This research was supported by a National Leading Research Laboratory Program (Grant NRF-2013R1A2A1A05006378) through the National Research Foundation of Korea funded by the Ministry of Science, ICT and Future Planning. The authors also acknowledge a KAIST Systems Healthcare Program.

미세 패턴 금형 및 히드로 겔 1. 준비 <ol><li> PDMS 몰드 주조 표준 두 단계의 포토 리소그래피 기술에 15,17 통해 실리콘 웨이퍼의 표면에 포토 레지스트 SU-8을 사용하여 목적하는 마이크로 규모의 패턴을 생성한다. 도시 된 예에서는 간 소엽 형 메시 패턴 (도 1)를 사용한다. </li><li> 1의 비율로 PDMS와 경화제 용액을 체중 : 5 (즉, PDMS 12.5 g과 경화제 2.5 g). </li><li> 철저 용액 15g을 혼합, 진공 챔버 내에서 기포를 탈기하고 고르게 포일 캐스팅 접시 내에 실리콘 웨이퍼의 표면에 미세 패턴이 혼합 용액을 확산. </li><li> PDMS를 치료하는 평평한 표면에 90 분 동안 65 ℃로 가열 판에 실리콘 웨이퍼를 놓습니다. </li><li> 주조 요리와 실리콘 웨이퍼로부터 경화 된 PDMS를 제거합니다. </li><li> PDMS의 가장자리를 잘라 100 mm 직경의 페트리 접시에 배치미세 패턴면을 위로. </li><li> 차 살균을 위해 70 % 에탄올 및 증류수를 사용하여 배양 접시에 마이크로 패턴 경화 된 PDMS를 씻으십시오. 그 후, 65 ° C의 오븐에서 10 분 동안 완전히 건조한다. </li><li> 도포 액 (/ V W) 3 %를 생성 녹이고 100 ml의 증류수에 분말 비이 온성 계면 활성제의 O / N 3g을 혼합한다. </li><li> 플라즈마 세정기에 미세 패턴 PDMS 몰드를 놓고 1 분 (85 ​​W, 0.73 밀리바) 수성 액체의 첨가를 용이하게하기 위해, 친수성 ​​표면을 생성하기 위해 그 청소. 이어서, 실험실 코트 로커를 이용하여 적어도 3 시간 (오로 / N) 100 ㎖ 용 활성제 용액의 표면 PDMS. </li><li> PDMS 금형에서 계면 활성제 용액을 씻고 10 분 동안 65 ℃의 오븐에서 완전히 건조. 그 후, 30 분 동안 자외선 (UV) 방사선을 조사함으로써 각 미세 패턴 금형 살균. </li></ol> 2. 하이드로 겔 전구체 세포 현탁액을 준비 <ol><li> 에1 % (w / v)의 전구체를 생성 알긴산, 하이드로 겔 전구체를 준비하는 인산염 완충 식염수 (PBS) 10ml에 알긴산 나트륨 분말 0.1 g을 용해. 완전히 분말을 용해, 부화 및 / O N 그들을 섞는다. </li><li> 1 mL의 주사기에 연결된 0.22 μm의 필터를 통해 용액을 필터. </li><li> 배양 10 % 우 태아 혈청 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 70 %까지 종래의 조직 배양 접시에 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 인 HepG2 세포 - 5 % CO 2의 가습 인큐베이터 내에서 80 % 합류 37 ℃에서 . </li><li> 한번 PBS를 사용하여 세포를 세척 한 다음 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 인큐베이터 내에서 4 분 동안 0.05 % 트립신 EDTA 1 ㎖를 첨가하여 그들을를 Trypsinize. 원심 상등액의 제거 다음 1 ㎖의 PBS를 사용하여 3 분 재현 탁하고 250 XG에서 배양 접시에서 세포를 수확. </li><li> 자동화 된 세포를 사용하여 PBS에 분산 된 단일 세포의 수를 세계수기. </li><li> 3 분간 PBS를 제거하고, 250 XG에서 원심 분리에 이어 1 % 1ml를 추가 (/ w를 V) 나머지 세포 펠렛에 알긴산 나트륨 용액을 피펫 팅하여 부드럽게 섞어. 10 7 세포 / ml - 세포의 최종 시딩 밀도는 5 × 106이어야한다. 37 ℃에서 5 % CO 2 인큐베이터에서 가습 셀 / 하이드로 겔 현탁액을 배양한다. </li></ol> 3.