 하 고 세균성 세포; 장치 로드 장치에 배관 및 평형 셀; 그리고 영상에 대 한 형광 현미경에 장치를 로드. 때문에 많은 다른 이미지 수집 및 처리 소프트웨어 시각화 하 고 관심4,5의 다른 데이터 분석 도구를 사용할 수 있습니다, 예를 들어 이미지 표시 됩니다, 하지만 이미지 캡처 방법이이 프로토콜에 포함 되지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio</td></tr><tr><td>0.75-mm biopsy punch</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm No. 1.5 cover glass</td><td>VWR</td><td>48393 172</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Etch PE-50</td><td>Plasma Etch Inc.</td><td>PE-50</td><td>Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment</td></tr><tr><td>Tygon flexible tubing ID 0.02&quot;, OD 0.06&quot;</td><td>Saint-Gobain PPL Corp.</td><td>AAD04103</td><td>For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles</td></tr><tr><td>Silicone Tubing, 0.04&quot; ID, 0.085&quot; OD</td><td>HelixMark Standard Silicone Tubing</td><td>60-795-05</td><td>For pinch valves and Y-junction connection</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>Used as passivation agent</td></tr><tr><td>ART Gel Pipet Tips (P200)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>2155</td><td>For loading the device with medium and cells</td></tr><tr><td>Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-&amp;mu;m Supor membrane</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4560</td><td>For filtering cultures before device loading</td></tr><tr><td>21-ga blunt needles, 1&quot;</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A681</td><td></td></tr><tr><td>Y connector with 200-series barbs, 1/16&quot; ID tubing, polypropylene</td><td>Nordson Medical</td><td>Y210-6005</td><td>The company is AKA Value Plastics</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E inverted microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.</td></tr><tr><td>LB Lennox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bacillus subtilis&lt;/em&gt; strain NCIB3610</td><td>Bacillus Genetic Stock Center</td><td>3A1</td><td>wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol</td></tr><tr><td>Gravity convection oven</td><td>VWR</td><td>414005-106</td><td>for curing PDMS and baking assembled devices</td></tr><tr><td>Scotch-Weld Epoxy Kit</td><td>3M</td><td>2216 B/A</td><td>may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate</td></tr><tr><td>Scotch Magic tape, 3/4&quot; width</td><td>3M</td><td></td><td>to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted &quot;office tape&quot; or &quot;adhesive tape&quot; in protocol)</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td>To clean cover glass</td></tr><tr><td>Syring pump, 6 channel</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>a brand of dust-free wipes</td></tr></tbody></table>

single-cell microfluidic analysis of bacillus subtilis

미세 기술 많은 미생물학에 전통적인 분석 방법에 한계의 극복. 와 달리 대량 문화 방법, 그것은 제공 합니다 단일 셀 해상도 세대;의 수백에 걸쳐 시간 긴 관찰 agarose 패드 기반 현미경과 달리 균일 한 성장 조건에 엄격 하 게 제어 될 수 있다. 성장 매체의 지속적인 흐름 세포 성장 그리고 물질 대사, 본격적인 변화 유전자 발현 및 세포 성장에 대 한 응답에서으로 인 한 현지 화학 환경에서 예측할 수 없는 변화에서 미세 소자에서 셀 분리 하기 때문에 특정 자극을 더 자신 있게 관찰할 수 있습니다. 새 균의 subtilis 사용 "어머니 기계"를 설명 하기 위해 모델 세균성 종으로 여기-세포 분석 방법을 입력. 우리가 생성 및 미세 장치를 수직, 셀 로드, 현미경 이미징, 시작 및 다른 한 성장 매체에서 전환 하 여 세포 자극에 노출 하는 방법을 보여 줍니다. 스트레스 반응 기자가이 방법으로 얻을 수 있는 데이터의 종류를 나타내기 위해 예제로 사용 됩니다. 우리 또한 짧게 실험, 세균 포자 형성의 분석 등의 다른 종류에 대 한이 메서드의 응용 프로그램 추가 설명.

