Name: isolation and culture of mouse cortical astrocytes
Uploaded: 2013-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
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SS, 킬로바이트 및 유럽위원회 (European Commission) FP7 부여 PIRG08-GA-2010-276989, NEUREX에 교육과 연구의 연방 교육부 (BMBF 01 EO 0803), 및 / 독일 연구 재단 기금 SCHA 1442에 Fazit 재단 대학원 친목에 의해 지원 CS에 3-1 저자는 충돌 재정 이익이 없습니다.

1. 혼합 두피 세포의 분리 및 도금 astrocyte 문화를 혼합 대뇌 피질의 세포 고립 P4 마우스 새끼로 P1을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 적절한 astrocyte 밀도를 달성하기 위해이 T75 조직 배양 플라스크에 4 마우스 새끼 cortices를 사용 할 필요가 있습니다. 따라서, 다음과 같은 프로토콜의 볼륨은 4 마우스 새끼를 사용하여 셀 준비를 위해 계산됩니다. <ol><li> 분해 절차를 시작하기 전에, astrocyte 문화 미디어 prewarm 30 ML (DMEM, 고 포도당 + 10 %의 열 inactivated 태아 소 혈청 + 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신, 표 참조) 37 ° C. 37 번 1 시간을위한 세포 배양 등급 물에서 50 μg / ML의 농도 ° CO 2 인큐베이터에서 C의 폴리-D-리신 (PDL)의 20 ML과 문장 한 T75 플라스크입니다. </li><li> 분해 절차에 대해 필요한 모든 시약 및 재료를 준비합니다. 당신이 필요합니다 : 수술 가위, 부드러운 고급 포셉, 평면 팁 포셉, 종이 수건, 폐기물 가방, 70 % 에탄올을얼음에 D이 해부 요리 (3.5 cm 직경은) 2 ML의 HBSS 각이 가득. </li><li> 부드럽게 유지하고 70 %의 에탄올과 새끼 쥐의 머리와 목을 스프레이. 동물은 가위를 사용하여 목 베기에 의해 희생된다. </li><li> 두개골을 표시하는 방법으로 두피를 따라 앞쪽으로 뒤쪽 중간 선 절개를, 수행합니다. </li><li> 목에서 코주의 깊게 두개골을 잘라 요. 두 개의 추가 삭감은 뇌에 더 액세스 할 수 있도록 수행됩니다 : 첫 번째 컷은 후각 전구, 두개골 바닥에서 두개골을 분리 할 수​​있는 소뇌의 하부 다른 하나의 앞쪽에 구성되어 있습니다. </li><li> 평면 팁 집게를 사용하여 두개의 날개가 부드럽게 옆에 이성을 상실하고 뇌는 HBSS로 가득 첫 해부 접시에 제거하고 배치됩니다. 얼음에 다시 접시를 놓고 모든 4 뇌를 수확 계속 진행합니다. </li><li> 분해 절차의 나머지 부분은 stereomicroscope에서 수행됩니다. 첫째, 후각 전구와 소뇌는 고급을 사용하여 제거해부 포셉 (그림 1B). </li><li> , cortices을 검색 고급 집게와 뇌의 뒤쪽 끝을 잡아하기 위해, 반구 사이의 중간 선 절개을 수행 생성 된 숲에 포셉의 두 번째 세트를 삽입하고 벗겨 버릴에서 피질의 판과 같은 구조 뇌. </li><li> 조심스럽게 고급 집게 (그림 1D &#39;)로 당겨 피질의 뇌에서 meninges를 해부. 이 단계는 수막 세포와 섬유 아세포에 의한 최종 astrocyte 문화의 오염을 방지합니다. HBSS로 가득 두 번째 접시에 준비한 피질의 뇌를 전송하고 얼음으로 그것을 반환합니다. 모든 4 cortices에 따라 계속합니다. </li><li> 마지막으로, 날카로운 블레이드를 (약 4 8 배)를 사용하여 작은 조각으로 각 피질 반구를 잘라. </li><li> 무균 조건 하에서, 전송 피질하다 50 ML 팔콘 튜브에 조각과 22.5 ML의 총 볼륨에 HBSS를 추가합니다. </li><li> 2.5 %의 트립신, 혼합 2.5 ML를 추가하고 품다37 번 물 목욕의 조직 ° C 30 분에. 