Name: assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling
Uploaded: 2014-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
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We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

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The authors have nothing to disclose.

Polysom​​al 프로파일은 상이한 처리 조건 하에서 특정 전 사체의 번역의 상태를 정량화 할 수있는 강력한 기술이다. 그것은 원칙적으로 매우 간단한 기술이다 ​​그러나 그것은 좋은 polysom​​e 프로필을 생성에 중요한 일부 실행의 여러 단계가 필요합니다. 1)의 RNase가없는 화학 물질과 plasticware에를 사용, 2) (좋은 자당 그라디언트를 준비하는 우리의 경험에 10-50% 자당 그라디언트를 효율적으로 결합 리보솜 40 / 60S 서브 유닛과의 mRNA)을 해결하기위한 가장 좋은 일, 3 : 다음과 같은 주요 단계는 ) 번역의 최고 속도를 캡처하기 위해 지수 적으로 성장 세포와 더 이상 80 % 합류를 사용. 이러한 유전자 과발현 또는 최저 한 세포 치료제를 수행 할 때 플레이트에 세포의 양이 세포가 엔드 포인트에서 컨 플루 언트 될 정도의 함수일 수 있도록 이러한 후자 단계는, 고려되어야한다. 결과에서 presen와여기 테드, polysome 프로필 분석을 IRES-숨겨의 mRNA XIAP와 Bcl-xL 발현 (12)의 번역 조절에 PDCD4의 역할을 평가하기위한 중요한 도구였다. 우리가 PDCD4 노크 다운 (그림 1B)에 따라 일반 polysome 프로파일의 변화를 관찰하지 않은 사실은 우리가 PDCD4 실험의 조건에서 글로벌 휴대폰 번역을 손상하지 않았다고 결론을 내릴 수있었습니다. 우리는 다음 PDCD4 또는 제어 siRNA를 처리 한 세포에서 XIAP와 Bcl-xL 발현의 mRNA의 분포를 결정하기 위해 RT-qPCR에 분석을 사용 하였다. 이 mRNA의 분포의 정량적보다는 반 정량 분석​​과 치료 사이의 번역 효율에 미묘한 변화의 검출을 허용하기 때문에 qPCR에은, 표준 RT-PCR 또는 노던 블롯 반대로, polysom​​e 프로파일을 분석하기위한 선택 방법이다. 이 기술을 사용하여, 우리는 XIAP와 Bcl-xL 발현의 mRNA의 분포가 (gr에 걸쳐 총 타깃 mRNA를 백분율로 표시 것을 보여줄 수 있었다adient)는 크게, 따라서 이들의 mRNA의 번역의 증가를 나타내는, PDCD4 노크 다운 (그림 1D, E) 후 그와 관련된 리보솜의 큰 숫자)와 함께 무거운 polyribosomes (의 mRNA로 이동했다. 이는 더욱 XIAP 및 Bcl-xL 발현 단백질 수준에서 아니지만 그들의 정상 RNA 수준 (도 1F, G)의 상승에 의해 확인 하였다. 중요한 것은, XIAP의 비 IRES 변이체의 polysome 분포는 처리 및 미처리 세포 (도 1C) 사이에서 불변이었다. 