로드 및 셀 / 히드로 겔 현탁액의 크로스 연결 <ol><li> 염화칼슘 1.47 g는 가교 시약을 제조 DDH 2 O 100ml에 용해 탈수 (즉, 100 mM의 CaCl2를 · 2H 2 O의 DDH 2 O). </li><li> 70 % 에탄올을 사용하는 초음파 트랜스 듀서와 가습기의 내부를 씻어 및 가교 시약 200 ㎖로 채 웁니다. 가습기, 110mm 폭 300mm 길이 170mm 깊이 (즉, 110mm X 300mm X 170mm (폭 x 높이 x 깊이)). </li><li> 미세 패턴 PDMS를 배치플라즈마 클리너 금형 및 친수성 ​​표면을 만드는 데 85 승에서 1 분을 청소합니다. </li><li> 꾸준히 금형의 미세 패턴의 가장자리에 잘 혼합 된 세포 / 하이드로 겔 현탁액의 7.2 μl를로드합니다. 도시 된 예에서는 간 소엽 형 메시 패턴 (도 1)를 사용한다. 현탁액의 부피는 지형의 패턴에 의존한다. </li><li> 셀 / 하이드로 겔 현탁액의 겔화를 달성하기 위해 가습기를 켜고 가습기가 가교 시약의 안개를 생성되었는지 확인합니다. 5cm의 범위 내 PDMS 몰드의 표면 지형을 덮고 5 분간 하이드로 겔 전구체에 가교 시약을 분무. 거리 이상과 미만 5cm 각각 불완전하고 불균일 한 겔화가 발생할 수 : 있습니다. 가습기는 5 분에서 가교 시약의 안개 20 ㎖를 생산하는 250 ㎖ / hr의 분사 속도를 가지고 있는지 확인하십시오. </li><li> 가교 공정에 따라, 가습기를 끄고 PDMS 모 채우기PBS로 LDS. </li></ol> 단일 모듈 형 하이드로 겔 시트 4. 처리 <ol><li> 200 μL 피펫 팁을 사용하여 하이드로 겔 시트 주위 PBS 부드럽게 피펫 팅을 통해 미세 패턴 금형으로부터 각 경화 하이드로 겔 시트를 분리. </li><li> 최종 절단 1,000 μL 피펫 팁 단부를 이용하여 각각의 부동 하이드로 겔 시트를 픽업. 각 간 소엽 형상 메쉬 하이드로 겔 시트는 8mm X 8.7 mm의 치수를 가지며, 100 일 - 200 μm의 두께. </li><li> 5의 하이드로 겔은 주 이상 12 웰 플레이트에서 단위 요소로 구성하여 부유하게 생체 외에서 세포를 12 웰 플레이트에 DMEM 1 ㎖로 하이드로 겔 시트의 단일 층을 이동시켜, 문화 %의 CO 2는 37 ° C에서 인큐베이터를 가습. 매일 배지를 교환하십시오. </li></ol> 5. 조립 다층 히드로 겔 시트 <ol><li> 반복 18mm X 18mm X 4mm의 크기로 PDMS 프레임을 생산하는 1.5 1.1 단계 (폭 x하부면에 170 μm의 높은 기둥 구조를 포함 H의 X의 D), 및. 단계 1.2에서와 동일한 비율로, PDMS와 경화제의 혼합물의 42g을 사용한다. PDMS 프레임이 X 9mm X 2mm 8mm의 크기와 내부 프레임을 생성하는 실리콘 웨이퍼에 특수 폴리 카보네이트 금형 배치 (폭 x 높이 x 깊이). </li><li> 121 ° C에서 15 분간의 오토 클레이브에 증류수 핀셋 잠긴 PDMS 프레임 및 180 μm의 세공 나일론 여과지 살균. </li><li> 60 mm 직경의 페트리 접시 (5cm의 직경) 나일론 여과지의 분기 상 멸균 PDMS 프레임을 배치했다. </li><li> 최종 절단 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 PDMS 프레임의 내부로 모듈화 하이드로 겔 시트를 옮긴다. 어셈블리에 사용되는 하이드로 겔 시트가 제작되었다 후 적어도 하루 동안 배양한다. </li><li> 빈 200 μL 피펫 팁을 사용하여 PDMS 프레임마다 모듈화 하이드로 겔 시트의 에지를 정렬. </li><li> 6 층 - 반복 (4)의 적층을 형성하는 모듈 형 하이드로 겔 시트를 사용하고 5.4 5.5 단계. </li><li> PDMS 프레임의 하단 기둥 구조를 통해 유출하여 배양 배지를 제거한다. 이어서 알지네이트 용액 2 μL 추가 (/ w 2 % V) 다층 구조체의 코너. </li><li> 다른 사람들과의 각각의 층의 가장자리를 연결하는 다층 구조체 상에 30 초 동안 가교 결합 시약의 안개 스프레이. (250 ㎖ / hr의 속도로 분무) 가교 시약 미스트 2 ㎖을 사용한다. </li><li> 400 μL DMEM으로 가볍게 다층 구조를 씻어 핀셋을 사용하여 PDMS 프레임을 제거합니다. </li><li> 부드럽게 DME​​M 4 ㎖를 첨가 한 후 리프터 셀 닦아 여과지에서 다층 구조를 분리. </li><li> 전송 다층 하이드로 겔과 같은 구성의 3 mL의 DMEM 여과지, 문화 플로팅 방식으로 시험 관내에서 세포를 사용하여, 함유 6- 웰 플레이트로 구성37 ℃에서 5 % CO 2 인큐베이터에서 가습 주 이상 6 웰 플레이트에서 다중 스케일 셀룰러 지지체. 