Name: polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis
Uploaded: 2018-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis at JoVE.com

저자는 오디오 녹음에 대 한 칭이 감사합니다. 연구 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터에서 창업 자금에 의해 지원 되었다 및 변환 신경 과학 및 치료제 (CTNT) 우수의 센터에 의해 부여 PN CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; NIH 교부 금에 의해 부분에서 R01AI099380 K.Z. 제임스 C. 퍼레이드와 순 영 R. Baca CISER (줄기의 통합 교육 및 연구를 위한 센터) 학자 고 프로그램에 의해 지원 되었다.

모든 동물 치료 및 연구에서 얻은 조직의 취급 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 국가 학회에 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 했다 건강 동물 복지 지침, 프로토콜 번호 96005입니다. 척 추가 있는 동물을 희생 하 고 지침에 따라 조직 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 준비 하십시오. 이러한 위원회 부족, 건강의 국가 학회 동물 복지 가이드라인을 참조 하십시오. 성인 (> 60 일 이전) C57BL/6 마우스 사용 되었다. 모든 동물 및 조직 기관 동물 관리 및 사용 위원회 건강의 국가 학회 동물 복지 지침에 따라 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 얻은 했다. 안락사, 단일 마우스 작은 챔버에 배치 했다 그리고 공중 약 30%로 점차적으로 전치 되었다 이산화탄소는 동물의 고통을 최소화 하 고 anesthetize. 호흡의 정지, 다음 우리는 조직 수확 전에 동물의 죽음을 확인 하 경부 전위를 사용.
주의: 라이브 Leishmania 경작된 한 인간 세포와 모든 작업 biosafety BSL-2 실험실 인증 캐비닛에서 이루어졌다.
1. 준비에서 세포질 Lysates의 Leishmania 주요 , 경작된 한 인간 세포 및 마우스 조직
참고: 다른 원본 자료에서 lysate 준비에 몇 가지 차이점이 있습니다. 자당 그라데이션 준비와 polysomal 분류를 포함 하 여 다른 단계는 동일 하 고 샘플 소스에 종속 되지 않습니다.
<ol><li>
Leishmania 주요 세포질 lysate 준비
	<ol>
<li>주요 Leishmania (FV1 스트레인) 셀 1 x M199 중간29 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)과 페니실린/스 혼합물 포함 30 mL에 접종 (100 단위 및 100 μ g/mL correspondingly)1 x 105 셀/mL의 농도에서 . 참고: 캐비닛 biosafety Leishmania 주요 셀을 포함 하는 모든 단계를 실시 해야 합니다.</li>
		<li>인큐베이터에 셀을 배치 하 고 로그 단계까지 27 ° C에서 그들을 성장 (로그 중반에 해당 5 x 106 셀/mL). 그것은 일반적으로 성장을 약 2 일 걸립니다.</li>
		<li>Leishmania 주요 문화 번역 된 mRNAs에 리보솜 체포를 100 μ g/mL의 최종 농도에 cycloheximide를 추가 합니다. 27 ° c.에서 10 분 동안 인큐베이터에 다시 장소 세포</li>
		<li>Cycloheximide 치료 완료 후 50 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송 하 고 1800 x g와 8 분 삭제 상쾌한에 4 ° C에서 그들을 회전.</li>
		<li>Dulbecco의 버퍼 인산 염 (DPBS) 30 mL로 세포 세척. 원심 분리기에서 1800 x g와 4 ° C 8 분.</li>
		<li>폐기는 상쾌한. 셀 DPBS의 1 mL에 resuspend</li>
		<li>셀의 약 수 고 3.5% 포름알데히드 솔루션을 함께 섞는다.</li>
		<li>Hemocytometer 여 셀 개수 하 고 그들의 농도 결정 합니다. Microfuge 관으로 원하는 셀 수를 전송 합니다. 0.5x108-2 x 108 셀/mL에서 준비 Lysate 한 자당 그라데이션 선적을 위해 충분 하다.</li>