매 10 분을 흔들어 가끔하여 섞는다. </li><li> 펠렛 피질 조직 조각 300 XG에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 decantation에 의해 표면에 뜨는 제거합니다. 조직 펠렛을 잃지 않도록하기 위해 당신은 기계적으로는 pipet을 사용하여 유지 될 수 있습니다. 조직 조각이 하나의 세포 (20-30 회)에 dissociated 때까지 10 ML 플라스틱 피펫을 사용하여 10 ML astrocyte 도금 매체와 적극적으로 pipetting을 추가하여 단​​일 세포 현탁액으로 조직을 떼어 놓다. astrocyte 도금 매체를 사용하여 20 ML에 볼륨을 조정합니다. 당신은 hematocytometer를 사용하여 계산하여 단일 세포로 증명 피질 조직의 분리를 할 수 있습니다. 4 마우스 새끼 cortices 중 하나 준비 10-15 X10 6 dissociated 하나의 세포를 얻을 수 있습니다. </li><li> T75 문화 플라스크에서 PDL를 대기음, 판 37 번 dissociated 단일 세포 현탁액 및 배양 ° CO 2 인큐베이터에서 C. </li></ol> 2. Enr 구하기iched Astrocyte 문화 <ol><li> 이후 혼합 대뇌 피질의 세포 및 모든 3 일 도금 후 매체 2 일 변경합니다. </li><li> astrocytes가 합류하고 오버레이 microglia하는 astrocyte 레이어에 노출 앉거나 이미 astrocyte 레이어 (그림 2)에서 떨어 뜨려 7~8일, 후, microglia를 제거 할 수 궤도 셰이커 30 분 동안 180 rpm으로 T75 플라스크를 흔들. 표면에 뜨는 포함 microglia를 삭제 하시겠습니까이나 문화에 희망과 microglia를 검토하는 경우를 스핀 다운과 문화 28,29위한 판. </li><li> 20 ML 신선한 astrocyte 문화 매체를 추가하고 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPC)를 제거하기 위해 6 시간에 240 rpm으로 술병을 흔들어하여 계속 진행합니다. 일부 OPCs 완전히 astrocyte 레이어에서 분리되지 않습니다 때문에, OPC 오염을 방지하기 위해 1 분에 손으로 힘차게 흔들하고 있습니다. 표면에 뜨는을 취소하거나 문화에 OPCs 29 원하는 경우, 내려와 플레이트 스핀. </li><li> 나머지 conflue을 씻어PBS로 두 번 NT astrocyte 층은, 37의 CO 2 인큐베이터에서 5 ML 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 배양을 추가 ° C., PBS를 대기음 astrocytes의 분리마다 5 분을 확인하고 손 (2-3 번)의 손바닥에 대해 플라스크를 클릭하여 astrocytes의 부대를 시행합니다. </li><li> astrocytes는 문화 플라스크에서 분리 된 후, astrocyte 문화 매체, 5 분 180 XG에서 스핀 세포의 5 ML을 추가 표면에 뜨는을 대기음 40 ML 신선한 astrocyte 도금 매체를 추가 할 수 있습니다. 한 T75 조직 배양 플라스크는 첫 번째 셀 분할 후 6 1x10 주변의 세포를 얻을 수 있습니다. 37 두 개의 T75 문화 플라스크 및 배양에 판 세포 ° CO 2 인큐베이터에서 C. 모든 2~3일 매체를 변경합니다. </li><li> 첫 번째 분할 astrocytes 후 12-14일는 실험을 수행하기 전에 해당 셀 농도 24-48 시간에 도금되어 있습니다. 한 T75 조직 배양 플라스크는 두 번째 셀 분할 후 1.5-2 주변 X10 6 세포를 얻을 수 있습니다. </li></ol>