매일 배지를 교환하십시오. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 모듈 식 하이드로 겔 시트를 제조하고, 3 차원 세포 지지체를 형성하도록 조립하는 간단한 방법을 제공한다. 단시간에 분명한 패턴 알긴산 구조를 구축하기 위해서는 주형으로부터 복잡한 미세 패턴을 유지할뿐만 아니라, 세포 생존 및 대사를 유지하도록 충분한 강성 구조를 만들 수 가교 프로세스를 식별한다. 우리는 안개 형태의 가습기를 이용하여 가교 시약을 분무, 졸 - 겔 전이를 포함하여, 가교 공정을 개발 하였다. 영양소 및 대사 산물의 높은 투자율을 갖는 확산 - (200 내지 100㎛),이 가교 처리하지 않고, 미세 스케일 패턴을 한정 확산 깊이와 구성 얇은 하이드로 겔의 형태로 생성 할 수 없습니다. 60 분, 18 - - 20 가교 TI 또한, 30을 요구 기존 확산 기반 방법에 비해(- 5 분​​ 3) 나 상대적으로 짧았다. 게다가, 그것은 또한 단지 액체 매질 기계적 안정 얇은 하이드로 겔 시트를 조작하기 어려웠다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 얇은 하이드로 겔 구조가 간단하고 안정적으로 처리하고 다른 배양 조건 사이 transferal 대한 최종 절단 종래의 팁을 사용하여 조작했다. 생성 및 조작 기술을 이용하여, 우리는 조직 형 구조물을위한 지지체로서 응용 가능성으로, 약물 분석법에서 잠재적 애플리케이션을위한 플로팅 방식으로 단층 시트뿐만 아니라 적층 다층 구조까지도 제공 할 수있다. 다층 셀룰러 아키텍처는 모듈 형 단층 하이드로 겔 시트를 (도 3A)를 적층하여 생성 될 수있다. 각각의 모듈 형 하이드로 겔 시트는 세포 유형 상이한 포함 할 수 있으며, 다른 배양 조건에 노출 될 수있다. 이러한 다층 구조물은 선택적 ASSEM 될 수도출혈. 총 깊이가 제한된 확산 깊이 (그림 3C)를 초과하는 경우에는, 단순히 적층 하이드로 겔 시트 조립 구조 내에서 세포 괴사가 발생할 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 다중 층 하이드로 겔 시트가 조립 될 때 이러한 간 소엽 형 메쉬 등의 마이크로 메시 패턴을 정렬 할 필요가있을 것이다. 하이드로 겔 시트의 테두리가 적층 된 하이드로 겔 시트를 정렬하도록 그러므로 우리는 동일한 내부 패턴 PDMS 프레임을 필요로한다. 따라서, 조립 메쉬 하이드로 겔 시트의 정렬 홀 어레이 미세 패턴은 향상된 세포 생존율 (도 3B)에 대한보다 효율적인 영양소 수송을 용이하게 확장 파이프 라인 구조를 형성하기 위해 사용될 수있다. 이 기술의 한 가지 제한은 알긴산 겔에서 세포 - 기질 상호 작용의 부재이다. 알긴산은 생체 -like 세포 - 매트릭스 상호 작용에 대한 세포 부착 리간드를 제공 할 수 없다 (21) 그러나, 오프 수행세포 - 세포 상호 작용 3D 세포 캡슐화 발판으로 기계 및 기하학적 효과 어. 세포 일차 세포 및 줄기, 알지네이트가 RGD 함유 펩티드, 21 또는 콜라겐 또는 젤라틴과 조합으로 다음의 변형을 사용할 수있다. (14, 18)의 또 다른 제한은, 그 셀 매립 하이드로 겔 시트가 아래 낮은 세포 밀도로 제조되면 구조의 가장자리 부가 알지네이트를 이용하여 고정되어 있기 때문에 5 × 106 세포 / ml이 다층 구조체의 구조는 하이드로 겔 시트 사이의 약한 부착을 초래할 수있다. 그러나, 층은 PDMS 프레임 하에서 배수 구조를 통해 단일 ​​지지체로서 컴팩트하게 적층 될 수있다. 또한, 하이드로 겔 시트의 셀 밀도는 더 높은 표면뿐만 아니라,도 3a에 도시 된 바와 같이 층들 사이의 부착하는 데 유용한 하루 배양 후 층 내에서 증식 할 수있다. 하이드로 겔 시트 FABRICA여기에 기재된 기 및 조작 기술은 셀룰러 기술 및 분석법을 포함하여 인공 장기 애플리케이션 생체 -like 미세을 제공하는 시험 관내 배양 시스템과 같은 조직 세포의 모델에 적응 될 수있다. 이 기술은 세포 기반 분석법 약물 및 다른 3D 기하학적 마이크로 셀룰러 및 다양한 세포 유형 또는 하이드로 겔을 포함 macroenvironments 필요할 생물학적 연구에 적용 할 수있다.