		<li>1800 x g에서 셀 회전와 4 ° C 8 분에 대 한 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>Protease 억제제와 RNase 억제제 (20 mM HEPES-코, pH 7.4, 100 m m KCl, 10mm MgCl2, 2mm DTT, 1 %NP-40, 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (EDTA 무료), 200 단위/mL RNase 억제제)를 포함 하는 세포의 용 해 버퍼의 1 mL에 얼음에 셀 펠 릿 resuspend</li>
		<li>통과 lysate 23 게이지 바늘을 통해 세 번. lysate 해야 될 투명 바늘 통과 후.</li>
		<li>원심 분리기 11,200 x g와 lysate 명확 하 게 10 분 동안 4 ° C 명확히 전송 lysate 신선한 튜브와 자당 그라데이션 ultracentrifugation까지 얼음에 그것을 유지.</li>
		<li>수집 입력으로 (나중에 분석), lysate의 400-500 μ 바로 미래의 단백질 분석을 위한 액체 질소 동결 또는 RNA 분석에 대 한 동결 전에 RNA 정화 시 약을 추가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
배양된 인간 헬러 세포에서 세포질 lysate 준비
	<ol>
<li>헬러 세포를 분할 하 고 20 mL의 10 %FBS 페니실린/스 혼합물 포함 된 DMEM 매체에 씨앗 (100 단위 및 100 μ g/mL correspondingly) 셀 계산 2 x 105 셀/mL 15 cm 접시에.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2 제조 업체의 프로토콜에 따라 20-24 h. 수행 플라스 미드 DNA transfection에 HeLa 세포 성장.</li>
		<li>37 ° c, 5% CO2transfection 후 24 h에 대 한 셀을 전파 합니다.</li>
		<li>번역 된 mRNAs에 리보솜을 체포 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 10 분에 대 한 셀을 품 어를 100 μ g/mL의 최종 농도에 성장된 HeLa 세포에 cycloheximide를 추가 합니다. 중간 발음 얼음에 차가운 DPBS 셀 두 번 씻는 다.</li>
		<li>접시에 500 μ의 세포의 용 해 버퍼 (20 mM HEPES 코 pH 7.4, 100 m m KCl, 5 mM MgCl2, DTT, 0.5 %NP-40, 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일 1 mM (EDTA-무료), 단위/200ml의 RNase 억제제 또는 1 mg/mL 헤 파 린)를 추가 하 고 얼음에 셀을 다쳤어요.</li>
		<li>Microfuge 관 lysed 세포를 전송 합니다. 0.5% 및 MgCl2 는 샘플의 양이 증가 따라 5mm NP-40의 농도 조정 합니다.</li>
		<li>통과 lysate 23 게이지 바늘 3-6 시간.</li>
		<li>스핀 11,200 x g와 lysate 명확 하 게 8 분 4 ° C. 원심, 후 상쾌한 새로운 튜브를 전송 합니다. 세포 세포의 용 해 효율을 평가 하 고 그라데이션에 로드에 대 한 샘플 크기를 결정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다. 0.1%의 0.5 mL를 추가 하는 샘플의 10 μ 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS). 0.1 %SDS 대 한 빈. 260에서 흡 광도 측정 nm. 예상된 흡 광도 값은 주위 15-20 단위/mL.</li>
		<li>자당 기온 변화도 원심 분리 하기 전에 같은 흡 광도 값을 세포의 용 해 버퍼 모든 샘플을 희석. 자당 기온 변화도 원심 분리까지 얼음에 샘플을 계속.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스 고환에서 세포질 lysate 준비
	<ol>
<li>마우스 고환 해 부. Tunica albuginea에 작은 절 개를 하 게 하 고 testes의 seminiferous tubules를 수집 하 고 0.1 m m phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 보충 하는 DPBS의 5 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 그들을 전송.</li>
		<li>여러 번을 반전 하 여 적극적으로 조직을 믹스. 5 분 동안 얼음에 단위 중력에 정착을 조직을 수 있습니다.</li>