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여기에 설명 된 방법은 원래 1980 27 맥카시와 드 Vellis에 의해 설명 쥐 신생아 뇌에서 astrocyte 문화 준비에 기반을두고 있습니다. 출생 후의 P1에서 P4 마우스 뇌 피질 astrocytes의 고립과 문화의 수정 방법은 여기에 제시된 것은 수율 순수 기본 astrocytes 빠르고 높은 재현합니다. 이 기술은 쉽게 이러한 쥐 또는 돼지에서와 같은 척수와 같은 다른 뇌 영역에서 같은 다른 종에서 astrocytes을 분리 양도 할 수 있습니다. 맥카시와 deVellis 방법에 의한 신생아 뇌에서 astrocyte 전구 세포 절연이 높은 proliferative 세포를 생성하는 반면, 세포 증식 및 출생 후의 P1-P4 마우스 새끼의 분리 astrocytes의 전파가 제한됩니다. 분할 astrocytes 한 번 체외 7 일에 (DIV), 그들이 성장 후 confluency과 성숙. 생체에서 대부분의 astrocyte 확산 P14 32로 크게 완료된 것입니다. 그다시, 우리는 격리 astrocytes의 성숙 표현형을 보장하기 위해 일 21-28 DIV (그림 2 층)에서 실험 astrocytes을 사용하는 것이 좋습니다. astrocyte 문화를 분아 따위에 의해 번식 할 수있는 고유 구속으로 인해 이상 3 회를 splitted하지 말아야합니다. 설명 격리 방법에 중요한 단계 cortices의 소화 및 단일 세포 현탁액을 얻기위한 소화 조직의 다음과 같은 분쇄 있습니다. 따라서 20-30 배의 뇌 피질 조직의 분쇄 한 후 하나의 세포 현탁액을 얻기 위해 트립신 농도와 소화 시간을 최적화 할 필요가 있습니다. 최소화하기 위해 대안 트립신은 aliquoted해야하며 냉동 해동 사이클은 피해야합니다. 설명 절차는 PDL-코팅 문화 플라스크, astrocytes의 바인딩을 보장하고 며칠 도금 후 합류 astrocyte 층을 촉진에 혼합 대뇌 피질의 세포를 도금에 의존하고 있습니다. PDL - 코팅 astrocyte m에 필요한 아니지만microglia과 oligodendrocytes으로부터 분리 한 후 aintenance,이 같은 immunofluorescene 얼룩 같은 특정 하류 응용 프로그램을 수행 할 수 있습니다. 첫 번째 셀 분할의 좋은 타이밍은 세포 무결성 및 수율 것이 중요합니다. 그들은 confluency에 도달 넘어 astrocytes을 배양하는 경우, 당신은 첫 번째 셀 분할 동안 부족 분리에 의한 세포의 대부분을 잃을 수 있습니다. 이것은 부정적인 세포 무결성에 영향을 미칩니다 트립신과 광범위한 배양 한 이후, 분리에 대한 시간을 증가하여 극복 할 수 없습니다. 반면, 너무보고 싶고 대뇌 피질의 세포 현탁액을 도금 않는 것이 합류 astrocyte 세포 층의 부족 형성하게됩니다. astrocytes이 합류하고 microglia 세포가 astrocyte 층의 최상위 위치에 앉아 때 첫 번째 셀 분할을위한 가장 좋은 시간은, 혼합 대뇌 피질 세포의 도금 후 7-8일에 있습니다. 설명 대뇌 피질의 세포 배양에 astrocytes은 (세포 이질성을 보여 &lt;STRONG&gt; 그림 3)는 생체 33,34에 astrocytes에 대해 설명되어 있습니다. 그러나, 다양한 astrocyte 형태 및 기능을 정의하는 것은 잠재적으로 이기종 astrocyte 하위 유형을 식별하고 구별 할 마커의 제한된 수의 방해했습니다. 성숙 섬유와 반응 astrocytes의 잘 특징 아이콘이 GFAP입니다. 그러나, GFAP는 거의 모든 astrocytes의 마커로 사용을 제한 성숙 원형질의 astrocytes에 의해 표현되며 또한 무대 특정 마커로서 사용을 제한, 개발 중에 있으며 성인에서 B 세포 RG 세포에 의해 표현된다. GLAST, ALDH1L1 또는 BLBP 포함 astrocytes, 다른 마커도 미숙 astrocytes에 의해 표현됩니다, 따라서 독점적으로 성숙 astrocytes을 표시하지 않습니다. 마지막으로, 이러한 GFAP, Aquaporin-4, 및 S100B 등의 성숙 astrocyte 표시 (그림 3)은 출생 후의 성숙하는 동안 점점 업 규정입니다. 손에서, 대서양 표준시4 주 나이에 rocyte 문화는 생체 내 성숙 astrocytes의 특징을 갖추고 있습니다. 주요 astrocyte 문화를 사용 우리는 혈액 태어난 단백질 피브리노겐이 astrocyte 활성화 17 유도 방법을 분자 메커니즘을 식별 할 수 있습니다. 우리의 연구는 피브리노겐은 잠재 된 TGF-β의 항공사입니다 밝혔다. 활성 TGF-β 형성과 astrocytes 17,26의 TGF-β/Smad 신호 경로의 활성화로 연결되었습니다 피브리노겐과 기본 astrocytes의 치료. 이 결과는 생체에서 피브리노겐 주사를 사용하여 확인되었습니다. 또한, astrocytes는 astrocyte이 설치된 매체를 수확 및 다른 세포 유형이 설치된 매체에 적용하여 분석 할 수 있습니다 물질의 분비에 의해 다른 세포 유형을 제어합니다. 우리는 이전에 neurite 가지에 영향을 미치는 방법을 설치된 중간 피브리노겐 - 처리 astrocytes의 기능 분석에 분석 할 수 astrocyte이 설치된 매체를 사용했습니다. 반응 astrocytes Express 및 분비neurite 가지 16 억제 CSPG 가족의 단백질. 피브리노겐 - 처리 astrocytes에서 실제로 설치된 매체는 크게 neurite 길이와 neurite 가지 17 보여주는 세포의 비율을 모두 감소. 다양한 응용 프로그램에서의 관리는 크게 생체에서의 조사를 완료 할 수 있기 때문에이 프로토콜에 설명 된 대뇌 피질의 astrocytes의 격리와 문화, astrocyte 생물을 조사하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 그러나, 얻은 astrocytes는 체외에서 배양하고 많은 astrocyte 특성을 반영하면서, 그들은 또한 생체 astrocytes에 다를 것으로 염두에 보관해야합니다. 따라서, 35 또는 항체 기반 FACS 절연 36 immunopanning하여 직접 선택과 astrocytes의 고립의 다른 방법은 더 astrocytes의 기본적인 속성을 조사 할 수있는 새로운 수단을 나타냅니다.

