Name: polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis
Uploaded: 2018-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis at JoVE.com

Yazarlar Ching Lee ses kaydı ile yardım için teşekkür. Araştırma Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Start-up fonlarından desteklenen bir durumdu ve Center of Excellence translasyonel Neuroscience ve tedavi (CTNT) tarafından PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K. için vermek; NIH grant tarafından kısmen K.Z. James C. Huffman ve Kristen R. Baca R01AI099380 CISER (kök Tümleştirme eğitim ve Araştırma Merkezi) bilim adamları vardı ve program tarafından desteklenen edildi.

Tüm hayvan tedaviler ve işleme dokuların çalışmada elde edilen Kurumsal hayvan bakım ve Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Ulusal Enstitüleri uygun olarak kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri göre yapıldı Sağlık hayvan refahı kuralları, protokol numarası 96005. Lütfen omurgalı hayvanlar kurban ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi doku yönergelere göre hazırlayın. Böyle bir komite eksik, lütfen Ulusal Sağlık Enstitüleri hayvan refahı yönergelere bakın. Yetişkin (> 60 gün eski) C57BL/6 fareler kullanılmıştır. Tüm hayvanlar ve doku kurumsal hayvan bakım ve Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Ulusal Sağlık Enstitüleri hayvan refahı yönergelere uygun olarak kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri göre elde edilmiştir. Ötenazi için tek bir fare küçük bir odaya yerleştirildi ve hava yavaş yavaş ile yaklaşık % 30 yerinden karbondioksit anestezi ve hayvan kırılmasını en aza indirmek için. Nefes kesilmesi ölüm hayvan dokuları hasat önce onaylamak için servikal çıkığı kullandık.
Dikkat: Tüm iş ile canlı LEISHMANIA ve kültürlü insan hücreleri Biyogüvenlik BSL-2 sertifikalı dolap yapıldı.
1. hazırlanması sitoplazmik Lysates LEISHMANIA büyük , kültürlü insan hücreleri ve fare dokular
Not: Farklı kaynak malzemelerden lysate müstahzarları çeşitli farklar vardır. Sükroz degrade hazırlık ve polysomal ayırma da dahil olmak üzere diğer adımlar aynıdır ve örnek kaynağında bağlı değildir.
<ol><li>
LEISHMANIA büyük sitoplazmik lysate hazırlık
	<ol>
<li>LEISHMANIA büyük (FV1 zorlanma) hücrelerin % 10 Fetal sığır Serum (FBS) ve penisilin/streptomisin karışımı içeren 1 x M199 orta29 30 ml aşılamak (100 adet ve 100 μg/mL buna bağlı olarak), 1 x 105 hücre/mL yoğunluğu . Not: LEISHMANIA büyük hücreleri içeren tüm adımları bir biyogüvenlik kabini yürütülmelidir.</li>
		<li>Hücreleri da kuluçka makinesine koyun ve onları büyümek 27 ° C'de logaritmik faz kadar (5 x 106 hücre/mL günlük karşılık gelir). Genellikle büyümeye yaklaşık iki gün sürer.</li>
		<li>Sikloheksimit LEISHMANIA büyük kültür 100 μg/mL çevrilmiş mRNA'ların üzerinde ribozom tutuklamak için son bir konsantrasyon için ekleyin. Kuluçka makinesi 27 ° C'de 10 dakika geri hücreleri yerleştirmek</li>
		<li>Sikloheksimit tedavi tamamlandıktan sonra hücre 50 mL konik tüp aktarmak ve onları 1800 x g ve 8 dk. atma süpernatant için 4 ° C, spin.</li>
		<li>Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) 30 mL hücrelerle yıkayın. 8 dk santrifüj 1800 x g ve 4 ° C.</li>
		<li>Süpernatant atmak. 1 mL DPBS hücrelerde resuspend.</li>
		<li>Bir aliquot hücre alıp % 3,5 formaldehit çözüm ile karıştırın.</li>
		<li>Hemasitometre tarafından hücreleri saymak ve onların konsantrasyonu belirlemek. Hücreler için istediğiniz sayıyı microfuge tüp içine aktarın. Lysate 0.5x108-2 x 108 hücre/mL hazırlanmış bir Sükroz degrade yükleme için yeterli olur.</li>
		<li>Hücreleri 1800 x g de spin ve 4 ° C 8 dakika süreyle süpernatant atın.</li>
		<li>Hücre Pelet lizis arabellek proteaz inhibitörleri ve RNase inhibitörü (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, %1 NP-40, 1 x proteaz inhibitörü kokteyl (EDTA içermeyen), 200 adet/mL RNase inhibitörü) içeren 1 ml buzda resuspend.</li>
		<li>Lysate 23'lik iğne ile üç kez geçmek. Lysate iğne geçitten sonra şeffaf hale gelmelidir.</li>
		<li>Santrifüj 11,200 x g ve 4 ° C lysate açıklamak için 10 dakika için. Açıklanan transfer lysate için yeni bir tüp ve sukroz degrade ultrasantrifüj kadar buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Toplamak, lysate (daha sonra analiz etmek için) giriş olarak 400-500 μL hemen gelecekteki protein analizi için sıvı azot Dondur veya RNA analizi için buz gibi önce RNA arıtma reaktif ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kültürlü insan HeLa hücreleri sitoplazmik lysate hazırlık
	<ol>
<li>HeLa hücreleri bölme ve onları 20 mL % 10 FBS ve penisilin/streptomisin karışımı içeren DMEM orta tohum (100 adet ve 100 μg/mL buna bağlı olarak) hücre ile 2 x 105 hücre/mL bir 15 cm tabak içinde saymak.</li>
		<li>37 ° c, % 5 CO2 20-24 h. gerçekleştir plazmid DNA transfection göre üreticinin iletişim kuralları için HeLa hücreleri büyümek.</li>
		<li>Transfection 37 ° c, % 5 CO2sonra hücreler 24 h için yaymak.</li>
