Name: monitoring astrocyte reactivity and proliferation in vitro under ischemic-like conditions
Uploaded: 2017-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions at JoVE.com

저자는 기술 지원에 대 한 파 올라 로페스 Pieraldi를 감사 드립니다. A.H.M.는 보조금 8G12MD007600 및 U54-NS083924이이 간행물을 지원에 대 한 감사. 우리 시설 지원에 대 한 NIH-NIMHD-G12-MD007583 그랜트를 감사합니다. D.E.R.A.는 NIHNIGMS-R25GM110513에서 제공 하는 원정대에 대 한 감사입니다. 우리는 일반적인 계측 영역의 사용에 대 한 감사와 광학 이미징 시설 RCMI 프로그램의 사용에 대 한 박사 Priscila Sanabria의 원조 G12MD007583 부여. 또한, 우리는 그의 뛰어난 역할을 촬영 하 고 편집 하는 시각적 프로토콜에 대 한 호세 빠 디 야 감사 드립니다.

1-4 일 산 후 쥐 (Sprague Dawley) 오래 된 외피가 분리 하는 데 사용 됩니다. 안락사는 잘린, NIH 지침에 의해 승인.
 1. 악기의 준비와 수술에 대 한 자료 <ol><li>압력솥에 Sterilize 계기 (온도: 121 ° C, 압력: 15 psi, 시간: 30 분) 강철 상자 또는 살 균 주머니 씰링 인스턴트를 사용 하 여. 자료 테이블에에서 자료를 참조 하십시오.</li>
</ol> 2. DMEM 준비 완료 <ol><li>압력가 물 700 mL를 포함 하는 1 리터 비 커에 추가 Dulbecco &#39; s 수정이 글 &#39; s 실 온에서 중간 파우더.</li>
	<li>3.7 g/L 나트륨 중 탄산염, 솔루션은 자력으로 자극 하는 동안 추가.</li>
	<li>조정 7.4, 압력가 마로 소독 물에 pH 1 L, 볼륨을가지고 필터링 합니다. 10 %FBS 1% 미디어의 원하는 볼륨 보충 목적을 위해 문화, 페니실린/스, 및 37 ˚C에서 따뜻한. 자료 테이블에에서 자료를 참조 하십시오. 
	참고: PH 7.4 미디어 pH 미터 전극 삽입을 통해 조정 했다. 천천히 1 M NaOH를 스 포 이트를 사용 하 여 추가 미디어 감동 해야 합니다,.</li>
</ol> 3. 기본 사이토 문화 참고: 시드, 후 셀 미디어 3 일 마다 변경 되어야 하 고 셀 confluency (11-13 일)까지 성장 될 수 있다. 제 3의 날에 여러 번 리프트 microglial 세포와 문화에서 oligodendrocyte 조상 세포를 플라스 크를 모두 제거는 &#39; 오래 된 &#39; 미디어, PBS의 10 mL를 사용 하 여 두 번 세척, PBS, 발음 다음 신선한 새로운 미디어를 추가. 자료 테이블에에서 자료를 참조 하십시오.
<li>신생아 쥐 두뇌의 해 부 <ol><li>수행 조직 문화 후드에서 절 개 <ol>. 얻기 1-4 일 (2 쥐 두뇌 75 cm 2 플라스 크 당 사용 하는) 오래 된 신생아 쥐 새끼.</li>
		<li>3 60 mm 페 트리 접시를 준비 하 고 각각에 완전 한 DMEM의 5 mL를 플라스틱. 
		참고: 그들은 다음과 같이 분할 될 수 있다: #1 각 쥐 뇌, 두뇌의 모든 외피가 (meninges) 없이 모든 벗 겨 외피가 #3 #2.</li>
		<li>파악 강아지와 70% 에탄올 스프레이. 그것은 목을 벨 하 고 작은 생물 학적 폐기물 컨테이너에 시체를 버리고.</li>
		<li>마이크로 해 부 핀셋을 사용 하 여, 머리를 누른 노출은 두개골 머리 위에 피부를 잘라.</li>
		<li>또 한 쌍의가 위, 게는 &#34; T &#34; 절 개는 코 쪽으로 두개골의 뒤쪽에서 시작. 집게의 쌍을 사용 하 여 부드럽게 제거 두개골.</li>
		<li>핀셋의 쌍으로 노출 된 뇌를 제거 하 고 뇌 이전 매체 가득 배양 접시 중 하나에 놓습니다.</li>
		<li>후속 단계에 대 한 살 균 계기의 다른 세트를 사용 하 여.</li>
		<li>는 마이크로 해 부 집게를 사용 하 여 부드럽게 60 mm 페 트리 접시의 뚜껑을 거꾸로 한 두뇌를 위. 페 트리 접시는 멸 균 거 즈에 배치 됩니다, 그것은 두뇌를 명확 하 게 볼 수 고 해 부 쉽습니다.</li>
		<li>마이크로 해 부 집게와 뇌를 꾸준히 하 고 분리 되는 대뇌 반구 마이크로 해 부 집게의 날카로운 끝을 가진 중간 균열을 따라 부드럽게 놀리는.</li>
		<li>Deflect 백색 질 뒤에 남겨두고 외피가 껍질 하 고 이전 표시 #2 페 트리 접시에 그들을 전송. 모든 두뇌, # 2를 표시 하는 페 트리 접시에 모든 해 부 외피가 결합에 대 한 절차를 반복.</li>
		<li>각 피 질 밑에서 해 마에 밖으로가 고 그것을 삭제</li>
		<li>마이크로 해 부 족집게와 60 mm 페 트리를 사용 하 여 개별 대뇌 피 질의 엽에서 meninges 껍질을 부드럽게 하 고 # 3를 표시 하는 페 트리 접시에 그들을 배치.</li>
	</ol></li> <li>조직 분리: 균질 화기 믹서 메서드 <ol><li>살 균 믹서 기 가방으로 조직/중간 정지 (뇌의 껍질을 벗 겨 외피가)을 부 어 하 고 가방에 5 mL 전체 볼륨을가지고 충분 한 매체 추가.</li>
		<li>닫힌된 문 위에 보이는 가방 약 2 cm를 떠나 균질 화기 믹서 기에 가방을 놓습니다. 셀 분리 고속에서 2.5 분 동안 이루어집니다. 
		참고: 또는,이 가방을 닫고 부드럽게 후드에서 비 커와 요동에 의해 수행할 수 있습니다. 피복 부 대와 비이 커를 사용 하 여 마찰을 피하기 위해 있는지 확인 하십시오.</li>
		<li>번호 60 메쉬 체에 세포 현 탁 액을 부 어 하 고 다음에 번호 100 체, 중력에 의해 필터링을 통해 필터링 된 흐름을 붓는 다.</li>
		<li>사용 하 여 15 mL 튜브, 원심에서 5 분에 대 한 임상 원심 분리기 (선호: 스윙 양동이 터)에 200 x g 세포 현 탁 액</li>
		<li>부는 비 커에 상쾌한 어 그리고 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 다시 일시 중단 최대 미디어의 5 mL에에서 셀의 펠 릿을 해리.</li>