		<li>제거 하 고 연결 세포와 조직 파편을 포함 하는 흐린 버퍼를 삭제 합니다. 절차 2-3 번 더 반복 합니다. 나머지 흰색 펠 릿 seminiferous tubules 및 생식 세포 농축입니다.</li>
		<li>2 mL microcentrifuge 튜브를 seminiferous 관 펠 릿을 전송 및 스핀 1 분에 500 x g에서 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>tubules에 세포의 용 해 버퍼 (20 mM Tris HCl, pH 7.4, 100 m m KCl, 5 mM MgCl2, DTT, 0.5 %NP-40, 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일 1 mM (EDTA-무료), 1 mg/mL 헤 파 린 또는 RNase 억제제의 200 단위/mL)의 500 µ L를 추가 합니다. 한 피 펫을 사용 하 여 조직 triturate.</li>
		<li>작은 정지 전송 (0.5-1.0 mL) Dounce 균질 화기. 유리 유 봉의 7 ~ 8 스트로크 조직 방해.</li>
		<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브 lysate를 전송할.</li>
		<li>12000 x g와는 lysate를 8 분 동안 4 ° C에서 샘플 원심 자당 기온 변화도에 로드 될 때까지 얼음에 새로운 튜브와 저장소에는 상쾌한 전송.</li>
		<li>수집 하는 입력된 샘플으로 lysate의 50 μ, 향후 단백질 분석;-80 ° C에서 그것을 지금 당장 동결 또는 RNA 분석에 대 한 동결 전에 RNA 정화 시 약을 추가.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 자당 그라데이션 준비 및 Ultracentrifugation
<ol><li>두 자당 그라데이션 (20 mM HEPES-코, pH 7.4, 100 m m KCl, 10mm MgCl2, 1mm DTT, 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일), 포함 하는 솔루션 10% 자당 또는 50% 자당을 준비 합니다. (PH 7.4, Tris HCl HEPES 대신 사용할 수 있습니다). 200 단위/mL RNase 억제제 또는 1 mg/mL 헤 파 린 실험 디자인에 따라 추가 합니다. 마커 블록으로 남서 41로 터에 대 한 ultracentrifuge 튜브를 놓고 블록의 상위 레벨에 따라 라인을 그립니다. 안정적인 랙 튜브를 전송 합니다.</li>
	<li>연결 된 레이어 링 장치 10 mL 주사기를가지고 하 고 10% 자당 해결책 (위와 같이 준비)와 주사기를 입력. 마크 튜브에 도달할 때까지 부드럽게 ultracentrifuge 튜브의 하단에 그것을 해제.</li>
	<li>50% 자당 해결책으로 다른 주사기를 조심 스럽게 삽입 튜브의 아래쪽 10% 자당 레이어를 통해 그것의 레이어 링 장치. 부드럽게 튜브에 마크에 도달할 때까지 아래에서 시작 하는 자당 솔루션 출시. 제공 된 모자와 튜브 인감.</li>
	<li>자당 기온 변화도 준비 하려면 그라데이션 메이커 장치에 설정 합니다. 위로 또는 아래로 단추를 사용 하 여 접시를 레벨 하 고 DONE을 누릅니다. 수평 선형 그라데이션에 대 한 중요 하다입니다.</li>
	<li>접시를 평준화 후 대학원 그라데이션 메뉴를 열려면 누릅니다. 목록 에 그라데이션 메뉴에가 고 남서 41 Ti로 터를 선택. 다음 위로 및 아래로 단추를 사용 하 여 메뉴의 목록에서 원하는 자당 그라디언트를 선택 합니다. 사용키를 누릅니다.</li>
	<li>그라데이션 튜브 홀더를 그라데이션 메이커 접시에 놓습니다. 소유자에 튜브를 전송 합니다. 6 그라데이션까지 동시에 준비 될 수 있다. 눌러서 실행합니다. 그라데이션 메이커 프로그램된 속도 선형 그라데이션을 형성 하는 각도에서 튜브를 회전 합니다. 그라디언트를 준비 하는 몇 분 밖에 소요 됩니다.</li>
	<li>프로세스가 완료 되는 때, 튜브 랙에 배치. 모자를 벗어. Ultracentrifuge 튜브의 상단에서 샘플 볼륨으로 동일한 볼륨을 제거 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 lysate의 상단에 polysomes 15 20 A260 단위를 포함 하는 400-500 μ 로드. 로 터 양동이에 튜브를 놓고 균형을 합니다.</li>
	<li>원심 분리기 260000 x g와 4 ° C 2 h SW 41로 터를 사용 하 여.</li>
</ol>3. polysome 분류 및 샘플 컬렉션
참고: lysate 준비 소스에 따라 약간의 차이가 있지만, 그라데이션 준비 및 polysome 분별 프로토콜은 lysates의 모든 종류에 대해 동일 합니다.