대안으로, 번역 효율은 14 (일반적으로 2-4을 분획) 대 monosomes polysomes mRNA의 함량의 비 (일반적으로 5-10 분획)로 제시 될 수있다. 254 nm에서 흡광도 판독 값에서 피크가 관찰이 독자적으로 리보솜 RNA (세제에 기인 할 수 없기 걸쳐 제어 프로토콜의 사용은 결과를 프로파일 링하는 polysom​​e 검증 중요예컨대 트리톤 X-100 등의 강하게) 스펙트럼의이 영역에서 흡수하고 구배 상단 40 / 60S 피크를 가릴 수있다. 해물없이 및 / 또는 해물 버퍼 빈 그라데이션을 254 nm에서의 흡광도에 버퍼의 상대적 기여도를 결정하기 위해 실행해야합니다. Artefactual 고차 구조는 사실 없음에 (예 : &quot;의사 polysomes&quot;20)가 polysomes의 잘못된 해석으로 이어질 수 있습니다. 마그네슘 금속 이온 봉쇄 2가 양이온의 킬레이트 EDTA와 (80S 리보솜을 안정화하는 절차 전반에 걸쳐 사용은) 큰 (60S를 그 구성 요소 작은 (40S)에 리보솜의 분리를 일으킬 것 해물과 그라데이션 버퍼 (15 분 20 mM의)에 추가 ) 서브 유닛. 260 nm에서 기록 된 흡광도 피크 polysom​​es 실제로 경우 따라서, EDTA 처리를 단일 최대의 mRNA 리보좀 단위를 자유롭게 대응 구배의 상단 부근에 관측 될되도록 프로파일을 축소한다 (데이터는 미도시). 일치하는프로파일의 EDTA에 의한 붕괴, qPCR에 의해 분석 특정 대상의 모든 이제 그라데이션의 맨 위에 있어야합니다. mRNA의 리보솜과 연관된 수는 항상 특정의 mRNA가 번역되는 것을 얼마나 효율적의 지표 아니다. 실제로, polysomes에 활성 번역은 독자가 알아야 할 21, 22 정체가되는 특정 상황이 있습니다. 성적표 적극적 EDTA 달리 &#39;유거수&#39;적극적 mRNA에 걸쳐 전좌되는 리보솜 발생 퓨로 마이신으로 샘플을 처리)하여 수행 할 수 번역 기계 결합, 또는 b) 샘플을 처리할지 여부를 결정 다시 다운 스트림 전좌 리보솜의 &#39;실행 - 오프&#39;를 일으키는 원인이되는 개시 코돈에서 첫 번째 리보솜의 전위를 억제 homoharringtonine와. qPCR의 분석을위한 제어 사체의 사용은 중요하다. SELEC이러한 XIAP IRES의 비 IRES 변형 일부 가사 유전자 (GAPDH, 액틴, 튜 불린, 뉴 클레), 리보솜의 mRNA (18S, RPL13A) 나이 경우 다른 처리 조건에 의해 영향을받지 않는 성적 증명서의 기는 중요하다 검증 번역에 대한 치료의 효과는 특정 또는 일반화 된 경우. 이러한 제어 사체 여기 행해졌으로 분석의 mRNA의 분포를 정규화하는데 사용될 수있다 (XIAP와 Bcl-xL 발현의 mRNA는 GAPDH의 mRNA로 정규화하고 각 분획의 mRNA 함량의 합으로 표시되는 총 mRNA의 함량의 백분율로 표현 하였다 ) 또는 대안 적으로, 제어 대상의 mRNA가 절대 값으로 표현하고 개별적으로 도시 될 수있다. 입력 용 해물 (총 용적의 통상 10 %)의 qPCR의 분석은 특정의 mRNA 분포를 통제 할 다른 공정이다. 이상적으로는, 입력 용 해물에서 특정 mRNA의 전사의 함유량을 분석 한 10 개의 분획의 mRNA 함량의 합과 비교되어야한다. 최종적으로, 옵션 단계를 페놀 제어 : 클로로포름 추출 단계 (CAT는, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼 라제와 같은) 후속 qPCR에 의해 정량화 될 심지어 사용할 수 정상화 관내 전사 리포터 mRNA를 각각 polysome 분획 스파이크하는 데이터 (14). 