	</ol></li> <li>셀 계산 <ol><li>micropipette와 함께 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액의 100 µ L를 수집 하 고 trypan 파랑의 100 µ L를 추가.</li>
		<li>는 hemocytometer에 수집 된 서 스 펜 션의 10 µ L 하 고 광장의 네 모퉁이 있는 모든 셀을 카운트.</li>
		<li>셀의 밀도 계산 하는 플라스 크를 준비 하기 전에 공식입니다: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55108/55108eq1.jpg" /> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/55108/55108eq2.jpg" /></li> <li>25 c m 2 플라스 크 당 적어도 500000 셀 추가. 각 플라스 크에 DMEM의 5 mL를 플라스틱 혼합물은 플라스 크의 목에 도달 하지 해야 합니다. 3 일 동안, 5% CO 2, 37 ° C 배양 기에 넣어 다음 미디어 변경.</li>
	</ol></li> <li>사이토 정화 기법: 미디어 변경, 기계, 및 화학 전략 참고: 이다의 신진 대사 속도 다른 세포 유형에 비해 높은에 따라서, 영양 박탈 조건,이 셀이 몇 일 후 낮은 생존 율을 보여. 이다, 달리 microglia 영양 부족에 의해 영향을 받지 않습니다 및 이러한 환경 18에서 증식. Microglial 세포의 감소 된 수를 유지 하려면 저자는 astroglial 세포 배양 3 일 마다 변경 합니다. 셀 미디어에서 지속적인 변화가 또한 플라스 크 19에서 astrocytic 셀 단층 위에 성장할 수 있는 microglial 인구를 줄일 것 이다.
	비 점착 microglial 세포는 플라스 크의 각 미디어 발음을 <ol><li>사용은 파스퇴르 피 펫. 워시 모든 파편 dropwise 방식 (5 mL/플라스 크) 각은 플라스 크를 살 균 필터링 PBS를 사용 하 여 뒤에 왼쪽.</li>
		<li>추가 (항생제와 태아 둔감 한 혈 청)와 살 균 필터링 DMEM dropwise 각 플라스 크 (5 mL/플라스 크). 부드럽게 전체 표면을 커버 하는 원형 운동에 선동.</li>
		<li>는 37 곳 셀 &# 176; 플라스 크 confluency에 도달할 때까지 8-10 일 동안 5% CO 2 C 인큐베이터 (&#62; 95% 플레이트 범위). 
		참고: 여러 프로토콜 이다 confluency에 도달, 24 h 2에서 문화를 떨고와 같은 기계적인 방법을 셀이이 이다, 주로 microglia 및 전조 위에 있는 셀의 초연에 이르게 나타났습니다 19 , 20.</li>
		<li>비 astrocytic 세포 문화에 30 분 동안 180 rpm에서 궤도 동요를 수행 하 여 줄일 수 있습니다. 상쾌한에 세포를 제거한 후 신선한 미디어 플라스 크 (~ 15 mL)에 pipetted은.</li>
		<li>Oligodendrocyte 조상 세포를 제거 하는 6 h 21 , , 22 23, aspirate 상쾌한을 피펫으로 신선한 미디어 200 rpm을 떨고 속도 증가. 
		참고: Microglia 문화에의 존재를 줄이려면 두 가지 화학 방법을 순차적으로 사용할 수 있습니다 (동시에) 1 차 셀 문화 방법론에서: Arabinose 시 토 신 (아 라-C) 및 L-신 메 틸 에스테 르 (LME) 24.</li>
		<li>셀 confluency (100%)를 도달 했을 때, 즉시 microglia의 기계적 제거 후 3-4 일이이 세포로 치료가 될 수는 antimitotic 복합 Arabinose 시 토 신 (아 라-C)의 8 µ M DMEM에 5 일 (신선한 아 라-C DMEM 매일 변경)에 대 한. 
		참고: 시간 아 라-c 요점은 중요 한이 화합물 이기 때문에 antimitotic 마약, microglia 19 , 25 및 섬유 아 세포와 같은 급속 하 게 분할 세포의 수를 감소 시키는 26 . Microglia, 달리 confluent, 이다 중지 접촉 저해 27를 통해 확산.</li>
		<li>Ara C 치료에서 회복 하기 위해 셀에 대 한 일.</li>
		더 후 셀 도달 confluency, microglial 오염 줄이기 위해 <li>DMEM pH 7.4, 37 ˚C에서 1 h에 고정에서 50mm L 신 메 틸 에스테 르 (LME)의 사용. 
		참고: LME 십자가 세포와, 세포의 막 그리고 분해 되 고, 후 생산 L 신이이 세포의 리소좀 축적. 이 아미노산의 축적 한 삼투성 붓기와 리소좀 28 , 29의 파열에 지도 한다. LME microglia, 다른 셀 20 , 30에 비해 제거에 매우 효과적 이다.</li>
	</ol></li></ol> 4. 6 잘 플레이트에 이다 육성 <ol><li>폴 리 D lysine과 코팅 coverslips <ol><li>넣어 한 coverslip 각 35 mm 페 트리 접시에, 그때 각 coverslip 희석된 폴 리-D-리 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 대기 1 헤</li>
		<li>폴 리-D-리 신을 제거 하 고 2 살 균 물으로 두 번 세척.</li>
		<li>물을 제거 하 고 coverslips 후드 내부 건조 기다립니다. 2 주 동안-20 ° C에서 coverslips 저장. 
		참고: 고정 희석된 폴 리-D-리 솔루션; 그것은 최대 2 주 동안 저장 될 수 있다.</li>
	</ol></li> <li>Trypsinization <ol><li>는 플라스 크에서 중간 발음 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여. 부드럽게 셀 린스를 살 균 필터링 PBS의 5 mL/플라스 크 추가.</li>
		<li>Aspirate PBS를 끄고 살 균 필터링 0.25 %Trypsin 및 0.5 m EDTA 솔루션의 5 mL/플라스 크를 추가. 37 ˚C, 10 분에 대 한 5% CO 2 배양 기에에서 플라스 크를 배치 
		참고: 셀은 잠복기 동안 따뜻한 플라스 크 mL 5/37에서 신선한 완전 한 DMEM의 ° c.</li>
		<li>후 10 분, 외피의 모든 세포는 플라스 크를 낸 되도록 교 반 하십시오. 신속 하 게 무력화는 트립 신 각 플라스 크에 따뜻한 완벽 한 DMEM의 5 mL을 추가.</li>