		<li>Sikloheksimit 100 μg/mL çevrilmiş mRNA'ların üzerinde ribozom tutuklayın ve hücreler için 10 dk. 37 ° c, % 5 CO2kuluçkaya son konsantrasyonu için yetiştirilen HeLa hücreleri ekleyin. Orta Aspire edin. Buz soğuk DPBS iki kez hücrelerle yıkayın.</li>
		<li>Lizis arabelleği (20 mM HEPES-KOH pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, %0,5 NP-40, 1 x proteaz inhibitörü kokteyl (EDTA-free), 200 adet/mL RNase inhibitörü veya 1 mg/mL heparin) 500 μL plakasına eklemek ve hücreleri üzerinde buz kazımak.</li>
		<li>Lysed hücre microfuge tüp aktarın. NP-40 konsantrasyonu % 0,5 ve MgCl2 ' ye göre örnek artan hacmi 5 mM için ayarlayın.</li>
		<li>Lysate 23'lik iğne ile 3 - 6 kez geçmek.</li>
		<li>11,200 x g de ve 4 ° C lysate netleştirmek 8 min için spin. Santrifüjü sonra yeni bir tüp süpernatant aktarın. Bir Spektrofotometre hücre lizis etkinliğini değerlendirmek ve yükleme için örnek miktarına geçişin belirlemek için kullanın. 10 μL örnek %0,1 0.5 mL için eklemek Sodyum Lauryl Sülfat (SDS). % 0.1 SDS karşı boş. Ölçmek Absorbans 260 nm. Beklenen Absorbans değerdir etrafında 15-20 adet/mL.</li>
		<li>Tüm örnekleri ile lizis arabelleğe Sükroz degrade Santrifüjü önce aynı Absorbans değeri oranında seyreltin. Buz üzerinde örnekleri Sükroz degrade Santrifüjü kadar tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fare testislerden sitoplazmik lysate hazırlık
	<ol>
<li>Fare testis incelemek. Küçük bir insizyon attım tunica albuginea yapmak ve testis seminifer tübüllerin toplamak ve 5 mL 0,1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) ile birlikte DPBS de içeren bir 15 mL konik tüp aktarmak.</li>
		<li>Doku birkaç kez ters çevirme tarafından kuvvetle karıştırın. Doku birim ağırlık buz üzerinde 5 min için yerleşmek izin verir.</li>
		<li>Kaldırmak ve bağ hücre ve doku parçaları içeren bulutlu arabellek atın. Yordam 2-3 kez daha tekrarlayın. Kalan beyaz Pelet seminifer tübüllerin ve germ hücreleri için zenginleştirilmiştir.</li>
		<li>Seminifer tübül Pelet 2 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve 500 x g 1 dk. spin süpernatant atın.</li>
		<li>Lizis arabelleği (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, %0,5 NP-40, 1 x proteaz inhibitörü kokteyl (EDTA içermeyen), 1 mg/mL heparin veya RNase inhibitörü 200 adet/mL) 500 µL tübüllerin için ekleyin. Doku triturate için bir pipet kullanın.</li>
		<li>Süspansiyon küçük ve aktarım (0.5-1.0 mL) Dounce homogenizer. Yedi ya da sekiz darbeleri cam havaneli ile doku bozabilir.</li>
		<li>Lysate 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.</li>
		<li>Örneği 12.000 x g ve lysate temizlemek 8 dk 4 ° C'santrifüj kapasitesi. Süpernatant yeni tüp ve mağaza buza Sükroz degrade yükleme kadar aktarın.</li>
		<li>Lysate giriş örnek olarak, 50 μL toplamak, bu hemen gelecek protein analizi için-80 ° C'de dondurmak; veya RNA analizi için buz gibi önce RNA arıtma reaktif ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Sükroz degrade hazırlık ve ultrasantrifüj
<ol><li>% 10 Sükroz veya % 50 Sükroz içeren iki Sükroz degrade Çözümleri (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 x proteaz inhibitörü kokteyl), hazır olun. (Tris-HCl, pH 7.4, HEPES yerine kullanılabilir). 200 adet/mL RNase inhibitörü veya 1 mg/mL heparin deneysel tasarım göre ekleyin. Bir ultracentrifuge tüp SW 41 rotor için işaretleyici bloğu içine yerleştirin ve blok üst düzey çizgi çizin. Tüp istikrarlı bir raf aktarın.</li>
	<li>Bir 10 mL şırınga bağlı katman aygıtı ile almak ve % 10 Sükroz çözüm (yukarıdaki gibi hazırlanmış) ile şırıngaya doldur. Yavaşça işareti tüp ulaşana kadar ultracentrifuge tüp alt kısmında bõrakõn.</li>
	<li>% 50 Sükroz çözüm ile başka bir şırıngaya doldur ve dikkatle tüpün dibine % 10 Sükroz katmanı yoluyla onun katmanlama aygıtını takın. Yavaşça işareti tüp ulaşana kadar Alttan başlayarak Sükroz çözüm serbest bırakın. Sağlanan kapaklı tüp kapatın.</li>
	<li>Sükroz degrade hazırlamak için degrade makinesi aygıtı ONaçın. Yukarı veya aşağı düğmelerini kullanarak plaka seviye ve DONEtuşuna basın. Tesviye geçişin doğrusallık için önemlidir.</li>
	<li>Plaka tesviye sonra GRAD degrade menüsünü açmak için tuşuna basın. Degrade menüsünden liste gidin ve SW 41 Ti rotor seçin. Sonra istenen Sükroz degrade yukarı ve aşağı düğmelerini kullanarak menü listesinden seçin. Basın kullanın.</li>
	<li>Degrade boru tutucu degrade makinesi tabağa yerleştirin. Tüp tutucu aktarın. Aynı anda en fazla 6 degradeler hazırlanabilir. Basın çalıştırmak. Degrade makinesi programlanmış hızlı ve doğrusal gradyan oluşturan açıları tüpler döner. Degrade hazırlamak için sadece birkaç dakika sürer.</li>
	<li>İşlem tamamlandığında, tüpler bir rafa yerleştirin. Kapaklar çıkar. Aynı birim numune hacmi olarak ultracentrifuge tüpler tepesinden kaldırın.</li>
	<li>Dikkatle lysate 15-20 A260 adet polizomlar üst içeren 400-500 μL yükleyin. Tüpler rotor kovaları getirin ve onları dengesi.</li>