Astrocytes는 중추 신경계 (CNS)의 매우 풍부한 세포 유형입니다. 인간의 대뇌 피질 1 뉴런 당 1.4 astrocytes가 반면 뉴런에 astrocytes의 비율은, 쥐와 쥐의 대뇌 피질에 1시 3분입니다. astrocyte 기능에 대한 관심은 최근 몇 년 동안 크게 증가했다. astrocytes의 주요 기능은 뉴런 2,3에 구조와 신진 대사 지원을 제공하는 역할입니다. astrocytes에 새로 발견 된 역할은 기능의 폭 넓은 스펙트럼을 커버. 이러한 개발 4-6 동안 개발 axons과 특정 neuroblasts의 마이그레이션 가이드, 신경 전달의 기능, 신경 회로 7-9으로 시냅스의 강도와 정보 처리, 혈액 - 뇌 장벽의 역할 (BBB)이 형성 10 무결성 11-13을 포함 뇌 혈관 톤 (14)과 규제. astrocytes의 또 다른 주요 기능은 부상에 대한 그들의 반응이다. 병적 인 조건 astrocyt 아래에스 반응이되고 더 중간 필라멘트 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)와 억제 세포 외 기질 (ECM) 단백질 15,16의 표현을 upregulate. 반응 astrocytes은 콘드로이틴 황산 proteoglycan (CSPG) 가족의 astrocyte 분비 ECM 단백질의 주요 구성 glial 흉터를 형성하여 건강한 조직에서 부상 사이트를 한계를 정하다, 그 주요 요인은 CNS 손상 15-17 후 axonal 재생을 억제. Astrocytes 늦게 embryogenesis과 이른 출생 후의 생활 동안 레이디 얼 glial (RG) 세포에서 발생. astrocyte 사양가 발생했습니다 후 astrocyte 전구체는 최종 위치로 이전, 그들이 터미널 차별화의 과정을 어디서부터 시작. 생체에서 astrocytes는 전형적인 형태 18,19로 표시로 3-4주 출생 후 성인 것 같습니다. RG 세포의 subpopulation은 subventricular 영역 astrocytes (타입 B 세포)로 변환합니다. Both, RG 입력합니다 B 세포는 각각 개발 중에 있으며 성인의 astrocyte 같은 신경 줄기 세포 (NSCs)로 기능을 수행합니다. astrocytes, RG 입력합니다 B 세포와 마찬가지로 또한이 마커가 독점적으로 특별히 성인 astrocytes 라벨을 사용할 수 없습니다 나타냅니다 astrocyte 특정 glutamate의 전송 (GLAST), 뇌 지질 결합 단백질 (BLBP) 및 GFAP를 표현한다. 건강한 뇌, RG 및 자기 갱신에 대한 용량과 같은 타입 B 세포 전시 줄기 세포의 잠재력에 나누어하지 않는 성인 parenchymal astrocytes에 대비합니다. astrocytes의 Dysregulation는 알츠하이머 병 20,21, 헌팅턴 병 22, 파킨슨 병 23, Rett 증후군 24 알렉산더 병 25를 포함하여 많은 pathologies에 연루되었습니다. 또한, astrocytes는 astrocyte 활성화 및 astrocytic glial 흉터 형성 16,26로 이어지는, CNS의 모든 모욕에 반응. 다음 뇌 TR을 형성 astrocytic glial 흉터auma 또는 척수의 부상은 neuronal 재생 15을 방지하는 소수의 장벽이 될 것으로 생각됩니다. 세포의 정화 인구를 분리하고 유지하기 위해 신뢰할 수있는 방법의 개발은 신경​​계에 대한 우리의 이해에 필수적이었습니다. 맥카시와 드 Vellis의 개척 작업은 신생아 쥐 조직 27 일부터 astrocytes의 거의 순수한 문화를 준비하는 날짜로 조사 할 수 있습니다. 대부분 마우스 대뇌 피질의 astrocytes를 격리시킨 것에 대한 약간 수정 형태로 여기에 제공됩니다이 방법을 사용 astrocyte 생물학에 대해 알게되었습니다. 생체 연구, astrocytes뿐만 아니라 설치된 매체가 얻은 체외 문화에 설명을 사용하여 보완, 추가 astrocyte 함수로 정보를 얻으려면 유용한 도구입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 작업 솔루션의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Astrocyte 문화 미디어 </td></tr><tr><td> DMEM, 높은 혈당 </td><td> 생명 기술 </td><td> 31966-021 </td><td></td></tr><tr><td> 열 inactivated FBS, </td><td> 생명 기술 </td><td> 10082-1​​47 </td><td> 최종 농도 : 10 % </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> 생명 기술 </td><td> 15140-122 </td><td> 최종 농도 : 1 % </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 뇌 세포 발굴을위한 솔루션estion </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> 생명 기술 </td><td> 14170-088 </td><td></td></tr><tr><td> 2.5 %의 트립신 </td><td> 생명 기술 </td><td> 15090-046 </td><td> 최종 농도 : 0.25 % </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 다른 </td></tr><tr><td> 70 % (권 / 권) 에탄올 </td><td> 로스 </td><td> 9065.2 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리-D-라이신 </td><td> Millipore </td><td> A-003-E </td><td> 50 μg / ML </td></tr><tr><td> 물 </td><td> PAA </td><td> S15-012 </td><td> 세포 배양 등급 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> 세포 배양 등급 </td></tr><tr><td> 0.05 %가보세요psin-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 생명 기술 </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> 0.45 μm 무균 필터 </td><td> Sartorius </td><td> 16,555 </td><td></td></tr><tr><td> 3.5 cm 페트리 접시 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 팔콘 튜브 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML 팔콘 튜브 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 75cm 두 조직 문화 플라스크 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 353136 </td><td></td></tr><tr><td> 집게, 괜찮아 </td><td> 뒤몽 </td><td> 2-1032, 2-1033 </td><td> # 3C, # 5 </td></tr><tr><td> 집게, 평면 팁 </td><td> KLS 마틴 </td><td> 12-120-11 </td><td></td></tr><tr><td> 13cm 외과 가위 </td><td> Aesculap </td><td> BC-140-R </td><td></td></tr><tr><td> Stereomicroscope </td><td> Leica </td><td></td><td> MZ7.5 </td></tr><tr><td> Stereomicroscope + 카메라 </td><td> Leica </td><td></td><td> MZ16F, DFC320 </td></tr><tr><td> 현미경 + 카메라 </td><td> Zeiss, 캐논 </td><td></td><td> 프리모 초록, 파워의 A650입니다 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 5805000.017 </td><td> Centrifuge5804R </td></tr><tr><td> 궤도 쉐이커 </td><td> 열 과학 </td><td> SHKE 4450 - 1CE </td><td> MaxQ 4450 </td></tr><tr><td> 열탕 목욕 </td><td> Julabo </td><td></td><td> 에스W20, 37 ° C </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of mouse cortical astrocytes