하이드로 겔은 특히 생체 재료 유망하고, 기초 생물학, 약리학 적 분석 및 의학에 중요한 것으로 예상된다. 한 하이드로 겔 기반 셀룰러 구조의 Biofabrication 동물 실험의 사용을 줄이기 위해 제안되었다, 2,3- 4, 이식 가능한 조직을 대체 및 개량 세포 기반 분석법. 5,6- 수분을 함유 한 (하이드로) 점탄성 재료 (겔)은 다수의 셀이 캡슐화되어 3D 세포 미세 환경을 제어하기 골격 구조로 유지 될 수 있도록. 미세 유동 또는 미세 가공 기술의지도와 함께, 하이드로 겔 구조의 형상을 정확하게 셀룰러 스케일에서 제어 할 수있다. 날짜, 입자를 포함하는 하이드로 젤의 모양의 다양한, 7-9 섬유, 10-12과 시트, 13-15은 상향식 (bottom-up) 아프로에 건물 단위로 사용되어왔다매크로 규모의 다세포 구조의 제조에 아파. 하이드로 겔 기반 입자와 섬유 모두 미세 유체 장치를 사용하여 유체 컨트롤, 마이크로 스케일 셀룰러 환경과 같은 애플리케이션에 쉽고 빠르게 제작되었습니다. 그러나, 설계 조직의 기본 단위로, 그것은 다시 정렬하고 매크로 규모의 구조로 자신의 볼륨을 확대. 16 미크론 크기의 기본 모듈을 생산하는 것보다 그것은 매크로 스케일 구조를 달성하기 어렵다 복잡 할 것입니다. 하이드로 겔 - 기반 구조의 시트형 유닛 간단한 조립 공정을 통해 지지체의 부피를 증가 시키는데 사용될 수있다. 간접으로, 하이드로 겔 시트의 적층은 체적의 증가뿐만 아니라, 3 차원 공간에서의 기하 확장을 제공 할뿐만 아니라. 다중 꼬임으로 그들의 조립체와 함께 15 - 우리는 이전에, 미세 패턴 (13) 하이드로 겔 시트를 제조하는 방법을보고했다겹으로 셀룰러 아키텍처. 이 기술은 다층 구조의 적층 공정을 통해 복잡한 미세 가공 및 세포 구조의 모듈 식 설계를 할 수 있습니다. 적층되는 마이크로 패턴 모듈러 하이드로 겔 시트의 제작을 통하여, 제어 된 매크로 스케일 미세 세포와 3D 세포 배양 시스템을 실현할 수있다. 이 비디오 프로토콜은 인간 간 암종 세포주 (HepG2)에 기반 모듈러 하이드로 겔 시트를 구성하는 데 사용될 수있다 간단하지만 강력한 제조 방법을 설명한다. 우리는 본원에서 이러한 간단한 패터닝 모듈 하이드로 겔 시트의 조작, 다층 구조로 그 조립을 증명한다.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Powdered nonionic surfactant&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alginic acid sodium salt, low viscosity</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25266</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic humidifier</td><td>MediHeim</td><td>MH-2800</td><td>Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr</td></tr><tr><td>Nylon net filter hydrofilic, 180 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>NY8H04700</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate mold</td><td></td><td></td><td>Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern</td></tr></tbody></table>