<ol><li>완료 후에 ultracentrifugation의, 얼음에 튜브와로 터 양동이 놓습니다. 일부 수집기 및 그라데이션 fractionator ON을 설정 합니다. Fractionator 메뉴에서 검색 을 클릭 합니다. 분수 수집기에 24 컬렉션 튜브와 선반을 넣어.</li>
	<li>이온을 제거 된 물으로 fractionator 측면 린스 저수지를 작성. 린스 키 10 s fractionator에 펌프를 씻어. 보정에 대 한 피스톤에 물으로 채워진 주사기 린스 어댑터를 연결 합니다.</li>
	<li>컴퓨터에 fractionator 소프트웨어를 엽니다. 보정을 누릅니다. 기본 설정을 사용 하 고 확인을 누릅니다. 주사기에서 물을 주사를 준비가 되어있습니다.</li>
	<li>보정 확인 을 누릅니다. 즉시 다음 5에 대 한 물 주입 시작 s. 이 시간 동안 UV 검출기 흐름 셀 통해 물 흐름 것 이다 하 고 악기를 측정 될 것 이다. 부호 0 교정 완료 나타납니다. 악기 분류에 대 한 준비가 되어있습니다.</li>
	<li>주사기와 린스 어댑터를 제거 합니다. 팁은 fractionator의 피스톤에 연결 합니다.</li>
	<li>황동 공기 밸브와 언론에 어 키 10 건조 관과 흐름 셀을 s. 공기 밸브를 닫습니다.</li>
	<li>부드럽게 회전자 통에서 그라데이션 튜브를 제거 하 고 선반에 그것을 배치. 튜브의 상단에 튜브 홀더 캡 적용 신중 하 게 튜브 튜브 홀더 이동 하 고 위치에 그것을 잠금.</li>
	<li>아래는 fractionator 피스톤 홀더를 배치 합니다. 종종, polysomal 악대는 눈으로 볼 수 있습니다. 분수 숫자와 볼륨에 대 한 원하는 설정을 소개 (500 μ/분수 24 분수는 일반적으로 충분 한). 파일을 적절 하 게 이름을 지정 합니다. 확인, 그리고 그래프를 이동 버튼을 누릅니다. 다음 창에서 검색 시작을 누릅니다. 확인을 눌러 설정 표시 됩니다. 수집기는 첫 번째 분수 시 궁 창에서 이동할 것 이다 고 피스톤 튜브로 이동 합니다. 피스톤 그라데이션의 상단에 도달 하면 선택한 속도에 느린 것입니다 하 고 분수를 수집 합니다. 완료 되 면, 피스톤 그라데이션 튜브 이동 합니다.</li>
	<li>황동 공기 밸브와 언론 어 키를 마지막 분수 검색 fractionator에서 엽니다.</li>
	<li>얼음에는 선반에서 튜브를 이동 합니다.</li>
	<li>2 양의 RNA 정화 시 약 각 분수를 플래시 RNA 정화까지 액체 질소에서 고정을 추가 합니다. 또는, 단백질 분석 하는 경우, 서쪽 더 럽 히 (섹션 8 참조)에 대 한 집중에 10%의 최종 농도에 trichloroacetic 산을 추가 합니다.</li>
</ol>4. 실시간 정량 데이터 분석 수준 동안 mRNAs의 정규화에 대 한 합성 RNA 생체 외에서 준비
참고: 대장균 OmpA mRNA 정규화에 대 한이 프로토콜에 사용 됩니다. 광범위 한 정체성 공부 유 기체의 mRNAs가 없는 다른 RNA (포유류 또는 Leishmania) 사용할 수 있습니다.
<ol><li>OmpA 유전자30를 포함 하는 플라스 미드에서 표준 PCR 반응에 의해 SP6 발기인 시퀀스가 포함 된 OmpA DNA 파편을 준비 합니다.</li>
	<li>혼합물의 100 µ L를 준비: 80 mM HEPES-코, pH 7.5, 16 m m MgCl2, 2 mM Spermidine, 10mm DTT, ATP, CTP, 3mm 3mm 3mm UTP, 3mm GTP, 0.5 U/μ RNase 억제제, OmpA PCR DNA, 3 μ s p 6 RNA 중 합 효소의 1 μ g 0.005 U/μ pyrophosphatase.</li>
	<li>2 시간 동안 40 ° C에서 품 어.</li>
	<li>RNA 정화 키트에 의해 RNA를 정화.</li>
	<li>분 광 광도 계에 의해 농도 측정 하 고 agarose 젤 전기 이동 법으로 검사.</li>
</ol>5. RNA 격리 그라데이션 분수를 cDNA 준비
참고: RNase 억제제 ribonuclease 억제제로 사용 하는 경우이 프로토콜 RNA 정화와 직접 진행 합니다. 그러나, ribonuclease 억제제로 사용 하는 경우 헤 파 린 역전사 cDNA 준비에 사용 된 억제 됩니다. 따라서, 추가 정화 RNA의 헤 파 린 세포의 용 해 버퍼 및 그라데이션에 사용 된 경우에 필요 합니다. 헤 파 린 사용 cDNA 합성에 RNA를 준비 섹션 6을 참조 하십시오.