		<li>부드럽게 위아래로 여러 번 어떤 헤어 셀 플라스틱 &#34; 덩어리 &#34;. 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 두 개의 플라스 크에서 일시 중단 된 셀 전송.</li>
		<li>200 x 5 분 동안 원심 분리기 g 세포 pellet를 수집. 다시 중간의 500 µ L에 펠 릿을 일시 중단 하 고는 플라스 크에 세포를 진행. 
		참고: 셀으로 만들 수 분석의 예: 1) 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR) 유전자 발현; 분석 하 단백질 표정; 평가 하 2) 서쪽 오 점 3) 흐름 cytometry 분석 계량 신경 조상 세포의 수와 관심;의 단백질을 4) 면역 형광 단백질 식 및 지역화 분석.</li>
	</ol></li> <li>시드 이다 <ol><li>trypsin으로 기본 이다 치료 후 (4.2 참조), microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액의 100 μ를 수집 하 고 추가 0.5 %trypan 파랑의 100 μ.</li>
		<li>Trypan에서 수집 된 서 스 펜 션의 추가 10 μ는 hemocytometer 파랑 및 가능한 모든 셀을 카운트.</li>
		<li>는 플라스 크를 준비 하기 전에 셀의 밀도 계산 하는 공식 단계 3.3에서에서 사용.</li>
		<li>준비 다 잘 요리 한 살 균을 추가 하 여, 폴 리-D-리 신 각 우물에 coverslip 코팅. 플라스틱 50000 셀 하 고 신선한 매체 (약 2 mL)와 각 다 잘 접시에 볼륨의 나머지를 작성.</li>
		<li>멀티 잘 요리 5% CO 2 37 ˚C 인큐베이터에 놓고, 5-7 일 후에 이다 수 성장 하 고는 coverslips의 전체 표면을 커버.</li>
	</ol></li></ol> 5. 기본 이다에 대 한 지도부 프로토콜 <ol><li>지도부 중간 준비 <ol><li>보충 Dulbecco &#39; s 수정이 글 &#39; s 매체 무료 포도 당 3.7 g/L 나트륨 중 탄산염, 그리고 1% 페니실린/스. 표 4에 자료를 참조 하십시오.</li>
		<li>2 95% N / 5%를 버블링 하 여 포도 당 자유로운 매체의 20 mL를 제거 15 L/min (흐름 미터 표시) 매체에 가스 시스템에 혈 청 학적인 피 펫을 삽입 하 여 흐름에 10 분 CO 2. 
		참고: 산소의 제거, 후 7.4 (단계 2.1에 참고 참조)에 pH를 조정.</li>
		<li>필터링 50 mL 튜브 필터 시스템을 사용 하 여 제거 된 포도 당 자유로운 매체. 
		참고: 버블링 2 95% N / 5%, 모든 실험에 대 한 신선한 지도부 매체 확인 셀 산소의 제거는 환경에 노출 되어 있는지 확인 하려면 사용 하기 전에 CO 2.</li>
	</ol></li> <li>실험 절차 <ol><li>이전 준비 coverslips (4.3.5 단계로 참조)에서 사이토 미디어 조직 문화 후드 안에 제거 그리고 세포에 있는 포도 당을 제거 하려면 두 번 셀룰러 PBS로 세척.</li>
		<li>는 지도부 미디어의 2 개 mL를 추가 각 잘 하 고 다 잘 요리 그들의 뚜껑에서 hypoxia 챔버 내부 배치</li>
		<li>입구 밸브에 가스 혼합물을 연결 하 고 출구 밸브를 열어 둡니다. 플러시 챔버 가스 혼합 2 95% N / 5% CO 2, 5 분에 대 한 15 L/분</li>
		<li>가스 흐름을 막을 먼저 출구 밸브에 클램프를 닫고 다음 가스 입구 밸브 배관에 클램프를 닫습니다. 
		참고: 비눗물으로 챔버의 인감을 취재 하 여 가스 누설입니다 확인 하십시오. 아니 거품 형성 한다 물개 안전 경우.</li>
		<li>37 ° C 1 시간 또는 지도부에 6 h에서 셀 문화 인큐베이터 전체 챔버를 넣습니다.</li>
		<li>보육 시간, 끝난 후 지도부 미디어 발음 및 신중 하 게 각 4.67 cm 2는 normoxic를 위해 잘 완전 한 DMEM의 2 개 mL를 피펫으로 24 h. 처리</li>
	</ol></li></ol> 6. 기본 사이토 면역 형광 검사 준비를 위한 프로토콜 참고: 사이토 순도 평가, 다른 뇌 세포 종류와 같은 신경, microglia, 및 oligodendrocytes에 의해 검출 될 수 있다 다른 사용 하 여 면역 형광 세포 마커. 확산 마커, PCNA, 및 propidium 요오드 화물 (PI) 기본 이다 normoxic 조건 다음 지도부에 노출에 사용할 수 있습니다. 자료 테이블에에서 자료를 참조 하십시오.
<ol><li>면역 형광 검사 준비 참고:이 일반적인 면역 형광 검사 프로토콜, 사소한 수정 (예를 들어, 더 이상 부 화 기간, 최적의 신호를 달성 하기 위해 수행할 수 있습니다 부 화 온도)입니다. 표 1에서 각 마커는 제조업체에 따라 사용할 수 있습니다 &#39; s 프로토콜.
	<ol>세포 생존 능력을 평가 하는 <li>세포와 37 ° C에서 5 분 동안 incubated 수 파이 (완전 한 DMEM 5 µ M)와 PI 얼룩을 보여 주는 5 분 셀은 보다 적게 가능한 한 2 mL의 PBS로 두번 세척. 
		참고: 세포 치료 단계 5.2.6 사용.</li>
		<li>PI 염색 후 세포를 해결 하기 위해 4 ˚C에서 20 분, 4.67 c m 2 당 4% 포 르 말린의 2 개 mL를 추가 합니다. PCNA와 함께 표시 하는 샘플에 대 한 기본 고정 솔루션은 메탄올 4 ˚C에서 10 분. 
		주의: 포 르 말린과 메탄올은 독성. 
		참고: 항상 각 회사에서 특정 항 체 프로토콜을 확인 하십시오.</li>
		<li>5 분에 대 한 PBS의 2 mL로 세포 세척 하 고이 단계를 반복 하 여 3 번.</li>
		<li>솔루션을 차단에 셀을 품 어 (0.5% 비 이온 계면 활성 제, 10% FBS PBS에) 부드러운 진동으로 실 온에서 30 분.</li>
		<li>5 분에 대 한 PBS의 2 mL로 세포 세척, 세척을 3 번 반복.</li>
		<li>1 차적인 항 체 (PCNA, GFAP) 1%의 솔루션에서으로 4 ° C에서 하룻밤 (16h), 품 어 PBS에서 FBS.</li>