Astrocytes는 포유류의 뇌에 풍부한 세포 유형입니다, 아직 많은 자신의 분자와 기능 특성에 대해 학습 할 수 남아 있습니다. 체외 astrocyte 세포 배양 시스템에 자세히 이러한 glial 세포의 생물학적 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜은 마우스 새끼의 혼합 대뇌 피질 세포의 절연 및 문화 순수한 astrocytes를 얻는 방법을 보여줍니다. 방법은 가능한 뉴런의 부재와 astrocytes, oligodendrocytes 및 microglia, 문화의 중추 신경 시스템의 세 가지 주요 glial 세포 인구의 분리에 기반을두고 있습니다. 문화의 첫 번째 일 동안 대표 이미지가 혼합 셀 인구의 존재를 입증하고 astrocytes가 합류되고 microglia 및 oligodendrocytes에서 분리해야 할 때, timepoint을 나타냅니다. 또한, 우리는 순결하고 잘 설립을위한 immunocytochemical stainings를 사용하여 양식 astrocytes의 astrocytic 형태를 보여와새로 astrocyte 마커를 설명했다. 이 문화 시스템은 쉽게 astrocyte 생물학의 다양한 측면을 연구에 대한 순수한 마우스 astrocytes와 astrocyte이 설치된 미디어를 얻을하는 데 사용할 수 있습니다.