	<li>Santrifüj 260.000 x g ve 4 ° C 2 h SW 41 rotor kullanarak için.</li>
</ol>3. polysome ayırma ve örnek koleksiyonu
Not: lysate hazırlıklar kaynağına bağlı olarak bazı farklar varken, degrade hazırlık ve polysome ayırma iletişim kuralları her türlü lysates aynıdır.
<ol><li>Ultrasantrifüj tamamlanmasından sonra rotor kova tüpler ile Buza koyun. Kesir toplayıcı ve degrade fractionator ONaçmak. İnceden inceye gözden geçirmek fractionator menüsünde'i tıklatın. Bir raf 24 koleksiyonu tüpler kesir toplayıcı koymak.</li>
	<li>Yan tarafında fractionator deiyonize su ile durulama su deposu doldurmak. 10 için DURULAMA tuşuna basın s fractionator üzerinde pompa durulayın. Pistonu kalibrasyon için su ile dolu şırınga ile durulama adaptörü takın.</li>
	<li>Fractionator yazılım bilgisayar açın. Basın kalibre. Varsayılan ayarları kullanın ve OKtuşuna basın. Şırıngadan suyu enjekte etmeye hazır ol.</li>
	<li>Kalibrasyon yapmak için Tamam tuşuna basın. Hemen sonraki 5 için su enjekte başlatmak s. Bu süre içinde su UV dedektörü akışı cep akacaktır ve enstrüman kalibre. İşareti Sıfır Kalibrasyon tamamlandı görünür. Araç ayırma için hazırdır.</li>
	<li>Durulama adaptör şırınga ile kaldırın. Bir ipucu fractionator piston için ekleyin.</li>
	<li>Pirinç hava Vana ve basın hava anahtarı 10 için aç s kuru boru ve akış hücre. Hava vanayı kapat.</li>
	<li>Yavaşça rotor kova degrade tüpü çıkarması ve rafa yerleştirin. Boru tutucu kap tüp uygulamak ve dikkatle tüp tüp yuvasına taşımak ve konumda kilit.</li>
	<li>Yer tutucu fractionator piston altında. Çoğu zaman, polysomal bantları gözle görülebilir. Kesir sayıları ve birim için istenen ayarları tanıtmak (500 μL/kısmını 24 kesirler genellikle yeterlidir). Dosyayı uygun şekilde adlandırın. Tamam, sonra Gitmek için grafik düğmesini tuşuna basın. Bir sonraki pencerede Başlat taramatuşuna basın. Ayarları görünür, Tamam'ıtıklatın. Toplayıcı ilk kesir için cilt payı hareket edecek ve piston tüpün içine taşınır. Piston üst geçişin ulaştığında seçili hızını yavaşlatır ve kesirler toplanacaktır. Rapor tamamlandığında, piston degrade tüp dışına taşır.</li>
	<li>Pirinç hava Vana ve basın hava anahtar son kesir almak için fractionator üzerinde açın.</li>
	<li>Tüpler raf buz üzerinde hareket ettirin.</li>
	<li>2 cilt RNA arıtma reaktif her kesir ve flash için sıvı azot RNA arıtma kadar dondurmak ekleyin. Alternatif olarak, protein çözümlenmesi gerekiyorsa, onları Western Blot (bkz. Bölüm 8) konsantre için % 10 son konsantrasyon trichloroacetic asit ekleyin.</li>
</ol>4. mRNA'ların seviyeleri sırasında RT-qPCR veri analizi normalleştirme için sentetik RNA In Vitro hazırlanması
Not: E. coli OmpA mRNA normalleştirme için bu protokol için kullanılır. MRNA'ların okudu organizmanın ile kapsamlı kimlik yok diğer RNA (memeli veya LEISHMANIA) kullanılabilir.
<ol><li>Standart bir PCR reaksiyon gelen OmpA gene30içeren bir plazmid tarafından SP6 organizatörü içeren OmpA DNA parçası hazırlamak.</li>
	<li>100 µL karışımı hazırlayın: 80 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 16 mM MgCl2, 2 mM Spermidine, 10 mM DTT, 3 mM ATP, 3 mM CTP, 3 mM UTP, 3 mM GTP, 0.5 U/μL RNase inhibitörü, 1 μg OmpA PCR DNA, 3 μL SP6 RNA polimeraz , 0.005 U/μL pyrophosphatase.</li>
	<li>2 h için 40 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>RNA, RNA arıtma paketi tarafından arındırmak.</li>
	<li>Konsantrasyon Spektrofotometre tarafından ölçmek ve özel Jel Elektroforez tarafından inceleyin.</li>
</ol>5. RNA izolasyonu degrade kesirler ve cDNA hazırlık
Not: bir RNase inhibitörü ribonükleaz inhibitör kullandıysanız doğrudan bu iletişim kuralı için RNA arıtma ile devam edin. Ancak, ribonükleaz inhibitör kullanıldığında, heparin transkriptaz cDNA hazırlanmasında kullanılan yapılmasını engeller. Bu nedenle, heparin lizis tampon ve degrade kullanıldıysa RNA'ın ek arıtma gerekli olacaktır. Bkz. Bölüm 6 heparin kullandıysanız RNA cDNA sentezi için hazırlamak için.
<ol><li>RNA arıtma reaktif içeren örnekleri çözülme, 20 eklemek ng RT-qPCR sonuçları normalleştirme için iç kontrol olarak sentetik RNA'ın. Bir değişiklik dışında üreticinin protokolüne göre RNA hazırlık ile devam edin. RNA sınıf glikojen (20 µg) önceki isopropanol bulutlu 1 µL ekleyin. 20-25 µL RNase free su RNA granül geçiyoruz. Not: Glikojen bir taşıyıcı olarak hizmet vermektedir ve kayıpları önlemek ve arıtma sırasında RNA Pelet görselleştirmek için yardımcı olur. OmpA mRNA daha fazla normalleştirme RT-qPCR reaksiyonlarda kullanılır.</li>
	<li>RNA konsantrasyonu yeterli verim sağlamak için Spektrofotometre kullanarak ölçmek. 40'lı, 60'ların ve monosomes prepolysomes olarak içeren RNA kesirler eşit miktarda birleştirin. 2-4 ribozomlara içeren kesirleri ışık polizomlar birleştirmek ve 5-8 ribozomlar olan kesirleri ağır polizomlar birleştirir.</li>
	<li>5-10 µL RNA kombine kesirler üzerinden bir seti kullanarak ve üreticinin önerilerini takip cDNAs hazırlamak için kullanın.</li>