<ol><li>RNA 정화 시 약을 포함 하는 샘플을 녹여, 20를 추가 실시간 정량 Pcr 결과의 정규화에 대 한 내부 통제로 합성 RNA의 ng. 한 수정 제외 하 고 제조 업체의 프로토콜에 따라 RNA 준비 진행. RNA 학년 glycogen (20 µ g) 이전 소 프로 파 놀 강수량의 1 µ L를 추가 합니다. 20-25 µ L RNase 무료 물 펠 릿 RNA를 분해. 참고: Glycogen 캐리어 역할 하 고 손실을 방지 하 고 정화 동안 RNA 펠 릿을 시각화 하는 데 도움이. OmpA mRNA는 실시간 정량 Pcr 반응에 더 정규화에 사용 됩니다.</li>
	<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 적절 한 수익률을 보장 하는 RNA 농도 측정 합니다. 40, 60 및 prepolysomes로 monosomes를 포함 하는 RNA 분수의 동일한 볼륨을 결합 한다. 2-4 리보솜을 포함 하는 분수 빛 polysomes로 결합 하 고 5-8 리보솜과 분수 무거운 polysomes로 결합.</li>
	<li>결합 된 분수에서 RNA의 5-10 µ L를 사용 하 여 cDNAs 키트를 사용 하 고 제조 업체의 권장 사항에 따라 준비.</li>
	<li>CDNA의 20 µ L를 nuclease 무료 물 80 µ L를 추가 합니다. -20 ° c.에 cDNA 샘플을 동결</li>
</ol>6. RNA 정화 덤플링 오염에서
참고: 헤 파 린 같은 역전사 효소를 처리 하는 핵 산을 억제. 따라서, 세포의 용 해 버퍼 또는 그라데이션에서 헤 파 린 사용이 추가 정화 프로토콜을 사용 합니다.
<ol><li>순화 된 RNA 샘플을 1 M 최종 농도에 LiCl을 추가 합니다.</li>
	<li>샘플을 혼합 하 고 1 시간에 대 한 얼음에 품 어.</li>
	<li>샘플에서 16000 x g와 15 분 동안 4 ° C 회전.</li>
	<li>가능한 한 피 펫을 사용 하 여 완전 한 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>약 5 분 동안 펠 릿 건조</li>
	<li>다시 물 RNase 무료 초기 볼륨에 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>260에 spectrophotometric 측정을 수행 RNA의 농도 결정 하기 위해 nm. 일반적으로, 샘플의 손실 최소화 됩니다.</li>
</ol>7. 실시간 정량 Pcr 및 mRNA 분포의 데이터 분석
<ol><li>물, SYBR 녹색의 20 μ, 유전자 특정 뇌관 (2.5 μ M 세트)의 4.8 μ의 10.2 μ, cDNA의 5 μ를 결합 하 고 잘 섞어 384-잘 접시에 잘 triplicates에 당 10 μ를 로드.</li>
	<li>접착 필름으로 접시를 단단히 커버 하 고 접시 5 분 1800 x g에서 원심.</li>
	<li>실시간 PCR 악기를 사용 하 여 표 1에 표시 된 조건에서 정량 반응을 설정 합니다.</li>
	<li>사이클 임계값 (CT)를 사용 하 여 값과 비교 CT (ΔΔCT) 방법31 계산 백분율 (%) prepolysomes, 빛, 그리고 무거운 polysomes 한 수정 설명된32 로 mRNA 분포의. 합성 RNA (OmpA 여기)를 사용 하 여 실시간 정량 데이터 분석에서 데이터 정규화에 대 한. 합성 RNA 상대 mRNAs 레벨을 계산 하 여 그라디언트의 다른 분수에 그들을 비교할 수 있는 정규화 제어를 제공 합니다.</li>
</ol>8. 서 부 Blotting에 의해 Polysomal 분수에 단백질의 분석
<ol><li>100% (w/v) 주식에서 추가 trichloroacetic 산 (TCA) 10%의 최종 농도에 선택한 분수 (500 μ) 적어도 15 분, 5 분 대에 microfuge 분리기 얼음 계속, 상쾌한 삭제, 차가운 아세톤과 두 번 세척 및 25 μ S의 분해 전기 이동 법에 대 한 DS-페이지 샘플 로딩 버퍼입니다.</li>
	<li>SDS 페이지에 로드 하 고 다음 전송 전송 PVDF 막에 표준 전기 이동 법을 실시. 33를 더럽혀 서 진행 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+the+human+parasite+Leishmania+major+delineates+a+30-kilobase+region+sufficient+for+extrachromosomal+replication+and+expression.">Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression.</a> Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).</li><li>Karamyshev, A. L., Johnson, A. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li></ol>