전체 마우스의 뇌 (그림 1A), 소뇌 및 후각 구근은 (그림 1B) 제거 할 필요가의 고립시. cortices은 마우스 뇌 줄기 (그림 1C) 및 개인 피질 (그림 1D &#39;)의 meninges의 껍질을 벗겨 아르주의 (그림 1E) 제거됩니다. Meninges는 수막 동맥 시스템 및 수막 세포와 섬유 아세포에 의한 최종 astrocyte 문화의 오염의 불완전 제거 결과로 분명합니다. 혼합 대뇌 피질의 세포 현탁액의 도금 후, 일부 astrocytes는 이미 24 시간 (그림 2A)에서 문화 플라스크에 첨부합니다. 문화 매체가 glial 세포의 생존과 성장을 중시하는 그러나, 세포 배양 표면에 뜨는는, 첫 번째 3-5일 (그림 2A-C)에 대한 세포 파편과 죽어 뉴런을 포함합니다. 일단 astrocytes는 합류하며 microglia는 astrocyt에 노출 앉아서전자 층, 보통 혼합 대뇌 피질 세포의 분리 후 7 일에서, astrocytes는 (그림 2D) 흔들림에 의해 microglia 및 OPCs에서 분리해야합니다. 첫 번째 분할 세포 후 2 일 astrocyte 형태를 보여줍니다. 이 시점 astrocyte 밀도에서 낮은이며, astrocytes는 커다란합니다 (그림 2E는 검은 색 화살표가 한 셀을 표시). 이 시점에서 예상 수확량은 T75 조직 배양 플라스크 당 4-6에 대한 X10 5 세포로 낮습니다. 그러나, 세포는 여전히 세포 분열 따위에 의해 번식이 timepoint에서 문화에 성숙. Astrocytes는 일반적으로 절연 astrocytes의 성숙 표현형을 보장하기 위해 28 일 (그림 2 층)에 일 21시 실험에 사용됩니다. 이 시점에서 예상 수확량은 T75 조직 배양 플라스크 당 1.5-2에 대한 X10 6 셀입니다. astrocyte 문화 순도는 전자 현미경 형태학의 연구, 세포 마커 표현과 약리 응답 27을 특징으로하고 있습니다. 의 오염strocyte 문화 microglia (IBA-1)과 OPCs (O4)에 대한 마커를 사용하여 검사를 할 수 있습니다. 획득 astrocyte 문화 순도와 성숙은 GFAP 단백질에 대한 항체를 사용하여 immunocytochemical 시험으로 검토해야합니다. 이것은 세포의 대부분이 집중, filamentous 신호 (그림 3)를 보여줍니다 것으로 기대된다. 대뇌 피질의 astrocytes 우리의 고립과 문화 방법은 GFAP 단백질 (그림 3)에 대한 항체를 사용하여 공개,보다 큰 98 % astrocyte 순도있었습니다. 절차가 성공했다면 오염 전지는 드문 (&lt;2 %) 각각 IBA-1과 O4를 사용하여 물들 일 수 microglia와 OPCs를 포함하고 있습니다. 이러한 Aquaporin-4, BLBP, S100B와 GLAST 등의 astrocyte 마커의 원하는 경우, 추가 분석을 사용할 수 있습니다. GFAP뿐만 아니라, 이러한 마커는 모두 28 일 이전 astrocyte 문화에 의해 표현되었다. astrocyte 인구를 정​​화의 최근 유전자 발현 프로파일은 새로운 가능성 대서양 표준시 밝혀이러한 또한 절연 대뇌 피질의 astrocytes (그림 3)의 대다수에 의해 표현되는 엽산 대사 효소 ALDH1L1 30,31 등 rocyte 마커. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50079/50079fig1.jpg" /> 1 그림. 출생 후의 (P3) 마우스 피질의 해부. A) 전체 뇌. 후각 구근과 소뇌의 제거 후 B) 브레인. 뇌의 피질의 판과 같은 구조를 벗겨내는하여 cortices의 C) 절연. D, meninges (검은 색 화살표가 수막 동맥을 나타냅니다)와 복부와 등쪽 사이트에서 D &#39;) 컴퓨터에 접속. E) 컴퓨터에 접속이 meninges없이. 스케일 바, 1.5 mm. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50079/50079fig2.jpg" /> 그림 2. 분리 후 다른 timepoints에 격리 된 혼합 대뇌 피질의 세포와 순수 astrocyte 문화의 형태학의 개요.혼합 대뇌 피질 세포의 도금 후 A) 일일. 먼저 astrocytes는 병의 하단 (검은 색 화살표)에 부착 죽어 뉴런은 표면에 뜨는에 있습니다. B) 삼일 혼합 대뇌 피질 세포의 도금 후. Astrocyte 층 (검은 색 화살표) 성형입니다. 뉴런은 거의 결석입니다. C) 오일 혼합 대뇌 피질 세포의 도금 후. 먼저 microglia와 astrocyte 층의 상단에 OPCs (검은 색 화살표). D) 칠일 혼합 대뇌 피질 세포의 도금 후. Astrocyte 층이 완전히 합류합니다. E) 분할 후 활발한 흔들림 2 일에 의해 microglia 및 OPCs을 제거한 후 부착 전지는 낮은 밀도 (화살표가 하나의 셀을 나타냅니다)와 astrocyte 형태를 보여줍니다. F) Astrocyte 층은 이주 첫 번째 분할 후 높은 밀도를 보여줍니다. 스케일 바, 10 μm. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50079/50079fig3.jpg" /> 그림 3. 주요 astrocyte 문화의 순수함. 기본 마우스 astrocyte의 막으로 Immunolabeling마커 GFAP, GLAST, S100B, Aquaporin-4, ALDH1L1 및 BLBP (모든 녹색)과 tures은 순수한 기본 astrocyte 문화를 밝혔다. 핵은 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (파란색) 물들입니다. 스케일 바 : 10 μm.