	<li>Nükleaz boş su 80 µL cDNA 20 µL için ekleyin. CDNA örnekleri-20 ° C'de dondurmak</li>
</ol>6. RNA arıtma Heparin kontaminasyonu üzerinden
Not: Heparin nükleik asit enzimler transkriptaz gibi işleme engeller. Heparin lizis arabellek ve/veya Degrade kullanıldığında bu nedenle, bu ek arıtma iletişim kuralını kullanın.
<ol><li>LiCl 1 M son konsantrasyonu arıtılmış RNA örnekleri için ekleyin.</li>
	<li>Örnekleri mix ve 1 h için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>16.000 x g ve 4 ° C'de 15 dakika örnekleri spin.</li>
	<li>Süpernatant mümkün olduğu bir pipet kullanarak tamamlanmış olarak kaldırın.</li>
	<li>Yaklaşık 5 dakika için granül kuruması.</li>
	<li>Granül RNase free su ilk hacmi yeniden askıya alma.</li>
	<li>260 spektrofotometrik ölçüm gerçekleştirmek nm RNA konsantrasyonu belirlemek için. Genellikle, örnek kaybı en az düzeydedir.</li>
</ol>7. RT-qPCR ve mRNA dağıtım veri analizi
<ol><li>Birleştirmek su, 20 μL SYBR yeşil, gen belirli astar (2,5 μM kümesi) 4,8 μL 10.2 μL, cDNA 5 μL, iyice karıştırın ve triplicates bir kuyu başına 10 μL 384-şey plaka yüklemek.</li>
	<li>Levha yapıştırıcı film ile sıkı bir şekilde kapak ve 1800 x g 5 min için plaka santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Bir gerçek zamanlı PCR enstrüman kullanarak qPCR reaksiyon Tablo 1' de gösterilen şartlar altında ayarlayın.</li>
	<li>Döngüsü eşik (CT) kullanarak değerleri ve karşılaştırmalı CT (ΔΔCT) yöntemi31 yüzdesi (%) olarak açıklanan32 bir değişiklik ile prepolysomes, hafif ve ağır polizomlar mRNA dağılımının hesaplama. Sentetik RNA (burada OmpA) veri normalleştirme RT-qPCR veri analizi için kullanın. Sentetik RNA göreli mRNA'ların düzeylerini hesaplama ve karşılaştırmak onları bir degrade farklı kesirler görüntüleyen bir normalleştirme denetimi sağlar.</li>
</ol>8. analiz Western Blot tarafından Polysomal kesirler proteinlerin
<ol><li>%100 (w/v) stoktan seçilen kesirler (500 μL) son konsantrasyonu % 10, trichloroacetic asit (TCA) eklemek almak için en az 15 dk, bir microfuge santrifüje 5 min için buz üstünde, süpernatant atmak, iki kez buz gibi soğuk aseton ile yıkayın ve S 25 μL içinde erimesi DS-sayfa örnek yükleme arabellek Elektroforez için.</li>
	<li>SDS-sayfa yükleme ve PVDF membran için aşağıdaki transferi ile standart Elektroforez kuralları. Western Blot33için devam edin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Capewell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Trypanosoma+brucei+Total+and+Polysomal+mRNA+during+Development+within+Its+Mammalian+Host.">Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host.</a> PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).</li><li>Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiple+ribosomal+structure+in+protein+synthesis.">A multiple ribosomal structure in protein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).</li><li>Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+immune+responses:+from+transcripts+to+translatomes.">Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes.</a> Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).</li><li>Ennis, H. L., Lubin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycloheximide:+Aspects+of+Inhibition+of+Protein+Synthesis+in+Mammalian+Cells.">Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells.</a> Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).</li><li>Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients.">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).</li><li>Zuccotti, P., Modelska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Translatome+with+Polysome+Profiling.">Studying the Translatome with Polysome Profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).</li><li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).</li><li>Arava, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+translation+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nanoCAGE+reveals+5'+UTR+features+that+define+specific+modes+of+translation+of+functionally+related+MTOR-sensitive+mRNAs.">nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs.</a> Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).</li><li>Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+shows+that+miR-430+reduces+translation+before+causing+mRNA+decay+in+zebrafish.">Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish.</a> Science. 336 (6078), 233-237 (2012).</li><li>Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nip7p+interacts+with+Nop8p,+an+essential+nucleolar+protein+required+for+60S+ribosome+biogenesis,+and+the+exosome+subunit+Rrp43p.">Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p.</a> Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Gkogkas, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism-related+deficits+via+dysregulated+eIF4E-dependent+translational+control.">Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control.</a> Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).