construction of modular hydrogel sheets for micropatterned macro-scaled 3d cellular architecture

하이드로 겔은 생체 -like 3 차원 조직 구조를 제공하는 미세 유동 또는 미세 가공 기술을 이용하여 미세 규모로 패터닝 될 수있다. 얻어진 하이드로 겔 3D 기반 셀룰러 구조는 진보 된 생물학적 연구, 약물 학적 분석 및 장기 이식 애플리케이션 동물 실험의 대안으로 도입되었다. 하이드로 겔 계 입자와 섬유가 쉽게 제조 될 수 있지만, 조직 재건으로 조작하는 것이 곤란하다. 이 동영상에서는 셀룰러 미세 제어와 매크로 스케일 3 차원 세포 배양 시스템을 형성하기 위해 그들의 조립체와 함께, 미세 패턴 알지네이트 하이드로 겔 시트의 제조 방법을 설명한다. 200 μm의, 정밀한 미세 패턴으로 - 칼슘 겔 화제의 안개 상을 사용하여, 하이드로 겔 얇은 시트 용이 100의 범위의 두께로 생성된다. 세포를 하이드로 겔 시트 형상의 안내 배양 할 수있다독립 구조로 서있는 상태. 또한, 하이드로 겔 시트가 용이 단부 컷 팁 마이크로 피펫을 사용하여 조작 될 수 있고, 패터닝 된 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)을 사용하여 프레임을 적층하여 다층 구조로 조립 될 수있다. 손쉬운 프로세스를 사용하여 제조 할 수있다 이러한 모듈 형 하이드로 겔 시트, 마이크로 및 거시 및 조직 재건의 기능 연구를 포함하여 체외 약물 분석 및 생물학적 연구의 응용 가능성을 가지고있다.

우리는 제조 및 세포 하이드로 겔 시트를 자립의 조작을 설명했다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 우리는 미세 패턴 PDMS 몰드를 제작하고, 세포 - 함유 하이드로 겔은 친수성이 금형의 표면 상에 로딩 된 가교 결합 된 겔 화제의 에어로졸 분무를 생성하도록 가습기를 사용. 금형에서 방출 후, 인 HepG2 세포는 다양한 패턴 (그림 2)와 하이드로 겔 시트 자립에서 배양 하였다. 따라서, 얇은 하이드로 겔 시트는 3 차원 배양 환경을 제공. 또한, 모듈 형 하이드로 겔 시트는 최종 절단 끝 마이크로 피펫을 사용하여 시트를 적층하고, 3D 매크로 스케일의 세포 배양 물 (도 3) 사용 PDMS 프레임을 이용하여 조립 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig1.jpg" /> 그림 1. 흐름 차RT 히드로 겔 시트 및 다층 히드로 겔 시트의 제조를 표시합니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53475/53475fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig2.jpg" /> 다양한 하이드로 겔 시트에도 2 버팀 3D 세포 배양. 마이크로 규모 알긴산 겔의 정확한 패터닝을 활성화 가교 시약을 분무 제조 방법. 또한, 제조 된 하이드로 겔 시트를 금형에서 수확 될 수 있고, 프리 스탠딩 상태에서 용이하게 조작. 인 HepG2 세포 패터닝 평면 하이드로 겔 시트 (A)에서 배양하고, 육각 기둥 (B), 메시 (C), 간 소엽 형상 메쉬 (D), 구멍의 배열 (E), 및 multipl와 하이드로 겔 시트전자 microcomb 같은 마이크로 섬유 (F). 다음과 스케일 바는 다음과 같습니다. 500 μm의 (A, D, F), 100 ㎛ (B, C) ​​및 2mm (E)는 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53475/53475fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig3.jpg" /> 도 3 어셈블리 매크로 스케일 셀룰러 구축해위한 미세 패턴 히드로 겔 시트. 하이드로 겔 시트의 다양한 형태의 녹색 형광 및 NIH3T3 세포 염색 인 HepG2 세포를 함유하는 다섯 하이드로 겔 시트 조립체를 포함하여, 정렬과 층별 적층을 통해 조립 될 수있다 빨간색 형광 (A)로 염색. 확장 파이프 라인 구조 (B)를 가진 미세 패턴 하이드로 겔 시트 조립체는 높은 세포 생존 그쪽을 구비없음 7 일 후 비 패턴 하이드로 겔 시트 (C)의. 생존율 칼 세인 AM (녹색으로 도시 생균) 및에 티듐 호모 다이머 -1 (적색으로 표시 사균)와 인 HepG2 세포를 염색하여 평가 하였다. 스케일 바 :. 500 μm의 (A)와 200 μm의 (B, C) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53475/53475fig3large.jpg" target="_blank">​​이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K 조회수.  Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment. 