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Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes 정상 뇌 개발 및 기능, 및 중앙 신경계 수리를 위해 필수적인 기초 생물학적 과정에 참여하는 다양한 세포로 인정되었습니다. 여기 중추 신경계 세포의 주요 클래스의 생물학을 연구하는 순수 마우스 astrocyte 문화를 얻기 위해 빠른 절차를 제시한다.

마우스 두피 Astrocytes의 분리와 문화

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

91.4K 조회수.  University of Freiburg. Astrocytes 정상 뇌 개발 및 기능, 및 중앙 신경계 수리를 위해 필수적인 기초 생물학적 과정에 참여하는 다양한 세포로 인정되었습니다. 여기 중추 신경계 세포의 주요 클래스의 생물학을 연구하는 순수 마우스 astrocyte 문화를 얻기 위해 빠른 절차를 제시한다.

비디오: Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

연구

면역학 및 감염병학

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

모델링 성상 세포종 병인<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

신경과학

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies indicate that the severity of brain injury appear to be sex dependent, and that the male neonates are more susceptible to the effects of HI-related brain injury, resulting in more severe neurological outcomes as compared to females with comparable brain injuries. The development of reliable methods to isolate and maintain highly enriched populations of sexed hippocampal astrocytes is essential to understand the cellular basis of sex differences in the pathological consequences of neonatal HI. In this study, we describe a method for creating sex specific hippocampal astrocyte cultures that are subjected to a model of in-vitro ischemia, oxygen-glucose deprivation, followed by reoxygenation. Subsequent reactive astrogliosis was examined by immunostaining for the Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and S100B. This method provides a useful tool to study the role of male and female hippocampal astrocytes following neonatal HI, separately.

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrocytes are one of the most important key players in the central nervous system (CNS). Here, we are reporting a practical method of sexed hippocampal astrocyte culture protocol in order to study the mechanisms underlying the astrocyte function in male and female neonate pups after in-vitro ischemia.