		<li>1 차적인 항 체 솔루션을 제거, 5 분, PBS의 2 mL로 세포 세척 하 고 3 번이이 단계를 반복.</li>
		<li>1%의 솔루션에 fluorophore와 활용 된 이차 항 체와 품 PBS, 실 온에서 1 h에서 FBS.</li>
		<li>셀 2 mL PBS의 5 분을 씻어, 3 번이이 단계를 반복 합니다. DAPI의 1 µ g/mL를 추가 (4 &#39; 6, &#39;-diamidino-2-phenylindole) 얼룩 세포 핵 5 분.</li>
		<li>PBS 5 분의 2 mL로 세포 세척,이 단계를 두 번 반복 시키고 PBS에.</li>
		<li>설치 매체를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslips 준비.</li>
	</ol></li> <li>Confocal 현미경 <ol><li>현미경을 설정한 후 위 coverslip 측면 아래로 현미경 단계.</li>
		<li>소프트웨어를 사용 하 여 선택 GFAP Cy3 활용 된 항 체에 대 한 543nm에서 레이저 빔.</li>
	</ol></li></ol> 7. 세포 생존 능력 분석 결과 <ol><li>Trypsinize와 다음 단계로 4.3 및 4.4 이다 계량.</li>
	<li>96 잘 접시 1 x 10 4 셀/잘 추가 하 고 confluency에 그들을 성장.</li>
	<li>교양된 96 잘 접시 중 normoxic 1 h 지도부에 노출 5 단계에서 방법론을 사용 하 여, 또는 6 h 지도부.</li>
	<li>지도부 후 치료, normoxic 미디어 24 h에 대 한 모든 셀에 추가 되 고 생존 MTT 시 분석 결과 사용 하 여 측정 된다 (제조자로 사용 &#39; s 명령을 나타냅니다).</li>
	<li>5 mg/mL MTT 솔루션에서 각 잘을 총 볼륨의 10%를 추가 하 고 MTT 시와 37 ˚C에서 3 h에 품 어.</li>
	<li>는 미디어를 제거 하 고 결정 200 µ L 디 메 틸 sulfoxide를 사용 하 여 resuspend. 570에서 분 광 광도 계에 접시를 읽고 nm. 
	참고: 제어 셀을 기준으로 감소 흡 광도 적은 생존 연관 됩니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 프로토콜 이다 쥐 외피가에서 격리를 설명합니다. 이 방법에서는, 그것은 microglia, oligodendrocytes, 섬유 아 세포 등 다른 세포 종류와 오염 감소에 중요 한입니다. Microglia의 수를 줄이기 위해, 몇 가지 단계를 취할 수 있습니다: 미디어, 떨고, 궤도 및 화학 치료를 변경. 가장 눈에 띄는 셀 오염 물질에 대 한 선택적 세포 마커를 사용 하 여 면역 형광 또는 문화 순수성을 확인 실험을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 이온화 칼슘 바인딩 접합 기 분자 1 (Iba-1)에 대 한 항 체 microglia 감지를 사용할 수 있습니다. 신경 죽음 문화에 일찍 시작 하 고이 세포는 플라스 크 도청 후 oligodendrocyte 선구자 세포 (OPCs) 함께 제거 미디어 변경 3 일31. Oligodendrocytic 선구자 세포 olig2 NG2 등 항 체를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. GalC 미 숙 또는 성숙한 oligodendrocytes를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다 하지만이 문화 단계에서 이들은 찾을 수 것입니다. 또는 비 GFAP 긍정적인 세포를 측정할 수 수 하 고 오염 물질을 예상할 수 있습니다. 이 마지막 방법론 특정 셀 사이의 분별 하지 않습니다 하지만 더 빠르고 더 많은 경제 방법론을 문화에 비 astrocytic 세포의 백분율을 결정 됩니다.
사이토 농축 문화 생산은 일단 지도부 실험 사이토 반응성 연구를 수행할 수 있습니다. 버블링 산소를 대체 하 여 질소 솔루션 제거는 일반적으로 사용 되는 프로토콜32이다. 우리의 방법론를 사용 하 여 버블링 메서드 0.025 l.의 전체 볼륨에 대 일 분 15 L/min의 유량에서 포도 당 자유로운 매체에 (95% N2, 5% CO2) 질소 가스와 산소를 제거 확인 하 고 산소 제거, 액체 및 공기는 산소 측정기를 사용 하 여 미디어에 남아 있는 산소 농도 측정 했습니다. 10 분 동안 제거 후 미디어에 남아 있는 산소 농도 0.3 m g/l.에 7.9 mg/L에서 감소 산소, N2 와 제거를 대체 하는 챔버 해야 합니다 제거 하는 얼마나 오래 결정 챔버 제조 업체의 제안 (20 L/min, 2-5 분) 보다는 더 적은 사용 하 여 수행 되었다. 15 L/min에서 정화의 5 분 후 챔버에 남아 있는 산소 농도 0%를 했다. 유사한 챔버를 사용 하 여 다른 방법론 8-20 L/min 흐름 속도 및 공기 산소와 질소33,34를 대체할 5-10 분의 시간에서 제거 했습니다.
다른 휴대 전화 모델과 마찬가지로 지도부는 제한 하 고 결과 신중 하 게 해석 한다. 그러나 지도부는 뉴런에 유해할 수 있다,, 이다 최대 24 h35에 대 한 이러한 조건을 견딜 수 있습니다. 또 다른 한계는 이다 다른 세포에서 신호 부족이 시스템에서 격리 됩니다. 이 제한을 극복 하기 위해 한 가지 방법은 같은 허 혈 성 같은 상태에서 다른 셀에서 조건된 미디어를 사용 하는 것입니다. 또는, cytokines 또는 다른 요인 수에 추가 미디어 지도부36후.
셀, 에너지 부족의 효과 연구 하는 대체 방법에 ouabain를 추가 하는.  이 화합물은 주로 나트륨/칼륨 펌프, ATP, 지도부37,38의 효과 비슷한의 세포내 생산 감소를 억제. 그러나,이 메서드는 단점은 모든 메커니즘은 완전히 이해 되지 않습니다 및 오프 대상 효과 유도 소개 하는 허 혈 성 뇌졸중 비현실적인 시나리오를 구성 하는 변수.
요약 하자면, 지도부 메서드는 다른 astrocytic 마약 대상에서 생체 외에서 더 neuroprotection에 기여할 수 있는 효과 직접 테스트를 수 있는 격리 된 셀 시스템. 그것은 또한 기본적인 사이토 생물학을 공부 하는 도구를 제공 합니다. 이 모델은 선의 비보에 모델을 사용 하 여 약물의 개발에 대 한 실험 조건을 정당화 하는 증거의 강한 기초를 만들 수 있습니다.