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Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

연구

생체공학

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

생화학

Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact bioprinting1-4 (extrusion, dip pen and soft lithography), contactless bioprinting5-7 (laser forward transfer, ink-jet deposition) and laser based techniques such as two photon photopolymerization8. It can be used for many applications such as tissue engineering9-13, biosensor microfabrication14-16 and as a tool to answer basic biological questions such as influences of co-culturing of different cell types17. Unlike common photolithographic or soft-lithographic methods, extrusion bioprinting has the advantage that it does not require a separate mask or stamp. Using CAD software, the design of the structure can quickly be changed and adjusted according to the requirements of the operator. This makes bioprinting more flexible than lithography-based approaches.
Here we demonstrate the printing of a sacrificial mold to create a multi-material 3D structure using an array of pillars within a hydrogel as an example. These pillars could represent hollow structures for a vascular network or the tubes within a nerve guide conduit. The material chosen for the sacrificial mold was poloxamer 407, a thermoresponsive polymer with excellent printing properties which is liquid at 4 &deg;C and a solid above its gelation temperature ~20 &deg;C for 24.5% w/v solutions18. This property allows the poloxamer-based sacrificial mold to be eluted on demand and has advantages over the slow dissolution of a solid material especially for narrow geometries. Poloxamer was printed on microscope glass slides to create the sacrificial mold. Agarose was pipetted into the mold and cooled until gelation. After elution of the poloxamer in ice cold water, the voids in the agarose mold were filled with alginate methacrylate spiked with FITC labeled fibrinogen. The filled voids were then cross-linked with UV and the construct was imaged with an epi-fluorescence microscope.

A bioprinter was used to create patterned hydrogels based on a sacrificial mold. The poloxamer mold was backfilled with a second hydrogel and then eluted, leaving voids which were filled with a third hydrogel. This method uses fast elution and good printability of poloxamer to generate complex architectures from biopolymers.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

면역학 및 감염병학

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single strain-induced cellular alignment on a cell-laden hydrogel by using complex experimental processes and mass controlling systems, which are usually associated with contamination issues. Thus, in this article, we propose a simple approach to building a gradient static strain using a fluidic chip with a plastic PDMS cover and a UV transparent glass substrate for the stimulation of cellular behavior in a 3D hydrogel. Overloading photo-patternable cell prepolymer in the fluidic chamber can generate a convex curved PDMS membrane on the cover. After UV crosslinking, through a concentric circular micropattern under the curved PDMS membrane, and buffer washing, a microenvironment for investigating cell behaviors under a variety of gradient strains is self-established in a single fluidic chip, without external instruments. NIH3T3 cells were demonstrated after observing the change in the cellular alignment trend under geometry guidance, in cooperation with strain stimulation, which varied from 15 - 65% on hydrogels. After a 3-day incubation, the hydrogel geometry dominated the cell alignment under low compressive strain, where cells aligned along the hydrogel elongation direction under high compressive strain. Between these, the cells showed random alignment due to the dissipation of the radical guidance of hydrogel elongation and the geometry guidance of the patterned hydrogel.