성공적인 초기 셀 로드, 미세 배관 장치에 연결 하기 전에 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 평가 모두 또는 거의 모든 미세 사이드 채널을 포함 하는 하나 이상의 세균 세포 ( 로 간주 될 것 이다 그림 3A). 최적의 로드 각 채널에서 여러 셀을 보여줄 것 이라고 하지만 채널 (그림 3B) 평형 기간 세포 성장으로 인해 셀과 그럼에도 불구 하 고 채울 것입니다. 가난한 로드, 있는 비교적 차선 몇 (< 50%) 측면 채널 셀와 함께 로드 됩니다 사용할 수 있습니다, 하지만 결과 데이터 밀도 각 영상 위치에 촬영 되 고 적은 세포 계보 인 낮은 것.
장치는 처음 로드 되 면, 미세 배관 연결 및 35 µ L/min의 상대적으로 높은 흐름 율에 장치를 통해 매체를 흐르는 equilibrated 이다. 평형 단계 장치에서 먹이 채널에 공기 거품과 과잉 세포를 제거 하 고 성장 하려면 사이드 채널에 세포를 격려를 제공 합니다. 있으 나 중간 흐름에 따라 장치에서 제거 된 셀 폐기물 컨테이너;으로 콘센트 튜브를 통해 이동 하는 밝은 색 밴드로 맨 눈으로 자주 관찰 될 수 있다 같은 밴드의 움직임 액체 배관 및 장치를 통해 정상적으로 흐르는 시각적 표시기 역할을 합니다. Equilibrated 장치의 현미경 검사 (그림 3B, 0 분) 측면 채널의 대부분에서 단일 파일에 몇 가지 셀을 계시 해야 한다.
일단 equilibrated 장치는 현미경에서 37 ° C에서 1.5 µ L/min 흐름 아래에 배치 됩니다, 셀 (그림 3B) 약 2 시간에 걸쳐 균일 하 고 일정 한 지 수 단계 성장을 재개 됩니다. 일정 한 지 수 성장 세포의 생성 시간에 고원의 모양으로 이미지 분석 후 직접 확인 한다. 이 시점에서, 세포 형광 또는 원하는 대로 이미징 명시에 대 한 준비가.입니다. 성공적으로 로드 하 고 equilibrated 장치 수 있습니다 일반적으로 될 안정적으로 몇 군데 이상 24 h (그림 4A, C)의 동안. 실험을 실시 될 수 있지만 또한 사건의 치명적인 세포 죽음 (그림 4D), 공기의 도입을 통해 아마도 주파수의 범위를 확장 중간 스위치 (그림 4A-C) 소개 튜브에서 성공적으로 제거 하지 했다 거품 치명적인 세포 죽음을 일으킬 수 있는 다른 이벤트는 입구에 있는 셀의 클러스터 제거 될 수 있습니다 먹이 채널을 통해 전달 그림 4D와 같이. 우리가 이해 하지 못하는 현재 왜이 치명적인 세포 죽음 장치에 원인과 우리가 아직 발생 등을 방지 하는 방법을 고안 하지.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56901/56901fig1.jpg"> 그림 1: 미세 장치 회로도. 장치 회로도를 약 표시 됩니다. 알파벳 지정자는 무뚝뚝한 끝난 바늘을 연결 하는 구멍을 뚫은 입구 및 출구 영역에 함께 표시 됩니다. 일반적으로, 패턴화 된 채널의 절반은 사용 (회색 음영된). 셀 참호는 지정자 향하고 있습니다. 동반 CAD 파일 장치에 모든 기능을 보여줍니다 ( 보충 파일 1참조). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56901/56901fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56901/56901fig2.jpg"> 그림 2: 미세 장치 패 시 베이 션, 로드 셀, 및 평형. (A) A BSA 포함 된 매체와 패 시 베이 션 후 보 세 장치. 젤 로드 팁 장치를 통해 매체와 셀의 흐름을 모니터링 하는 콘센트 구멍에 보관 됩니다. 중간 초승달 모양 젤 로드 팁 (화살표)의 얇은 부분에 표시 됩니다. 