어떤 기술과 마찬가지로, polysom​​e 프로파일 링은 몇 가지 제한 사항을 제시한다. 통상 10 분은 최소 좋은 polysom​​e 분포를 갖기 위해 수집 할 필요가 (변환 효율의 미묘한 변화가 20 이상이 필요할 수 있음)이 있다는 사실이 단계 4 샘플 만 최대가 될 수 있다는 점에서, 제한적인 만든다 한 번에 분석하는 것이 편안 한번에 RNA 추출 및 40 샘플 4 입력 컨트롤 qPCR의 분석을 처리 할 수​​ 있어야한다. 샘플 크기는 쉽게 qPCR을 수행하는 복제 얼마나 많은 성적을 분석 할 수 있습니다 얼마나 많은에 추가 할 수 있습니다, 이것은 비용이 많이들 수 있습니다. qPCR에 기반 polysom​​al 프로파일 링의 또 다른 제한nalysis 그것만 (성적이 미리 공지되어 분석 될 수있는)와 번역의 전체 게놈 분석에 적용 할 수없는 후보 기반의 접근법에서 수행 될 수 있다는 것이다. 그러나, 21 세기의 시작 부분에, 연구자들은 DNA를 사용하여 게놈 수준에서 자신의 polysomal의 RNA를 심문하기 시작 차세대 시퀀싱 (16, 17)와 함께 최근에는 15을 마이크로 어레이. 오히려 개별 분수의 qPCR에 분석을 수행하는 것보다 것을 제외하고는이 프로토콜에 설명 된대로이 강력한 접근 방식에서, polysom​​al 프로파일 링을 수행 할 글로벌 번역 분수 (일반적으로 분수 2-4)와 polysom​​es 분수 (일반적으로 분수) 함께 풀링 및 변형 분석 monosomes DNA 마이크로 어레이 또는 전체 게놈 RNA 서열 분석에 의해. 따라서이 방법, 그것을 평가하기 위해 가능한 모든 누구의 분포 변화 polysom​​es에서 monosomes에 (번역 감소) 또는 반대 (번역 증가) 특정 치료시의 mRNA, 표준. 특정 mRNA의 polysom​​es 분포의 확인 및 정량화는 다음 qPCR을 수행 할 수 있습니다. polysom​​al 프로파일 원리의 더 강력한 사용 리보솜 프로파일입니다. 이 기술의 더 높은 처리량 확장 polysome 분수 (23)의 수백을 동시에 모니터링 할 수가 최근에보고되었다. 돌연변이의 수집 또는 대규모의 RNAi 화면에서 병진 효율 프로빙 때 명확한 이점을 제공한다. 리보솜 프로파일은 단백질 합성에 관여 24,25 리보솜 (리보솜 발자국)에 의해 보호 RNA 단편을 매핑 차세대 시퀀싱을 활용하는 기술이다. 이 기술에서, 리보솜 전좌는 사이클로 헥시 미드 (양면) 또는 emetine (돌이킬 수없는) 리보솜 발자국의 인구를 산출하기 위해 세포 용해 및 RNA 분해 효소 소화 다음으로 억제 할 수있다. 리보솜은 충실 총 RNA는 고립되고, 오염 리보솜과 미토콘드리아 리보솜 RNA가 제거됩니다.약 26 ~ 28 뉴클레오티드 RNA 발자국이 절연되어, cDNA 라이브러리로 변환, 전사 26 염기 서열을 리버스. 표준 polysom​​e 프로파일과는 달리,이 방법뿐만 아니라 병진 규제 특정의 mRNA를 식별뿐만 아니라, 특정 성적 증명서를 따라 정확한 직업과 리보솜의 밀도 코돈 해상도에서 mRNA의 관련 정보를 얻을 수 있습니다. 이 발생하는 경우 성적 증명서 리보좀 모집에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있기 때문에 이것은, 특히 IRES-숨겨의 mRNA로 번역의 특정 모드와의 mRNA에 대한 관심이다.