선 "는 급성 신경 부전 혈관 근원의 증상 및 징후, 뇌의 초점 분야의 참여 하에 해당의 급격 하거나 급속 한 개발"1,2로 정의 됩니다. 뇌졸중의 두 가지 유형이 있다: 출혈 및 허 혈 성. 혈관 장애는 동맥 류 또는 arteriovenous 오작동, 약화의 동맥, 후부 파열과 동반 하 여 발생 하는 경우이, 죽음에 이르게 하는 대부분의 경우에는 출혈 성 뇌졸중3 이라고 불린다. 혈전 또는 embolus 혈액 흐름을 방해, 산소와 포도 당 두뇌 지역에의 임시 박탈을 일으키는 그것 이라고 뇌경색4합니다. 영향을 받는 지역 또는 항상성 및 대사 불균형, 에너지 장애, 신경 죽음, 및 염증5, 환자6평생 장애를 일으킬 수 있는 허 혈 성 핵심 리드 주위 세포를 키 우다 실패.
허 혈 성 뇌졸중은 반응 하 고 다른 시간 지점에서 그들의 효과 발휘 하는 셀의 여러 종류를 포함 multifactorial 부상이 다. 많은 상호 작용 개별 셀의 동작을 연구 하는 어려운 환경을 만들. 그래서, 우리가 어떻게 이러한 복잡 한 환경에서 특정 세포 유형에의 기여를 연구? 허 혈의 허용 시험관에 모델 이루어져 있다 산소와 포도 당 부족 (지도부), 세포를 노출 특정 기간에 대 한 다음 normoxic 환경에 세포의 복원. 이 시스템은 혈 reperfusion 뒤 허 혈 성 뇌졸중을 시뮬레이션 합니다. 이 방법에서는, 세포 또는 조직 전문된 hypoxic 챔버를 사용 하 여 산소의 제거는 환경에서 포도 당 자유로운 매체에 노출 됩니다. 지도부 부 화 시간 몇 분에서 최대 24 h, 가설을 테스트 하 고 싶어에 따라 달라질 수 있습니다. 연구 하는 지도부의 시대에 따라 그리고 normoxic 환경, 스트로크 (즉, 급성 또는 아민)의 특정 고기를 얻을 수 있다. 기본 절연된 이다, normoxic 조건에 후부 복원와 지도부에 노출 선 체 외7모방을 잘 공부 셀룰러 모델 이다. 지도부를 사용 하 여 뇌졸중 같은 환경에서 격리 된 셀의 독립적인 분자 메커니즘을 밝힐 수 있다.
사이토 생물학의 우리의 지식을 증가, 그것은 분명 그들은 시 냅 스를 유지 하 고 신경 수리, 개발, 및 소성8유지에 대 한 중요 한 되고있다. 정상적인 조건 하에서 이다 놓고 cytokines, 발산, 성장 인자 및 gliotransmitters, 신진 대사 균형 및 시 냅 스5,9내 항상성 유지에 응답. 허 혈 성 뇌졸중 등 급성 neuroinflammation에이 셀 수 있다 반응 될, 장기 overexpression의 폐해 Fibrillary 산 성 단백질 (GFAP), 표시 및 그들의 형태학5,10, 에 비 표시 11 , 12. 허 혈 성 경색 개발로, 항상성 이다에 의해 제공 된다 영향을, 일반 조미료 통풍 관, 에너지 대사, 활성 분자, 그리고 항 산화 활동13의 교환에 관한.
다시 활성화 이다 백혈구14lesioned 지역 이동 하는 동안 경색 조직 주위 확산. Astrocytic 확산 증식 세포 핵 항 원 (PCNA), Ki67, 등 bromodeoxyuridine (BrdU)15마커를 사용 하 여 측정 될 수 있다. 이 증식 응답 시간-종속 방식으로 생성 되 고 glial 흉터, 부상9후 손상 된 사이트의 실질에 따라 돌이킬 반응성 이다의 배열을 형성 하는 데 도움이. 이 흉터의 초기 기능 중 하나는이 지역에서 면역 세포 넘쳐 흐름을 제한 것입니다. 그러나, 연구 흉터 확장 하, 그들은 릴리스 axonal 성장 억제 분자 고 부상된 지역16주위 확장에서 축 삭을 방지 물리적 장벽을 만드는 축 삭에 대 한 물리적 장애물이 되는 것으로 나타났습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그 척수 상해 후 완전히 glial 흉터 대형을 방지 수 있습니다 손상17축 삭 재생을 보여주는 과학적인 증거가 있다. 따라서, 컨텍스트는 특정 astrocytic 응답 측정, 공부 하는 상해의 프레임 워크에 고려 되어야 한다.
제시 하는 방법론 산소가 포도 당 결핍 후 이다의 개별된 기능 연구에 적용할 수 있습니다 그리고 탐정 대답을 원하는 질문에 따라 수정할 수 있습니다. 예를 들어 형태학 상 변화와 다른 지도부 시간에 표현 하는 마커, 게다가 이다 지도부에 노출에서 supernatants 분석 될 수 있다 더 식별 성 요인,이 세포에 의해 발표 또는 바른된 미디어로 평가 하는 데 사용 하는 다른 뇌 세포에 효과입니다. 이 이렇게 규제 하 고 허 혈 성 뇌졸중 시나리오에서 그들의 응답을 조절 하는 요인의 설명으로 이어질 수 있는 사이토 반응성에 대 한 연구를 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments for Surgery - Step 1&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Operating scissor 5.5&amp;rdquo;</td><td>Roboz Company</td><td>RS-6812</td><td>Tools used to decapitate the rats.</td></tr><tr><td>Curved forceps 7&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td><td>Roboz Company</td><td>RS-5271</td><td>Holds the skin of the rat while the skull is removed.</td></tr><tr><td>Micro-dissecting scissors 4&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td><td>Roboz Company</td><td>RS-5882</td><td>Cuts both the skin and skull of the rat.</td></tr><tr><td>Micro-dissecting forceps 4&amp;rdquo; angled, fine sharp&amp;nbsp;</td><td>Roboz Company</td><td>RS-5095</td><td>Holds the skin of the rat while the skull is removed.</td></tr><tr><td>Micro-dissecting forceps 4&amp;rdquo; slightly curved 0.8</td><td>Roboz Company</td><td>RS-5135</td><td>Tool used to separate cortices.</td></tr><tr><td>Micro-dissecting tweezers</td><td>Roboz Company</td><td>RS-4972</td><td>Peels brain meninges.</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Important for removing the meninge from the cortices.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DMEM Preparation - step 2&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>GibCo. Company</td><td>11995-065</td><td>Supports the growth of cells.</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S7277</td><td>Supplement for the cell culture media.</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>GibCo. Company</td><td>10437-010</td><td>Serum-supplement for the cell culture.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>GibCo. Company</td><td>15140-148</td><td>Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.</td></tr><tr><td>Filter System 1L with 0.22um pore</td><td>Corning</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Astrocyte culture - step 3&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serological pipets 5mL</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>To pipette DMEM to containers with cells.</td></tr><tr><td>Serological pipets 10mL</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>To pipette DMEM to containers with cells.</td></tr><tr><td>Serological pipets 25mL</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td>To pipette DMEM to containers with cells.</td></tr><tr><td>Centrifuge conical tube 15mL</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200250</td><td></td></tr><tr><td>Safe-lock tube 1.5mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>Barrier Tips 200 uL</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-201725</td><td></td></tr><tr><td>Barrier Tips 1 mL</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-201727</td><td></td></tr><tr><td>Biohazard Orange Bag 14 x 19&quot;</td><td>VWR</td><td>14220-048</td><td></td></tr><tr><td>60mm petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Sterile gauze pads</td><td>Honeywell Safety</td><td>89133-086</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Biomaster</td><td>Sewar Lab System</td><td>030010019</td><td>Triturate the brain tissue.</td></tr><tr><td>Stomacher 80 Blender Sterile Bags</td><td>Sewar Lab System</td><td>BA6040</td><td>Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.</td></tr><tr><td>Beaker 400mL</td><td>Pyrex</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cell dissociation sieve, mesh #60&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S1020</td><td>To obtain a uniform single cell suspension.</td></tr><tr><td>Sterile cell dissociation sieve, mesh #100</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S3895</td><td>To obtain a uniform single cell suspension.</td></tr><tr><td>Invert phase microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclypse Ti-S</td><td>Verify cells for contamination or abnormal cell growth.</td></tr><tr><td>75cm2 sterile flasks</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Multi-well plate</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round</td><td>VWR</td><td>48380-046</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line hemacytometer</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>L1002</td><td>Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.</td></tr><tr><td>Cytosine &amp;beta;-D-arabinofuranoside (Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>GibCo. Company</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (PBS) tablets</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Water</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;OGD Medium Preparation - step 5&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge conical tube 50 mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium-free glucose</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>D5030</td><td>Supports the growth of cells.</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S7277</td><td>Supplement for the cell culture media.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>GibCo. Company</td><td>15140-148</td><td>Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.</td></tr><tr><td>200mM&amp;nbsp; L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>GibCo. Company</td><td>25030-081</td><td>Amino acid that supplements the growth of cells.</td></tr><tr><td>Phospahet buffer saline (PBS) tablets</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>Filter System 50mL with 0.22um pore</td><td>Corning</td><td>430320</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge conical tube 50 mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Single Flow Meter&amp;nbsp;</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>SMF3001</td><td>Measure gas flow in oxygen purge.</td></tr><tr><td>Hypoxia Incubator Chamber&amp;nbsp;</td><td>StemCell</td><td>27310</td><td>Generates a hypoxic environment for the cell culture.</td></tr><tr><td>Traceable Dissolved Oxygen Meter</td><td>VWR</td><td>21800-022</td><td></td></tr><tr><td>95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture</td><td>Linde</td><td></td><td>Purges the environment of oxygen.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;primary astrocyte immunofluorescence - step 6&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (PBS) tablets</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>Formaline Solution Neutral Buffer 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>Solution used to fix cells.</td></tr><tr><td>Methanol&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>A4544</td><td>Solution used to fix cells.</td></tr><tr><td>Non-ionic surfactant (Triton X-100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>GibCo. Company</td><td>10437-010</td><td>Serum-supplement for the cell culture.</td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Cell Signaling</td><td>24307</td><td>Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.</td></tr><tr><td>Anti-PCNA</td><td>Cell Signaling</td><td>2586</td><td>Detects proliferating cells.</td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>P4170</td><td>Apoptosis staining.</td></tr><tr><td>Anti-Olig1</td><td>Abcam</td><td>AB68105</td><td>Detects mature oligodendrocytes.</td></tr><tr><td>Anti-Iba1+</td><td>Wako</td><td>016-20001</td><td>Detects microglial cells.</td></tr><tr><td>Anti-GFAP Conjugated with Cy3&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>C9205</td><td>Detects reactive astrocytes in the treated cells.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probe Life Technology</td><td>A1101</td><td>Anti-Mouse Secondary Antibody.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555</td><td>Molecular Probe Life Technology</td><td>A21428</td><td>Anti-Rabbit Secondary Antibody.</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6&amp;rsquo;-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>D9542</td><td>Nuclear staining.</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring astrocyte reactivity and proliferation in vitro under ischemic-like conditions