후 셀 (B) 장치. 셀 젤 로드 팁 (화살표)에서 반투명 흰색 레이어로 볼 수 있습니다. (C) 젤 로드 팁 사용자 정의 조작 원심 분리기 어댑터에 원심 분리 하기 전에 제거 됩니다. 의료 테이프 (블루) 쿠션 장치를 알루미늄 부품에 배치 됩니다. (D) 다음 원심 분리와 로드의 검증, 장치 현미경 단계 삽입을 녹화 및 입구와 출구 핀에 연결 된. 표시 된 이미지에서 중간 스위칭 가능한 의해 이루어집니다 핀치 밸브와 Y-커넥터 micropipette 팁 상자에서 만든 기구에 배열 하는. (E) 전체 조립된 장치, 폐기물 컨테이너에 주사기 펌프에서의 구조도 볼 수 있습니다. 콘센트 배관 작은 폐기물 비 커를 실행합니다. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56901/56901fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56901/56901fig3.jpg"> 그림 3: 로드 및 미세 장치에서 성장 세포. (A) 왼쪽 오른쪽, 단계 대조 현미경 원심 후만 셀 로드 하기 전에 매체, 같은 셀 pipetting 통해 하지만 원심 분리, 전에 추가 된 후 장치와 같은 장치를 포함 하는 장치에서. (B) 셀 적응과 성장 장치 (LB, 37 ° C, 흐름 1.5 µ L/min)에서 시간 과정. 적응의 시작 부분에 고정 단계 세포는 비교적 짧고 좁은. 와 셀 적응 지 수 단계 성장 (60-120 분)에 반환, 그들은 길고 넓은 형태를 채택 한다. 120 분 후 장치에 있는 모든 세포는 균일 한 지 수 단계 성장 재개 되며 장치 이미징에 대 한 준비. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56901/56901fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56901/56901fig4.jpg"> 그림 4: 세포 성장 및 미세 장치에 전환 하는 중. (A) Kymographs 전과 성장의 중간 스위치 (회색 파선) 후 2% 에탄올으로 스트레스도 1000 분의 성장 550 분 보여주는. 이미지는 10 분 간격으로 점령 했다. 상단 패널 transcriptional mNeonGreen 기자 (녹색 채널) 스트레스 유도 유전자에 대 한 보여줍니다. 하단 패널 제정 mNeptune 기자 (빨강 채널) 자동화 된 셀 세분화에 대 한이 경우에 사용 되는 보여줍니다. (B) 클로즈업 보기 패널 A에에서 점선된 상자에서 kymographs의 부분의 중간 스위치 다음 녹색 채널에 과도 응답을 보여주는. 비록 에탄올의 존재 하면 짧은 되 고 약간 더 느린 걸음에 성장 세포 성장 스위치를 통해 계속 note. 시간 규모 가로 막대로 표시 되 고 거리는 세로 막대로 표시 됩니다. (C) 예제 에서처럼 패널 A. 실험에서 단일 셀 혈통의 형광 분석된 데이터의 흔적 파선된 수직선으로 스트레스 2% 에탄올으로 중간 스위치를 나타냅니다. (D) 실패 한 중간 스위치의 예입니다. 두 번째 중간에 셀을 도달 하면, 채널에 셀 lysed는. 스위치 (세탁 아웃 영역에 해당 다시 축소 이미지 바로 위에 표시 됩니다) 밝은 형광 신호를 일으키는 원인이 되는 주요 채널에 통과 하는 셀의 많은 수를 동반 된다. 후에 스위치를 어렴풋이 형광 세포 파편 채널에 남아 있지만 더 셀 관찰 된다. 시간 규모 가로 막대로 표시 되 고 거리는 세로 막대로 표시 됩니다. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56901/56901fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석