</li><li>Robichaud, N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+and+the+cancer+cell+response+to+stress.">Translational control and the cancer cell response to stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).</li><li>Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+muscle+protein+synthesis+and+the+effects+of+catabolic+states.">Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).</li><li>Ishimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+function.+Ribosome+stalling+induced+by+mutation+of+a+CNS-specific+tRNA+causes+neurodegeneration.">RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration.</a> Science. 345 (6195), 455-459 (2014).</li><li>Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+RNAs+repress+translation+after+initiation+in+mammalian+cells.">Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells.</a> Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).</li><li>Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+dynamics+revealed+by+genome-wide+profiling+of+ribosome+footprints+in+Arabidopsis.">Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).</li><li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).</li><li>De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+in+trypanosomatids.">Gene expression regulation in trypanosomatids.</a> Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).</li><li>Alves, L. R., Goldenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+related+to+stress+response+and+differentiation+in+protozoa.">RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa.</a> World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).</li><li>De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+differentiation+in+Leishmania+lifecycle+progression:+post-transcriptional+control+conducts+the+orchestra.">Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra.</a> Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).</li><li>Soto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle-dependent+translation+of+histone+mRNAs+is+the+key+control+point+for+regulation+of+histone+biosynthesis+in+Leishmania+infantum.">Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum.</a> Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).</li><li>McNicoll, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3+'-untranslated+region+elements+regulate+stage-specific+mRNA+accumulation+and+translation+in+Leishmania.">Distinct 3 '-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).</li><li>Folgueira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+efficiencies+of+the+two+Leishmania+infantum+HSP70+mRNAs,+differing+in+their+3+'-untranslated+regions,+are+affected+by+shifts+in+the+temperature+of+growth+through+different+mechanisms.">The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 '-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).</li><li>Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+developmentally+regulated+noncoding+RNAs+in+Leishmania.">A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania.</a> Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).</li><li>Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+the+human+parasite+Leishmania+major+delineates+a+30-kilobase+region+sufficient+for+extrachromosomal+replication+and+expression.">Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression.</a> Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).</li><li>Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+SecA+association+with+signal+sequences+in+ribosome-bound+nascent+chains:+a+potential+role+for+SecA+in+ribosome+targeting+to+the+bacterial+membrane.">Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+Fractionation+to+Analyze+mRNA+Distribution+Profiles.">Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles.</a> Bio Protocols. 7 (3), (2017).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+CFTR+transmembrane+span+integration+by+disease-causing+mutations.">Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).</li><li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational.">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li><li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress.">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).</li><li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+Controls+Mitochondrial+Dynamics+and+Cell+Survival+via+MTFP1.">mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1.</a> Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Polysome ayırma Sükroz degrade tarafından RNA ile kombine ve kesirler protein analizi bireysel mRNA'ların veya tüm translatome translasyonel durumunu yanı sıra translasyonel düzenleyen protein etkenler rolleri analiz etmek için güçlü bir yöntemdir makine normal fizyolojik veya hastalık durumu sırasında. Polysomal profil oluşturma nerede transkripsiyon kontrolü büyük ölçüde yoktur ve gen ifade düzenlemesi çoğunlukla oluşur LEISHMANIA de dahil olmak üzere trypanosomatids gibi organizmal...