저자는 공개 없다.

자당 기온 변화도 의해 polysome 분별 RNA와 결합 및 분수의 단백질 분석은 개별 mRNAs 또는 전체 translatome의 변환 상태 뿐만 아니라 변환 조절 단백질 요인의 역할을 분석 하는 강력한 방법을 정상적인 생리 적 또는 질병 상태 기계입니다. Polysomal 프로 파일링은 Leishmania transcriptional 제어 크게 결 석 하 고 유전자 표현 규제는 주로 발생을 포함 하는 trypanosomatids와 같은 유기 체에 있는 변환 규칙을 ...

세포에 있는 유전자 발현의 규칙 transcriptional, posttranscriptional 및 posttranslational 메커니즘에 의해 제어 됩니다. 깊은 RNA 시퀀싱에서 전례 없는 수준에 게놈 넓은 규모에 정상 mRNA 수준의 연구를 수 있습니다. 그러나, 최근 연구 결과 밝혀 정상 mRNA 수준은 단백질 생산1,2와 항상 연결 되지 않습니다. 개별 성적표의 운명 매우 복잡 하 고 내부/외부 자극, 스트레스 등과같은 많은 요인에 따라 달라 집니다. 단백질 종합 동안에 유전자 발현의 규칙 변화에 신속한 대응에 필요한 식 컨트롤의 또 다른 레이어를 제공 합니다. 프로 파일링, 분리 및 리보솜, 적극적으로 번역의 시각화 polysome (또는 "polyribosome") 단백질 종합의 규칙을 공부 하는 강력한 방법입니다. 비록, 그것의 첫번째 실험적인 응용 프로그램 1960 년대3에 등장, polysome 프로 파일링은 현재 단백질 번역 연구4에서 가장 중요 한 기술 중 하나. 단일 mRNAs는 polysome의 형성을 선도 하는 하나 이상의 리보솜에 의해 번역 될 수 있다. 성적 증명서 cycloheximide5 리보솜에 지연 수 있습니다 및 mRNAs polysomes의 다른 숫자를 포함 하 여 자당 그라데이션 ultracentrifugation6,7 polysome 분류 과정에서 분리 될 수 있다 , 8 , 9. polysomal 분수의 RNA 분석 수 있습니다 개별 mRNAs의 변환 상태에 변화의 측정 및 다른 생리 적인 조건4,7, 중 게놈 넓은 규모에 10. 5' UTR 및 3' UTR 시퀀스 mRNA translatability11의 제어의 역할을 공개, 번역 상 진압12miRNAs의 역할을 검토, 리보솜 속13에에서 결함을 밝히기 메서드를 또한 사용 , 인간의 질병14,15리보솜 관련 단백질의 역할을 이해 하 고. 지난 10 년 동안 번역 중 유전자 발현의 규칙을 위한 성장 역할 인간의 질병에 그것의 중요성을 나타내는 등장 했습니다. 암, 대사에 변환 제어 및 신경 퇴행 성 질환에 대 한 증거는 압도적인15,,1617,18. EIF4E-종속 변환 제어의 dysregulation에 기여 하는 예를 들어 자폐증 관련 적자15 와 FMRP은 자폐증14에 연결 된 mRNAs에 리보솜의 연기에 참여 하 고. 따라서, polysomal 프로 파일링 변환 여러 인간 질병에 있는 결함을 공부 하는 매우 중요 한 도구입니다.
다른 생리 적인 조건 하에서 polysomal 분수의 단백질 분석 번역 중 리보솜과 관련 된 요인의 기능 dissects. Polysome 프로 파일링 기법 등 효 모, 포유류 세포, 식물, 원생 동물10,19,,2021많은 종에서 사용 되었습니다. Trypanosoma 등 Leishmania protozoan 기생충 유전자 발현의 제한 된 transcriptional 제어를 전시 한다. 그들의 유전자는 polycistronic 유전자 클러스터 발기인 통제 전사22부족으로 구성 됩니다. 대신, 발달 유전자 발현은 주로 단백질 번역 및 trypanosomatid 종23,24에 mRNA 안정성의 수준에서 제어 됩니다. 따라서, 이해 transcriptional 규칙의 부재에서 변환 제어의이 유기 체에 대 한 특히 중요 하다. Polysomal 프로 파일링 Leishmania25,26,,2728에 유전자 발현의 posttranscriptional 레 귤 레이 션을 공부 하는 강력한 도구입니다.
진짜 개인적인 mRNAs 레벨의 검출에 최근 진행 시간 정량 PCR (RT-정량) 및 차세대 시퀀싱, 프로 테오 믹스 기술에 의해 전체 transcriptome, 해상도 새로운 수준 polysomal 프로 파일링의 장점을 제공 합니다. 이러한 메서드를 사용 하 여 깊은 RNA 시퀀싱 proteomic 분석 게놈 넓은 규모에 셀의 변환 상태를 모니터링을 결합 하 여 개별 polysomal 분수의 분석에 의해 더 확장 수 있습니다. 다른 생리 적 및 병 적인 조건 하에서 번역을 규제 하는 새로운 분자 선수의 식별 수 있습니다. 여기, 우리는 세 가지 모델에 사용 되는 프로토콜을 프로 파일링 범용 polysome 제시: 기생충 주요 Leishmania, 경작된 한 인간 세포 및 동물의 조직. 우리는 다른 유기 체, 그라데이션 조건의 최적화, RNase 억제제의 선택과 polysome 분수가이 연구에서 분석 하는 실시간 정량, 서쪽 오 점 및 RNA 전기 이동 법의 응용 프로그램에서 세포 lysates의 준비에 조언을 제시.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gradient master</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>108</td><td></td></tr><tr><td>Piston Gradient Fractionator</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>Fraction collector</td><td>Gilson, Inc.</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>Nikon inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2-FL/Ts2</td><td></td></tr><tr><td>2720 Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems by Life Technologies</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Panasonic Healthcare Co.</td><td>MCO-170A1CUV</td><td></td></tr><tr><td>HERATHERM incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028063</td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet, class II, type A2</td><td>NuAire Inc.</td><td>NU-543-400</td><td></td></tr><tr><td>Revco freezer</td><td>Revco Technologies</td><td>ULT1386-5-D35</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L8-M Ultracentifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>L8M-70</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Swing-bucket rotor</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td></td></tr><tr><td>Fixed angle rotor</td><td>Eppendorf</td><td>F-45-30-11</td><td></td></tr><tr><td>Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4470661</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automated cell counter</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triax software&amp;nbsp;</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Counting slides, dual chamber for cell counter</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm)</td><td>Seton Scientific</td><td>7030</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 5 mL</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle</td><td>BD</td><td>10020439</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Surface plate, 14 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Surface plate, 9 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 75 cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; flasks</td><td>Thermo Scientific</td><td>130193</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL conical centrifuge tubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Ambion by Life Technologies</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1378-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium-high glucose (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F0926-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O)</td><td>Acros Organics</td><td>AC413415000</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 (NP-40)</td><td>Fluka (Sigma-Aldrich)</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H3993-1MU</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C7698-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>194002</td><td></td></tr><tr><td>Dithiotreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S316-212</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Life Technologies</td><td>22600050</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P8833-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3KG</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Hydroxide (KOH)</td><td>Sigma</td><td>221473-500G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RPL11 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab79352</td><td></td></tr><tr><td>Ribosomal protein S6 (C-8) antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-74459</td><td></td></tr><tr><td>1xM199</td><td>Sigma</td><td>M0393-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Lithium cloride</td><td>Sigma</td><td>L-9650</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Buffer II</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM8546G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Trichloracetic acid (TCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A322-100</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L5750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A1852-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine 5&#039;-triphosphate disodium salt hydrate (CTP)</td><td>Sigma</td><td>C1506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5&#039;-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP)</td><td>Sigma</td><td>U6625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 5&#039;-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)</td><td>Sigma</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Pyrophoshatase</td><td>Sigma</td><td>I1643-500UN</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis

적절 한 단백질 식 및 오른쪽 금액에 적절 한 시기에 정상적인 세포 기능 및 빠르게 변화 하는 환경에서 생존의 기초 이다. 오랜 동안에, 유전자 표현 연구 transcriptional 수준에 대 한 연구에 의해 지배 되었다. 그러나, mRNAs의 정상 수준을 잘 단백질 생산, 연관 되지 않습니다 그리고 translatability mRNAs의 조건에 따라 크게 다릅니다. Leishmania, 기생충 같은 몇몇 유기 체에서 단백질 식이 주로 변환 수준에서 통제 된다. 최근 연구는 단백질 번역 dysregulation는 암, 대사, 신경 및 기타 인간의 질병 관련 된 시연 했다. Polysome 프로 파일링 단백질 번역 규칙을 공부 하는 강력한 방법입니다. 그것은 개별 mRNAs의 변환 상태를 측정 하거나 게놈 넓은 규모에 번역을 검토 수 있습니다. 이 기법의 기초 polysomes, 리보솜, 그들의 소 단위 및 자당 그라디언트를 통해 lysate는 세포질의 원심 분리 동안 무료 mRNAs의 분리 이다. 여기, 우리가 현재 보편적인 polysome 프로 파일링 사용 되는 프로토콜에 세 가지 모델-기생충 주요 Leishmania, 경작된 한 인간 세포 및 동물의 조직. Leishmania 셀 서 스 펜 션에서 자유롭게 성장 하 고 마우스 고환 동물 조직 샘플을 나타내는 부착 단층에서 경작된 한 인간 세포 성장. 따라서, 기술은 이러한 소스의 모든 적응 이다. Polysomal 분수의 분석을 위한 프로토콜 개별 mRNA 수준의 실시간 정량 Pcr에 의해 서쪽 오 점 및 전기 이동 법에 의해 리보솜 RNAs의 분석에 의해 단백질의 탐지를 포함 한다. 메서드는 분수의 질량 분광학에 의해 mRNAs 연관 깊은 RNA-seq에 의해 transcriptome 수준에 리보솜의 검사 및 리보솜 관련 단백질의 분석에 의해 더 확장할 수 있다. 메서드는 다른 생물 학적 모델을 쉽게 조정할 수 있습니다.