허 혈 성 뇌졸중은 혈전 또는 두뇌의 부분에 혈액 흐름을 방해 하는 embolus로 인 한 복잡 한 뇌 손상. 이것은 산소와 포도 당, 에너지 실패 원인과 신경 죽음의 부족. 허 혈 성 뇌졸중 모욕 후 이다 반응 되 고 그것은 개발로 부상 사이트 격 증. 이 시나리오에서는 허 혈에 노출 된 뇌 영역에 이다의 구체적인 기여를 공부 하기 어렵습니다. 따라서,이 문서의 기본 사이토 반응성 산소 포도 당 부족 (지도부) 라는 허 혈 같은 환경의 체 외에 모델 확산을 공부 하는 방법을 소개 합니다. 이다 1-4 일에서 고립 되었다-오래 된 신생아 쥐와 일반적인 astrocytic 셀 수 사이토 선택 마커 폐해 Fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 및 핵 얼룩을 사용 하 여 평가 했다. 기간 이다 지도부 조건에 복종 된다 수 사용자 지정할 수, 그들은에 노출 되는 산소의 백분율 뿐만 아니라. 이 유연성 과학자를 셀 체 외의 다른 그룹에서 허 혈 성 같은 상태 기간 특성을 수 있습니다. 이 문서에서는 사이토 반응성, hypertrophic 형태학 및 확산 증식 세포 핵 항 원 (PCNA)를 사용 하 여 면역 형광 검사로 측정 된 유도 지도부의 시간대를 설명 합니다. 확산, 게다가 이다 에너지와 산화 스트레스를 받게 하 고 응답 지도부 셀 중간에 녹는 요소를 해제 하 여. 이 매체는 수집 고 분자 이다 세포 세포 상호 작용 없이 기본 신경 문화에 의해 발표의 효과 분석 하는 데 사용 될 수 있습니다. 요약 하자면,이 1 차 셀 문화 모델 부상 시 절연된 이다의 역할을 이해 하 효율적으로 사용할 수 있습니다.