Hücrelerde gen ifadesinin düzenlenmesi transkripsiyon, posttranscriptional ve ardından mekanizmaları tarafından kontrol edilir. Derin RNA sıralama gelişmeler genom geniş ölçekli bir benzeri görülmemiş düzeyde kararlı durum mRNA düzeylerinin çalışma izin. Ancak son bulgular kararlı durum mRNA düzeyi her zaman protein üretim1,2ile ilişkilendirmek değil ortaya. Bireysel bir transkript kaderi çok karmaşıktır ve iç/dış uyaranlara, stres, vbgibi birçok faktöre bağlıdır. Protein sentezi sırasında gen ifade Yönetmeliği ifade kontrol değişen koşullarına hızlı bir yanıt için gerekli bir başka bir katmanı sağlar. Polysome (ya da "polyribosome") profil oluşturma, ayrılık ve görselleştirme aktif ribozomlar, çeviri tür protein sentezi ile çalışmak için güçlü bir yöntemdir. Rağmen ilk deneysel uygulamaları 1960'larda3' te çıktı, polysome profil oluşturma şu anda en önemli teknikler protein çeviri çalışmaları4biridir. Tek mRNA'ların bir polysome oluşumu için önde gelen birden fazla ribozom tarafından tercüme edilebilir. Transkript ribozomlara sikloheksimit5 üzerinde durdu ve mRNA'ların polizomlar farklı numaralar içeren polysome ayırma sürecinde Sükroz degrade ultrasantrifüj6,7 tarafından ayrılabilir , 8 , 9. polysomal kesirler RNA analiz sonra genom geniş ölçekte ve farklı fizyolojik şartlarda4,7, sırasında değişiklik translasyonel bireysel mRNA'ların durumlarında ölçüm sağlar 10. yöntem da kullanılmıştır 5' UTR ve 3' UTR serilerinde mRNA translatability11kontrolünü rollerini ortaya çıkarmak, miRNAs translasyonel baskı12rolünü incelemek, ribozom biyongenezi13 kusurları ortaya çıkarmak için ve ribozom ilişkili proteinler ile insan hastalıkları14,15rolünü anlamak. Son on yılda, büyüyen bir rol için çeviri sırasında gen ifade Yönetmeliği insan hastalıkları önemini gösteren ortaya çıkmıştır. Kanser, metabolik translasyonel denetiminde ve nörodejeneratif hastalıklar için kanıt ezici15,16,17,18' dir. Örneğin, bozukluk eIF4E bağımlı translasyonel denetiminin katkıda otizm ile ilgili açıkları15 ve FMRP, ribozom mRNA'ların otizm14' e bağlı üzerinde durdurduklarını ilgilenmektedir. Böylece, polysomal profil oluşturma birden çok insan hastalıkları translasyonel yönetmelikte hataları incelemek için çok önemli bir araçtır.
Protein analizi farklı fizyolojik koşullar altında polysomal kesirler çeviri sırasında ribozomlar ile ilişkili faktörler fonksiyonunun olduğu inceliyor. Maya, memeli hücreleri, bitkiler ve tek hücreli10,19,20,21de dahil olmak üzere birçok canlı türünün polysome profil çıkarma tekniği kullanılmıştır. Protozoon parazitler Trypanosoma ve LEISHMANIA gibi gen ekspresyonu sınırlı transkripsiyon kontrolü sergi. Onların genleri organizatörü düzenlenir transkripsiyon22eksikliği polycistronic gen kümeler halinde düzenlenir. Bunun yerine, gelişimsel gen ekspresyonu ağırlıklı olarak protein çeviri ve mRNA istikrar trypanosomatid türler23,24düzeyinde kontrol edilir. Bu nedenle, transkripsiyon yönetmelik yokluğunda translasyonel kontrol anlayışı bu organizmalar için özellikle önemlidir. Polysomal profil oluşturma posttranscriptional düzenleme LEISHMANIA25,26,27,28gen ifadesinde, eğitim için güçlü bir araçtır.
Bireysel mRNA'ların düzeyleri gerçek tarafından algılanması son sürüyor kantitatif PCR (RT-qPCR) ve yeni nesil sıralama yanı sıra proteomik teknolojileri tarafından tam transcriptome zaman, çözünürlük ve polysomal yeni bir seviyeye profil oluşturma avantajlarını getiriyor. Bu yöntemlerin kullanımı daha da derin RNA sıralama hücreleri bir genom geniş ölçekte translasyonel durumunu izlemek için proteomik analizi ile birlikte bireysel polysomal kesirler analizi ile genişletilebilir. Bu çeviri farklı fizyolojik ve patolojik şartlar altında düzenleyen yeni moleküler oyuncular tanımlamasını sağlar. Burada, üç farklı modellerde kullanılan iletişim kuralı profil oluşturma bir evrensel polysome mevcut: parazit LEISHMANIA büyük, kültürlü insan hücreleri ve hayvan dokuları. Biz mevcut tavsiye farklı organizmalar, degrade koşullardan optimizasyonu, seçim RNase inhibitörleri ve RT-qPCR, Western blot ve RNA Elektroforez polysome kesirler bu çalışmada analiz etmek için uygulama üzerinden cep lysates hazırlanması.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gradient master</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>108</td><td></td></tr><tr><td>Piston Gradient Fractionator</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>Fraction collector</td><td>Gilson, Inc.</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>Nikon inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2-FL/Ts2</td><td></td></tr><tr><td>2720 Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems by Life Technologies</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Panasonic Healthcare Co.</td><td>MCO-170A1CUV</td><td></td></tr><tr><td>HERATHERM incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028063</td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet, class II, type A2</td><td>NuAire Inc.</td><td>NU-543-400</td><td></td></tr><tr><td>Revco freezer</td><td>Revco Technologies</td><td>ULT1386-5-D35</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L8-M Ultracentifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>L8M-70</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Swing-bucket rotor</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td></td></tr><tr><td>Fixed angle rotor</td><td>Eppendorf</td><td>F-45-30-11</td><td></td></tr><tr><td>Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4470661</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automated cell counter</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triax software&amp;nbsp;</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Counting slides, dual chamber for cell counter</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm)</td><td>Seton Scientific</td><td>7030</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 5 mL</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle</td><td>BD</td><td>10020439</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Surface plate, 14 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Surface plate, 9 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 75 cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; flasks</td><td>Thermo Scientific</td><td>130193</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL conical centrifuge tubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Ambion by Life Technologies</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1378-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium-high glucose (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F0926-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O)</td><td>Acros Organics</td><td>AC413415000</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 (NP-40)</td><td>Fluka (Sigma-Aldrich)</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H3993-1MU</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C7698-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>194002</td><td></td></tr><tr><td>Dithiotreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S316-212</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Life Technologies</td><td>22600050</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P8833-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3KG</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Hydroxide (KOH)</td><td>Sigma</td><td>221473-500G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RPL11 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab79352</td><td></td></tr><tr><td>Ribosomal protein S6 (C-8) antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-74459</td><td></td></tr><tr><td>1xM199</td><td>Sigma</td><td>M0393-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Lithium cloride</td><td>Sigma</td><td>L-9650</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Buffer II</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM8546G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Trichloracetic acid (TCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A322-100</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L5750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A1852-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine 5&#039;-triphosphate disodium salt hydrate (CTP)</td><td>Sigma</td><td>C1506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5&#039;-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP)</td><td>Sigma</td><td>U6625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 5&#039;-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)</td><td>Sigma</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Pyrophoshatase</td><td>Sigma</td><td>I1643-500UN</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis

Uygun protein ifade doğru zamanda ve doğru miktarda normal hücre işlevi ve hızla değişen bir ortamda hayatta kalma temeli budur. Uzun süre, gen ifade çalışmalar araştırma transkripsiyon düzeyde hakim. Ancak, mRNA'ların kararlı durum düzeyleri de protein üretimi ile ilişkilendirmek değil ve mRNA'ların translatability büyük ölçüde koşullarına göre değişiklik gösterebilir. LEISHMANIA, parazit gibi bazı organizmalarda protein ifade çoğunlukla translasyonel düzeyinde düzenlenmiştir. Son çalışmalar bu protein çeviri bozukluk kanser, metabolik, nörodejeneratif ve diğer insan hastalıkları ile ilişkili olduğunu gösterdi. Polysome profil oluşturma protein çeviri düzenleme eğitim için güçlü bir yöntemdir. Bu çeviri bir genom geniş ölçekte incelemek veya bireysel mRNA'ların translasyonel durumunu ölçmek için sağlar. Bu teknik polizomlar, ribozom, onların alt birimleri ve ücretsiz mRNA'ların sırasında Santrifüjü bir sitoplazmik, sukroz degrade lysate ayrılması temelidir. Burada, üç farklı modellerde - kullanılan bir evrensel polysome profil oluşturma iletişim kuralı parazit LEISHMANIA büyük, kültürlü insan hücreleri ve hayvan dokuları mevcut. LEISHMANIA hücrelerin serbestçe süspansiyon büyümesine ve fare testis bir hayvan doku örneği temsil ederken kültürlü insan hücreleri yapisan monolayer içinde büyür. Böylece, bu kaynakların tümüne adapte bir tekniktir. Protokolü polysomal kesirler analizi için algılama düzeylerinin bireysel mRNA tarafından RT-qPCR, proteinler tarafından Western blot ve Elektroforez tarafından ribozomal RNA'ların analizini içerir. Yöntemi daha da derin RNA-seq tarafından transcriptome düzeyde bir ribozom mRNA'ların ilişkilendirmesiyle incelenmesi ve analiz ribozom ilişkili proteinlerin tarafından kesirler kütle spektroskopisi tarafından uzatılabilir. Yöntem diğer biyolojik modelleri kolaylıkla ayarlanabilir.