단백질 합성 (번역)의 규정은 밀접하게 세포의 생존에 연결된 키 세포 과정이다. 번역은 세포의 에너지의 50 % 이상을 소비하는 감안할 때, 그것은 번역이 밀접하게 규제되어 있고 번역의 동요가 잘 용납하지 않는 것은 놀라운 일이 아니다. 반대로, 많은 비정상적인 세포 과정은 번역 기계 및 변환 출력 (즉, 프로테옴)을 수정해야 할 것을 요구하고 있습니다. 이것은 종종 다양한 스트레스 반응 및 질병 상태에있는 경우, 그리고 아마도 가장 좋은 암을들 수있다. 병진 제어의 주요 이점은 빠르게 다양한 내부 및 외부 트리거에 응답하여 단백질 출력을 재 프로그래밍하는 세포의 능력하여 미세 조정기구 인 것을 조언 세포 생존 및 사망 한 간의 균형. 번역 제어의 두 가지 측면이 특히 재미있다; 규제 MEC의 본질에 대한 이해처음에 선택적 번역을 유발하는 특정 트리거에 대한 세포 반응에 참여 hanism (들) 및 제어 특정 번역을 허용 요소, 특정의 mRNA의 식별과 단백질 제품. Polysom​​e 프로파일 링은 두 프로세스의 효과적인 학습을 할 수있는 기술이다. polysom​​e 프로파일 링 기술의 전반적인 목표는 공부하고 다른 세포 조건에서 특정의 mRNA의 번역 상태를 정량화하는 것입니다. 기술의 원리에 따라서, 수 크로스 구배에서 초 원심 분리에 의해 얻어진 polyribosomes를 &#39;동결&#39;다른 사체에 적극적 번역 리보솜과 분리 &#39;(몇 리보솜에 의해 결합) 높은 변환 전 사체 사이의 구별을 허용함으로써 mRNA의 번역을 캡처하는 것 가난 (하나 또는 두 개의 리보솜에 의해 구속) 사람들을 번역했다. 이 특정 프로토콜에서, 항생제 사이클로 헥시 미드는 결합이60S 리보솜 아 단위 및 블록 리보솜 E 사이트 2에서 탈 아세틸 화의 tRNA의 출시는, 리보솜 전좌를 억제하고 번역의 mRNA에 리보솜 실속하는 데 사용됩니다. 그러나, 블록 변환 신도 3, 사용될 수있다 emetine 다른 차단제. 웨스턴 블 롯팅 및 번역 처리의 최종 출력을 측정 35 S-메티오닌 표지 기술과는 달리, 따라서 다른 조건 하에서 번역 메커니즘의보다 상세한 연구를 허용 프로파일 적극적 번역의 mRNA와 리보솜 연계를 측정하는 장점을 갖는다 polysome. 따라서,이 기술을 쉽게 구체적 번역 4-6의 다양한 모드를 연구하기에 적합 할 수있는, 단백질 인자 번역 조절 7-9, 단백질 합성 1,10,11 또는 상류 IRES 또는 mRNA의 구조의 효과에 영향을 미치는 스트레스 조건에 관여 단백질 신디사이저에 개방 판독 프레임ESIS 12-14. 요즘, polysome 프로파일 응용 프로그램도 넓은 polysomes 관련의 mRNA를 분석 할 수있는 DNA 마이크로 어레이 (15) 또는 차세대 시퀀싱 16, 17의 사용에 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 automated gradient maker</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>Density gradient fractionator</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>Composed of: tube piercing system,&amp;nbsp; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td></tr><tr><td>WinDaq data acquisition software</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td></tr><tr><td>Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td><td>DiaMed</td><td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (nucleases-free)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342.3 g/mol</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td></tr><tr><td>Sodium chloride (nucleases-free)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58.44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203.3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris Base (nucleases-free)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td></tr><tr><td>Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Rnase inactivation solution</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td></tr></tbody></table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