기본 astrocytic 문화의 주요 관심사 중 하나는 뉴런, oligodendrocytes, 섬유 아 세포, microglia 등 다른 세포의 존재 이다. 그림 1에서 쥐 외피가에서 고립 된 셀 미디어 변경 3 일 마다 졌고 중 치료 또는 치료와 함께 추가 LME 1 h. 24 시간 후에, 세포에 GFAP immunostained 되었고 DAPI와 counterstained. LME 치료 셀 8% 보여주었다 동안 치료 셀 긍정적인 세포 GFAP-39% 비의 평균을 보였다. 이러한 결과 LME 치료 및 미디어 변경 어떻게 효과적으로 감소 비 GFAP 긍정적인 세포 4.75 배, 농축 사이토 문화를 생산 하 여 보여 줍니다. 만약 1 시간 또는 6 h 지도부에 영향을 미치는 사이토 생존이이 방법론 후를 확인 하려면 그림 2 사이토 문화, 모욕 후 24 h의 MTT 분석 결과를 보여준다. 생존 능력에 큰 차이 두 번 사용할 수 있는 사이토 반응성 연구를 보여주는 어떤 상태에서 발견 되었다. 세포 증식 이다에서 지도부에 의해 실행 하는 효과 중 하나입니다. 증식 세포 핵 항 원 (PCNA) 그림 3 에서 normoxic 셀에 10%에서 1 h 지도부, 예상 vivo에서 astrocytic 응답15을 보여주는 후 30% 증가. 마지막으로, 이다 24 h normoxic 조건 다음 지도부의 6 h에 노출 되었다. 이 시간 후, GFAP에 대 한 면역 형광 검사 수행 되었다. 지도부에 노출 된 세포 이다 normoxic 조건 하에서 비교 되었다. 지도부 없이 이다 지도부를 받았다 셀 명확 하 게 제시 무효 이다 (그림 4B)의 특성 비 대 동안 전통적인 방사상 형태 (그림 4A)를 표시 합니다. 이 비 대뇌 피 질의 쥐 이다 normoxic와 지도부 조건 (그림 5)에서 해당 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 이미지에 구상 될 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55108/55108fig1.jpg"> 
그림 1 . GFAP와 DAPI 기본 대뇌 피 질의 쥐 이다 문화 순도 확인 하기 위해 면역 형광 검사. (A) 왼쪽된 패널 나타냅니다 GFAP 긍정적인 세포 (적색), 중간 패널 핵 (DAPI, 블루), 고 오른쪽 패널의 LME 치료 비 (위) 및 LME 처리 (낮은) 병합 된 이미지 셀. 흰색 화살표 표시 GFAP 양수가 아닌 셀 스테인드. LME에 비 LME 비 GFAP 긍정적인 핵의 부 량 (B) 세포 치료. 짝이 없는 t-검정을 수행 되었다 (p &#60; 0.0001) 오차 막대는 평균 SEM. 규모 바 대표 50 미크론으로 및 사진 20 x 배율에서 찍은. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55108/55108fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55108/55108fig2.jpg"> 
그림 2 . 생존 분석 결과의 지도부에 24 시간 노출 이다. 이다 96 잘 접시에 배양 되었고, normoxic, 1 h 지도부, 또는 6 h 지도부 조건에 노출. 치료 후, 셀 24 h에 대 한 normoxic 미디어에 추가 하 고 생존 MTT 분석 결과 사용 하 여 측정 했다. 570 nm 쇼 문화에 비교 될 때 지도부 노출 셀의 세포 생존 능력 normoxic 조건에서 세포에서 흡수도. 데이터 일방통행 ANOVA로 분석 되었다 (p = 0.9669) SEM.와 의미를 나타내는 오차 막대 표시 <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55108/55108fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55108/55108fig3.jpg"> 
그림 3. 쥐 이다에서 확산 시 산소와 포도 당 부족에 노출 증가 및 PCNA 마커로 사용 하 여 검색할 수 있습니다. (A) 왼쪽된 패널 PCNA 긍정적인 세포 (녹색), 중간 패널 표시 핵 (DAPI, 파랑), 그리고 오른쪽 패널 normoxic 세포 (위 패널)의 병합 된 이미지를 보여줍니다 나타내고 1 h 지도부 치료 세포 (낮은 패널). (B) % 지도부 대 normoxic에서 PCNA 긍정적인 세포의 세포 치료. 짝이 없는-테스트 수행 되었다 (p &#60; 0.0001) 오차 막대는 평균 SEM. 규모 바 대표 50 미크론으로 및 사진 20 x 배율에서 찍은. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55108/55108fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55108/55108fig4.jpg"> 
그림 4 . 기본 쥐 대뇌 피 질의 사이토 문화에서 Cy3 함께 활용 하는 식의 폐해 Fibrillary 산 성 단백질 (GFAP). Normoxic 환경 표시 특성 방사상 형태에서에서 (A) 이다. 중간 필 라 멘 트 단백질, GFAP, 셀 시체를 채우고 고 얇은 세포질 과정에 확장 합니다. (B) 후 6 h 지도부의 노출 이다 hypertrophic 형태를 채택 했다. 비늘 20 미크론 나타내고 confocal 현미경에서 40 x 확대 사진을 찍은. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55108/55108fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55108/55108fig5.jpg"> 
그림 5 . Normoxic과 산소-포도 당 부족에서 대뇌 피 질의 쥐 이다. 이다 normoxic 조건 (위 왼쪽된 패널) 또는 6 h 지도부 (하단 왼쪽된 패널)의 면역 형광 GFAP에 대하여 Cy3 활용 된 항 체를 사용 하 여 스테인드. 해당 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 이미지는 오른쪽 패널에 표시 됩니다. 눈금 막대 20 미크론 나타내고 그림 20 배 확대 촬영 했다. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55108/55108fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>목적</td>
			<td>항 체/마커</td>
			<td>설명</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">사이토 문화 유효성 검사</td>
			<td>Iba 1</td>
			<td>Microglial 세포를 감지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN</td>
			<td>성숙한 뉴런 식별</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig1</td>
			<td>성숙한 oligodendrocytes를 감지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2 NG2</td>
			<td>Oligodendrocyte 선구자 세포를 감지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GalC</td>
			<td>미 숙 또는 성숙한 oligodendrocytes 식별</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>확산</td>
			<td>PCNA</td>
			<td>바인딩 p36 단백질, 세포 증식의 높은 수준에서 표현</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">세포 생존 능력</td>
			<td>Propidium 요오드 화물 (PI)</td>
			<td>DNA에 묶는,이 표식이 나타냅니다 세포 생존 능력의 부족</td>
		</tr></tbody></table>tr ><tr>
			<td>MTT</td>
			<td>측정 미토 콘 드리 아 기능</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>반응</td>
			<td>GFAP</td>
			<td>사이토 반응성의 지시자</td>
		</tr>
	