Bu çalışmada, biz üç farklı kaynaklardan polysomal profil çıkarma tekniği uygulamaya tarif: parazit LEISHMANIA büyük, kültürlü insan hücreleri ve fare testis. Süspansiyon içinde sıvı ortamda serbestçe LEISHMANIA hücrelerin büyümesine, kültürlü insan hücreleri yapisan monolayer Tabaklarda büyümek ve fare testis doku örneği temsil eder. Yöntem, süspansiyon, farklı dokuların veya başka bir organizmadan ve kültürlü hücrelerinin farklı...

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis at JoVE.com

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profil çıkarma tekniği genel amacı, protein sentezi sırasında translasyonel etkinlik bireysel mRNA'ların veya transcriptome mRNA'ların analizidir. Protein sentezi yönetmelik, çeviri harekete geçirmek ve baskı sağlık ve birden çok insan hastalıkları için önemli bir yöntemdir.

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

polysome-profiling-in-leishmania-human-cells-and-mouse-testis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

18.0K Görüntüleme.  Texas Tech University Health Sciences Center. Polysome profil çıkarma tekniği genel amacı, protein sentezi sırasında translasyonel etkinlik bireysel mRNA'ların veya transcriptome mRNA'ların analizidir. Protein sentezi yönetmelik, çeviri harekete geçirmek ve baskı sağlık ve birden çok insan hastalıkları için önemli bir yöntemdir.

Video: Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Biyokimya

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

Hücre içi Karşı Antileishmanial Tarama için Parasite Kurtarma ve Dönüşüm Testi<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 İnsan Akut Monositik Lösemi Hücre Hattı&gt; Amastigotes

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Development of Leishmania Species Strains with Constitutive Expression of eGFP

Protozoan parasites of the genus Leishmania cause leishmaniasis, a disease with variable clinical manifestations that affects millions of people worldwide. Infection with L. donovani can result in fatal visceral disease. In Panama, Colombia, and Costa Rica, L. panamensis is responsible for most of the reported cases of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Studying a large number of drug candidates with the methodologies available to date is quite difficult, given that they are very laborious for evaluating the activity of compounds against intracellular forms of the parasite or for performing in vivo assays. In this work, we describe the generation of L. panamensis and L. donovani strains with constitutive expression of the gene that encodes for an enhanced green fluorescent protein (eGFP) integrated into the locus that encodes for 18S rRNA (ssu). The gene encoding eGFP was obtained from a commercial vector and amplified by polymerase chain reaction (PCR) to enrich it and add restriction sites for the BglII and KpnI enzymes. The eGFP amplicon was isolated by agarose gel purification, digested with the enzymes BglII and KpnI, and ligated into the Leishmania expression vector pLEXSY-sat2.1 previously digested with the same set of enzymes. The expression vector with the cloned gene was propagated in E. coli, purified, and the presence of the insert was verified by colony PCR. The purified plasmid was linearized and used to transfect L. donovani and L. panamensis parasites. The integration of the gene was verified by PCR. The expression of the eGFP gene was evaluated by flow cytometry. Fluorescent parasites were cloned by limiting dilution, and clones with the highest fluorescence intensity were selected using flow cytometry.

Development of Leishmania Species Strains with Constitutive Expression of eGFP

Here, we describe the methodology used for generating L. panamensis and L. donovani strains expressing the gene for eGFP as a stable integrated transgene using the pLEXSY system. Transfected parasites were cloned by limiting dilution, and clones with the highest fluorescence intensity in both species were selected for further use in drug screening assays.

eGFP'nin Yapısal Ekspresyonu ile Leishmania Tür Suşlarının Gelişimi

Protozoan parasites of the genus Leishmania cause leishmaniasis, a disease with variable clinical manifestations that affects millions of people ...

Genetik

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

Erkek Farenin Germ Hücrelerinde RiboTag İmmünanyağış

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Gelişim Biyolojisi

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Biyoloji

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Nörobilim

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...