단백질 합성의 규정은 스트레스에 대한 세포 반응의 핵심 제어 지점을 나타냅니다. 특히 신중한 RNA 조절 요소는 전형적 특정 스트레스 반응에 필요한 단백질 인코딩 특정 mRNA를, 선택적으로 번역 할 수 있도록 도시 하였다. 이들의 mRNA뿐만 아니라 선택적 번역에 대한 책임을 규제 메커니즘의 특성의 확인은 시간에 대한 분자 생물학의 최전선에있다. Polysom​​e 프로파일 링은이 연구의 초석 방법이다. polysom​​e 프로파일의 목적은 서로 다른 사체에 적극적 번역 변이를 고정화함으로써 mRNA의 번역을 캡처하고, 따라서 높은 번역 사체 저​​조한 번역들 사이의 구별을 허용 자당 구배 초 원심 분리에 의해 얻어진 polyribosomes를 분리하는 것. 이것들은 추가의 전통적인 생화학 및 분자 생물학 방법을 특징으로 할 수있다. 중요한 것은, 결합 P높은 처리량 게놈 접근 방식과 olysom​​e 프로파일 링은 번역 규제의 대규모 분석을 할 수 있습니다.

우리는 최근 세포 사멸 억제제 XIAP와 Bcl-xL 발현 (12) 인코딩의 mRNA을 IRES이-은닉의 선택 번역 억제제로 종양 억제 PDCD4위한 새로운 역할을 설명했다. Polysom​​e 프로파일 링은 IRES 매개 번역 PDCD4의 구체적인 참여 방법을 설명하기 위해 핵심 기술이었다. HEK293 세포는 일시적 PDCD4 (도 1a)의 내인성 수준을 고갈 형질 다음 프로파일 분석 polysome 행 하였다. 우리는 siCTRL 및 siPDCD4 처리 된 세포 (도 1B)를 비교 polysome 프로파일의 변화의 부족 것으로 판단 PDCD4의 감소 수준, 글로벌 셀룰러 번역을 저해하지 않은 것이 관찰. 마찬가지로, XIAP (19)의 비 IRES 변형의 polysome 분포는 치료 및 치료 세포 (그림 1C) 사이의 변화는 없었다. 대조적으로, 두 IRES-은닉의 mRNA polysom​​e 분포, XIAP 및 Bcl-xL 발현이 유의하게 변경 하였다. P가없는DCD4 이들 두개의 mRNA의 분포가 무거운 ribopolysomes (도 1D, E)로 이동된다. 이것이 XIAP와 Bcl-xL 발현 mRNA에 (도 1F)이 결과의 정상 상태 수준의 변화를 수반하지 않기 때문에 더 웨스턴 블 롯팅 (도에 의해 확인 하였다 감소 PDCD4 수준으로 세포에서 XIAP와 Bcl-xL 발현의 번역을 향상을 보여줍니다 1G). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> 그림 1 :. Polysome 프로파일 링 XIAP와 Bcl-xL 발현 번역의 선택적 억제제로 PDCD4를 식별 (A) HEK293 세포 PDCD4의 siRNA 또는 컨트롤 (CTRL)로 처리하고, 안티 PDCD4에 용해 및 웨스턴 블롯 분석을의 siRNA를, 비 대상 안티 뉴 클레 항체는. PDCD4 노크 다운의 정도를 확인 (B) PDCD4가 (A)에서와 같이 무너 뜨렸다하고합니다세포 용 해물은 프로파일 polysom​​e 행 하였다. 대표 polysom​​e 프로필은 상단 패널에 표시됩니다; XIAP 비 IRES (C)의 분포는, GAPDH의 상대적인 Bcl-xL 발현 (D), 및 XIAP IRES (E)의 mRNA 각 분획 총 mRNA를 백분율 (%의 mRNA)로 표시된다. (F) 정상 -state mRNA 수준은 PDCD4의 siRNA 또는 제어 (CTRL) siRNA를 처리 한 세포의 RT-qPCR에 의해 측정 하였다. (G)로부터의 용 해물 (A)과 같은 항 - XIAP, 안티 Bcl-xL 발현과 함께 웨스턴 블롯 분석을 실시 안티 뉴 클레 항체. (NB. 데이터는 원래 12 년에 출판 된 그림 1에 제시) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Polysom​​e 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

assessment-selective-mrna-translation-mammalian-cells-polysome

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

28.1K 조회수.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 

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Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

연구

생화학

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

발생학

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

진핵세포 Polyribosome 프로필 분석

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

생물학

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

다각형 프로파일링을 사용하여 개발 마우스 뇌의 번역 분석

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Polysome 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가

요약

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