표 1입니다. 세포와 세포질 과정의 다양 한 종류를 얼룩 사용 시 약 목록

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Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

허 혈 성 뇌졸중 공부 하기 어려운 어떤 영향을 받는 뇌 영역에 이다의 구체적인 기여 산소 포도 당 부족 (지도부)에 노출 하는 복잡 한 이벤트입니다. 이 문서는 고립 된 이다 그들의 반응성 및 확산 지도부 조건 하에서 연구 하는 방법론을 소개 합니다.

사이토 반응성 및 확산에서 체 외에 허 혈 성 같은 조건 모니터링

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

monitoring-astrocyte-reactivity-proliferation-vitro-under-ischemic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

9.8K 조회수.  Universidad Central del Caribe. 허 혈 성 뇌졸중 공부 하기 어려운 어떤 영향을 받는 뇌 영역에 이다의 구체적인 기여 산소 포도 당 부족 (지도부)에 노출 하는 복잡 한 이벤트입니다. 이 문서는 고립 된 이다 그들의 반응성 및 확산 지도부 조건 하에서 연구 하는 방법론을 소개 합니다.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

마우스 두피 Astrocytes의 분리와 문화

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

신경과학

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

생체공학

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies indicate that the severity of brain injury appear to be sex dependent, and that the male neonates are more susceptible to the effects of HI-related brain injury, resulting in more severe neurological outcomes as compared to females with comparable brain injuries. The development of reliable methods to isolate and maintain highly enriched populations of sexed hippocampal astrocytes is essential to understand the cellular basis of sex differences in the pathological consequences of neonatal HI. In this study, we describe a method for creating sex specific hippocampal astrocyte cultures that are subjected to a model of in-vitro ischemia, oxygen-glucose deprivation, followed by reoxygenation. Subsequent reactive astrogliosis was examined by immunostaining for the Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and S100B. This method provides a useful tool to study the role of male and female hippocampal astrocytes following neonatal HI, separately.

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrocytes are one of the most important key players in the central nervous system (CNS). Here, we are reporting a practical method of sexed hippocampal astrocyte culture protocol in order to study the mechanisms underlying the astrocyte function in male and female neonate pups after in-vitro ischemia.

마우스 해마 성상에서 섹스 차이점 후<em&gt; 인 체외</em&gt; 허혈

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

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The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 In vitro 시험 법

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

의학

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

이혈증에서 신경 신경-Glia 상호 작용의 역할을 공부 하기 위한 세포 배양 모델

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

쥐 성상 세포와 미세 아교 세포의 1 차 배양과 근 위축성 측삭 경화증 연구에서의 사용

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through multipotent intermediates. This technique not only holds great promises in the field of disease modeling, as it allows to convert, for example, fibroblasts for patients suffering neurodegenerative diseases into neurons, but also represents a promising alternative for cell-based replacement therapies. In this context, a major scientific breakthrough was the demonstration that differentiated non-neural cells within the central nervous system, such as astrocytes, could be converted into functional neurons in vitro. Since then, in vitro direct reprogramming of astrocytes into neurons has provided substantial insights into the molecular mechanisms underlying forced identity conversion and the hurdles that prevent efficient reprogramming. However, results from in vitro&#160;experiments performed in different labs are difficult to compare due to differences in the methods used to isolate, culture, and reprogram astrocytes. Here, we describe a detailed protocol to reliably isolate and culture astrocytes with high purity from different regions of the central nervous system of mice at postnatal ages via magnetic cell sorting. Furthermore, we provide protocols to reprogram cultured astrocytes into neurons via viral transduction or DNA transfection. This streamlined and standardized protocol can be used to investigate the molecular mechanisms underlying cell identity maintenance, the establishment of a new neuronal identity, as well as the generation of specific neuronal subtypes and their functional properties.

Here we describe a detailed protocol to generate highly enriched cultures of astrocytes derived from different regions of the central nervous system of postnatal mice and their direct conversion into functional neurons by the forced expression of transcription factors.

마우스 성상세포의 분리 및 직접 뉴런 리프로그래밍

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...