이 연구에서는 3 개의 서로 다른 소스에 polysomal 프로 파일링 기술의 응용 프로그램 설명: 기생 주요 Leishmania, 경작된 한 인간 세포 및 마우스 고환. Leishmania 세포 현 탁 액에 있는 액체 매체에서 자유롭게 성장, 경작된 한 인간 세포 플레이트에 부착 단층에서 성장 하 고 마우스 고환 조직 샘플을 나타냅니다. 메서드를 사용 하면 다른 종류의 서 스 펜 션, 다양 ?...

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Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome 프로 파일링 기술의 전반적인 목표 단백질 합성 하는 동안 개별 mRNAs 또는 transcriptome mRNAs의 변환 활동의 분석입니다. 방법은 단백질 합성 규제, 번역 활성화 및 건강과 여러 인간의 질병에 억압의 연구에 대 한 중요 합니다.

Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

polysome-profiling-in-leishmania-human-cells-and-mouse-testis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

17.9K 조회수.  Texas Tech University Health Sciences Center. Polysome 프로 파일링 기술의 전반적인 목표 단백질 합성 하는 동안 개별 mRNAs 또는 transcriptome mRNAs의 변환 활동의 분석입니다. 방법은 단백질 합성 규제, 번역 활성화 및 건강과 여러 인간의 질병에 억압의 연구에 대 한 중요 합니다.

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Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

연구

생화학

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

세포에 붙어 Antileishmanial 검사에 대한 기생충 구조 및 변화 분석<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 인간 급성 백혈병 Monocytic 셀 라인에서&gt; Amastigotes

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

면역학 및 감염병학

Development of Leishmania Species Strains with Constitutive Expression of eGFP

Protozoan parasites of the genus Leishmania cause leishmaniasis, a disease with variable clinical manifestations that affects millions of people worldwide. Infection with L. donovani can result in fatal visceral disease. In Panama, Colombia, and Costa Rica, L. panamensis is responsible for most of the reported cases of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Studying a large number of drug candidates with the methodologies available to date is quite difficult, given that they are very laborious for evaluating the activity of compounds against intracellular forms of the parasite or for performing in vivo assays. In this work, we describe the generation of L. panamensis and L. donovani strains with constitutive expression of the gene that encodes for an enhanced green fluorescent protein (eGFP) integrated into the locus that encodes for 18S rRNA (ssu). The gene encoding eGFP was obtained from a commercial vector and amplified by polymerase chain reaction (PCR) to enrich it and add restriction sites for the BglII and KpnI enzymes. The eGFP amplicon was isolated by agarose gel purification, digested with the enzymes BglII and KpnI, and ligated into the Leishmania expression vector pLEXSY-sat2.1 previously digested with the same set of enzymes. The expression vector with the cloned gene was propagated in E. coli, purified, and the presence of the insert was verified by colony PCR. The purified plasmid was linearized and used to transfect L. donovani and L. panamensis parasites. The integration of the gene was verified by PCR. The expression of the eGFP gene was evaluated by flow cytometry. Fluorescent parasites were cloned by limiting dilution, and clones with the highest fluorescence intensity were selected using flow cytometry.

Development of Leishmania Species Strains with Constitutive Expression of eGFP

Here, we describe the methodology used for generating L. panamensis and L. donovani strains expressing the gene for eGFP as a stable integrated transgene using the pLEXSY system. Transfected parasites were cloned by limiting dilution, and clones with the highest fluorescence intensity in both species were selected for further use in drug screening assays.

eGFP의 구성적 발현을 통한 리슈만편모충 종 균주의 개발

Protozoan parasites of the genus Leishmania cause leishmaniasis, a disease with variable clinical manifestations that affects millions of people ...

유전학

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

발생학

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

진핵세포 Polyribosome 프로필 분석

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

생물학

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

다각형 프로파일링을 사용하여 개발 마우스 뇌의 번역 분석

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

신경과학

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Polysom​​e 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

요약

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이 비디오의 챕터

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

세포에 붙어 Antileishmanial 검사에 대한 기생충 구조 및 변화 분석

eGFP의 구성적 발현을 통한 리슈만편모충 종 균주의 개발

그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

진핵세포 Polyribosome 프로필 분석

Polysome 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

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