우리는 예를 들어 새 균의 subtilis 를 사용 하 여 개별 세균성 세포 계보의 미세 분석 하는 방법을 제시. 메서드를 긴밀 하 게 제어 하 고 균일 한 성장 조건 셀 세대의 수백의 관찰 함으로써 미생물학에 전통적인 분석 방법의 단점을 극복 했다.

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

11.9K 조회수.  Oklahoma State University. 우리는 예를 들어 새 균의 subtilis 를 사용 하 여 개별 세균성 세포 계보의 미세 분석 하는 방법을 제시. 메서드를 긴밀 하 게 제어 하 고 균일 한 성장 조건 셀 세대의 수백의 관찰 함으로써 미생물학에 전통적인 분석 방법의 단점을 극복 했다.

비디오: Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

연구

면역학 및 감염병학

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

생체공학

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as hydrodynamics, ecology and environmental engineering. Modeling bacterial transport in porous environments at different spatial scales is critical to better predict the consequences of bacterial transport, yet current models often fail to up-scale from laboratory to field conditions. Here, we introduce experimental tools to study bacterial transport in porous media at two spatial scales. The aim of these tools is to obtain macroscopic observables (such as breakthrough curves or deposition profiles) of bacteria injected into transparent porous matrices. At the small scale (10-1000 &#181;m), microfluidic devices are combined with optical video-microscopy and image processing to obtain breakthrough curves and, at the same time, to track individual bacterial cells at the pore scale. At larger scale, flow cytometry is combined with a self-made robotic dispenser to obtain breakthrough curves. We illustrate the utility of these tools to better understand how bacteria are transported in complex porous media such as the hyporheic zone of streams. As these tools provide simultaneous measurements across scales, they pave the way for mechanism-based models, critically important for upscaling. Application of these tools may not only contribute to the development of novel bioremediation applications but also shed new light on the ecological strategies of microorganisms colonizing porous substrates.

Breakthrough curves (BTCs) are efficient tools to study the transport of bacteria in porous media. Here we introduce tools based on fluidic devices in combination with microscopy and flow cytometric counting to obtain BTCs.

유체 장치를 현미경 검사법과 유동 세포측정과 결합하여 공간 저울을 가로지르는 다공성 미디어에서 미생물 수송을 연구합니다.

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

환경과학

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

생물학

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

유학을위한 방법론<em&gt; B. 서브 틸리</em작은 분자 바이오 필름 억제제를 특성화 모델로&gt; 바이오 필름

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing need for the development of methodologies that improve the detection of antigens immobilized on the surface of spores together with their quantification. Flow cytometry-based analyses have been previously proposed as fast, reliable, and specific approaches for detecting labeled cells of B. subtilis. Herein, we propose the use of flow cytometry to evaluate the display efficiency of a fluorescent antibody (FA) on the surface of the spore and quantify the number of spores using counting beads. 
For this, we used ethidium bromide as a DNA marker and an allophycocyanin (APC)-labeled antibody, which was coupled to the spores, as a surface marker. The quantification of spores was performed using counting beads since this technique demonstrates high accuracy in the detection of cells. The labeled spores were analyzed using a flow cytometer, which confirmed the coupling. As a result, it was demonstrated that DNA labeling improved the accuracy of quantification by flow cytometry, for the detection of germinated spores. It was observed that ethidium bromide was not able to label dormant spores; however, this technique provides a more precise determination of the number of spores with fluorescent protein coupled to their surface, thus helping in the development of studies that focus on the use of spores as a biotechnological platform in different applications.

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

This protocol focuses on the use of flow cytometry and counting beads to quantify bacterial spores labeled with ethidium bromide. The method is also efficient for analyzing the covalent coupling of proteins on the surface of intact spores.

Bacillus subtilis 포자 계수 및 유세포 분석의 표지 분석 개선

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

생화학

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

화학적 매개 종간의 상호 작용을 검출하는 공 배양을 사용하여

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석

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