마우스 해마 성상에서 섹스 차이점 후<em&gt; 인 체외</em&gt; 허혈

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

간접 신경-성상 세포 공동 배양 분석 일 :<em&gt; 체외</em&gt; 신경 세포 - glia 상호 작용의 상세한 조사를위한 셋업

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in brain homeostasis, astrocytes supply neurons with vital metabolites and buffer extracellular water, ions, and glutamate. An integral component of the &#8220;tri-partite&#8221; synapse, astrocytes are also critical in the formation, pruning, maintenance, and modulation of synapses. To enable these highly interactive functions, astrocytes communicate among themselves and with other glial cells, neurons, the brain vasculature, and the extracellular environment through a multitude of specialized membrane proteins that include cell adhesion molecules, aquaporins, ion channels, neurotransmitter transporters, and gap junction molecules. To support this dynamic flux, astrocytes, like neurons, rely on tightly coordinated and efficient intracellular transport. Unlike neurons,&#160;where intracellular trafficking has been extensively delineated, microtubule-based transport in astrocytes has been less studied. Nonetheless, exo- and endocytic trafficking of cell membrane proteins and intracellular organelle transport orchestrates astrocytes&#8217; normal biology, and these processes are often affected in disease or in response to injury. Here we present a straightforward protocol to culture high quality murine astrocytes, to fluorescently label astrocytic proteins and organelles of interest, and to record their intracellular transport dynamics using time-lapse confocal microscopy. We also demonstrate how to extract and quantify relevant transport parameters from the acquired movies using available image analysis software (i.e., ImageJ/FIJI) plugins.

Here we describe an in vitro live-imaging method to visualize intracellular transport of organelles and trafficking of plasma membrane proteins in murine astrocytes. This protocol also presents an image analysis methodology to determine cargo transport itineraries and kinetics.

성상 세포에서 세포기관 및 기타 화물의 세포내 운송 시각화 및 분석

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through multipotent intermediates. This technique not only holds great promises in the field of disease modeling, as it allows to convert, for example, fibroblasts for patients suffering neurodegenerative diseases into neurons, but also represents a promising alternative for cell-based replacement therapies. In this context, a major scientific breakthrough was the demonstration that differentiated non-neural cells within the central nervous system, such as astrocytes, could be converted into functional neurons in vitro. Since then, in vitro direct reprogramming of astrocytes into neurons has provided substantial insights into the molecular mechanisms underlying forced identity conversion and the hurdles that prevent efficient reprogramming. However, results from in vitro&#160;experiments performed in different labs are difficult to compare due to differences in the methods used to isolate, culture, and reprogram astrocytes. Here, we describe a detailed protocol to reliably isolate and culture astrocytes with high purity from different regions of the central nervous system of mice at postnatal ages via magnetic cell sorting. Furthermore, we provide protocols to reprogram cultured astrocytes into neurons via viral transduction or DNA transfection. This streamlined and standardized protocol can be used to investigate the molecular mechanisms underlying cell identity maintenance, the establishment of a new neuronal identity, as well as the generation of specific neuronal subtypes and their functional properties.

Here we describe a detailed protocol to generate highly enriched cultures of astrocytes derived from different regions of the central nervous system of postnatal mice and their direct conversion into functional neurons by the forced expression of transcription factors.

마우스 성상세포의 분리 및 직접 뉴런 리프로그래밍

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

Efficient Extraction of Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic cells exhibit rapid responses to environmental changes and display significant heterogeneity in terms of morphology, transcriptional profiles, and functions. While our understanding of the functions of glial cells in health and disease has advanced substantially, there remains a need for in vitro, cell-specific analyses conducted in the context of insults or injuries to comprehensively characterize distinct cell populations. Isolating cells from the adult mouse offers several advantages over cell lines or neonatal animals, as it allows for the analysis of cells under pathological conditions and at specific time points. Furthermore, focusing on spinal cord-specific isolation, excluding brain involvement, enables research into spinal cord pathologies, including experimental autoimmune encephalomyelitis, spinal cord injury, and amyotrophic lateral sclerosis. This protocol presents an efficient method for isolating astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating immediate or future analysis with potential applications in functional, molecular, or proteomic downstream studies.

저자 스포트라이트: Isolation of Glial Cells from the Adult Mouse Spinal Cord 

This protocol outlines the isolation of purified astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating subsequent applications such as RNA analysis and cell culture. It includes detailed cell dissociation methods and procedures designed to enhance both the quality and yield of isolated cells.

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

Isolation of Microglia from the Cortex of an Adult Mouse Brain

Source: Zhou, L., et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60347">Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a technique for isolating microglia from the cortex of an adult mouse brain. First, the cortex undergoes segmentation and homogenization to remove neurons and other glial cells, preserving microglia. Following that, the cell suspension is exposed to anti-myelin magnetic microbeads and a magnetic field, effectively separating microglia and myeloid cells from myelin debris and cells containing myelin.

성인 마우스 뇌의 피질에서 미세아교세포의 분리

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Mechanical Tissue Dissociation
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마우스 두피 Astrocytes의 분리와 문화

요약

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