This article introduces a simple approach to providing non-continuous gradient static strains on a concentric cell-laden hydrogel to regulate cell alignment for tissue engineering.

그라데이션 변형 칩 셀 라덴 히드로에 자극 세포 행동에 대 한

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

패터닝 단백질과 세포의 다목적 방법

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

An Additive Manufacturing Technique for the Facile and Rapid Fabrication of Hydrogel-based Micromachines with Magnetically Responsive Components

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels have simple monolithic architectures and often function as scaffolding materials for tissue engineering applications. More sophisticated structures typically take a long time to fabricate and do not contain moving components. This protocol describes a photolithography method that allows for facile and rapid microfabrication of PEG structures and devices. This strategy involves an in-house developed fabrication stage that allows for the rapid fabrication of 3D structures by building upwards in a layer-by-layer fashion. Independent moving components can also be aligned and assembled onto support structures to form integrated devices. These independent components are doped with superparamagnetic iron oxide nanoparticles that are sensitive to magnetic actuation. In this manner, the fabricated devices can be actuated using external magnets to yield movement of the components within. Hence, this technique allows for the fabrication of sophisticated MEMS-like devices (micromachines) that are composed entirely out of a biocompatible hydrogel, able to function without an onboard power source, and respond to a contact-less method of actuation. This manuscript describes the fabrication of both the fabrication set-up as well as the step-by-step method for the microfabrication of these hydrogels-based MEMS-like devices.

An additive manufacturing strategy for processing UV-crosslinkable hydrogels has been developed. This strategy allows for the layer-by-layer assembly of microfabricated hydrogel structures as well as the assembly of independent components, yielding integrated devices containing moving components that are responsive to magnetic actuation.

첨가제 제조 기술은 자석으로 응답 구성 요소와 히드로 기반 Micromachines의 손쉬운 고 빠른 제작을 위해

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its restrictions. Producing few repeatable results of pattern formation deteriorates the analysis of the mechanisms underlying the self-organization. Reducing variation in initial culture conditions, such as the cell density and distribution in the extracellular matrix (ECM), is crucial to enhance the repeatability of a 3D culture. In this article, we demonstrate a simple but robust procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain highly repeatable pattern formations. A micromold with a desired shape was fabricated by using photolithography or a machining process, and it formed a 3D pocket in the ECM contained in a hybrid gel cube (HGC). Highly concentrated cells were then injected in the pocket so that the cell cluster shape matched with the fabricated mold shape. The employed HGC allowed multi-directional scanning by its rotation, which enabled high-resolution imaging and the capture of the entire tissue structure even though a low-magnification lens was used. Normal human bronchial epithelial cells were used to demonstrate the methodology.&#160;

We present a procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain a repeatable pattern formation. A cubic device containing two different hydrogels is employed to achieve multi-directional imaging for tissue pattern formation.

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

젤라틴 메타크릴 하이드로겔 기반 바이오잉크의 3D 바이오프린팅 프로토콜

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions without further additives. Continuous photoinitiated on-chip gelation enables variation of the microgel aspect ratio, which determines the building block properties for the obtained constructs. Glycidyl methacrylate (GMA) or 2-aminoethyl methacrylate (AMA) monomers are copolymerized into the microgel network based on polyethylene glycol (PEG) star-polymers to achieve either epoxy or amine functionality. A focusing oil flow is introduced into the microfluidic outlet structure to ensure continuous collection of the functionalized microgel rods. Based on a recent publication, microgel rod-based constructs result in larger pores of several hundred micrometers and, at the same time, lead to overall higher scaffold stability in comparison to a spherical-based model. In this way, it is possible to produce higher-volume constructs with more free volume while reducing the amount of material required. The interlinked macroporous scaffolds can be picked up and transported without damage or disintegration. Amine and epoxy groups not involved in interlinking remain active and can be used independently for post-modification. This protocol describes an optimized method for the fabrication of microgel rods to form macroporous interlinked scaffolds that can be utilized for subsequent cell experiments.

Microgel rods with complementary reactive groups are produced via microfluidics with the ability to interlink in aqueous solution. The anisometric microgels jam and interlink into stable constructs with larger pores compared to spherical-based systems. Microgels modified with GRGDS-PC form macroporous 3D constructs that can be used for cell culture.

마이크로젤 로드의 상호 연결된 거대 다공성 3D 스캐폴드

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...