이 프로토콜은 마이크로 기공 스캐폴드로 상호 연결되는 마이크로 겔 로드의 제조를 설명합니다. 이러한 스캐폴드는 효율적인 세포 세포 상호작용에 필요한 공간을 제공하는 세포와 조합하여 활용될 수 있다. 두 가지 유형의 마이크로 겔 막대는 접촉시 상호 연결됩니다.
높은 종횡비에서는 구형 마이크로 겔에 비해 적은 합성 물질을 사용하여 스캐폴드 안정성을 유지하면서 더 큰 기공을 유도합니다. 미세 기공 스캐폴드는 손상된 조직을 복구하기 위해 내인성 세포의 침투 및 상호 작용을 크게 향상시킵니다. 큰 구멍은 성장하는 조직에 영양분을 교환하기 위해 혈관 형성을 촉진합니다.
스캐폴드된 물질의 감소는 조직 형성을 위해 더 많은 열린 공간이 제공됨에 따라 유익하며, 이는 시험관내 및 생체내 적용 모두에 중요합니다. 중요한 측면은 치펠레이션 기술에 대한 미세한 것입니다. 마이크로 겔 로드의 지속적인 생산을 보장하려면 제품이 막히지 않고 튜브 밖으로 효과적으로 운반되어야 합니다.
시작하려면 바늘을 폴리에틸렌 튜브에 넣고 주사기와 튜브에서 가스를 제거하십시오. 그런 다음 제품 수집을 위해 추가 폴리에틸렌 튜브를 콘센트에 삽입하십시오. 그런 다음 모든 유리 주사기와 주사기 펌프를 놓고 각 튜브 끝을 해당 입구에 삽입합니다.
그런 다음 현미경을 오일 워터 단면에 초점을 맞춥니다. 분산상에 의한 채널 습윤을 방지하기 위해 먼저 채널에 오일을 채우기 위해 첫 번째 오일 주사기 펌프를 시작하십시오. 이어서, 제1 오일 유량을 시간당 30 마이크로리터로 감소시키고, 분산된 수성상이 단면에서 관찰될 수 있을 때까지 예비중합체 시린지 펌프를 시작한다.
다음으로, 프리 폴리머 유속을 시간당 30 마이크로 리터로 설정하고 출구에 현미경의 초점을 맞 춥니 다. 그런 다음 두 번째 오일 시린지 펌프를 시작하고 흐름 체제가 안정 될 때까지 기다립니다. 배출 튜브를 수집 용기에 넣고 방사 조도가 센티미터 제곱당 900-1000 밀리 와트 범위가되도록 UV 조사 시스템을 설정하십시오.
그리고 조사 지점은 출구 앞의 직선 채널 부분입니다. UV 조사 전에 프리폴리머와 제1 오일의 유량을 조정하여 3.0에서 4.5 범위에서 원하는 종횡비를 달성하고 조사 지점의 크기에 따라 분산상의 조사 시간을 약 2.3초로 설정합니다. 그런 다음 UV 조사를 시작하고 필요한 경우 이전 하위 섹션에 따라 유량을 다시 조정하십시오.
다음으로, 수집 컨테이너를 변경하고 제품 수집 시작 시간 및 유량을 기록해 둡니다. 수집을 종료하려면 시간을 기록한 컬렉션 컨테이너를 제거합니다. 그런 다음 조사와 모든 주사기 펌프를 중지하십시오.
이어서, 생성물을 n-헥산, 이소프로판올 및 탈이온수로 각각 5회 세척한다. 그런 다음 막대 침강 후 상청액을 제거하십시오. 제 1 성분 분산액을 원추형 1.5 또는 2 밀리리터 투명 바이알에 옮깁니다.
그런 다음 100 마이크로 리터 피펫으로 연속 작동으로 제어 된 방식으로 두 번째 구성 요소를 추가하고 피펫을 사용하여 내용물을 직접 혼합하여 액체를 흡수하고 다시 첨가하십시오. 그런 다음 G R G D S P C 용액을 상호 연결된 구조에 추가하여 나머지 모든 에폭시기를 유리 아민과 티알이 함유된 세포 접착 펩티드로 변형시키고 실온에서 밤새 방치합니다. 다음으로, 탈이온수로 세척하여 미반응 분자를 제거하고 상층액을 제거한다.
수위를 줄인 후 바이알을 열고 250-300 나노 미터 파장의 자외선으로 방사합니다. 그런 다음 바이알을 닫고 바이알을 깨끗한 벤치로 옮깁니다. 그런 다음 멸균 된 물로 씻으십시오.
바이알의 물을 세포 배양 배지로 교체하고 5분 동안 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 다음으로, 매크로 다공성 스캐폴드를 세포 배양 웰 플레이트에 주입하거나 주걱을 사용하여 실험한다. 컨포칼 현미경 검사 결과 3D 매크로 다공성 구조물이 상호 연결된 아민과 에폭시 기능화된 마이크로 겔 로드로 구성되었음을 알 수 있었습니다.
이 구조물은 2 초 또는 3 초 내에 형성된 약 10, 000 개의 마이크로 겔 막대의 컴팩트 한 형상을 나타냅니다. 아민 및 에폭시 마이크로 겔 구체와 함께 아민 및 에폭시 마이크로 겔 막대의 효과적인 영률은 나노 압입에 의해 측정됩니다. 활성 작용기를 검출하기 위해, 플루오레세인 이소티오시아네이트는 1차 아미노기를 가시화하는데 사용될 수 있고, 플루오레세인 아민 이성질체는 에폭시기를 표지하는데 사용될 수 있다.
아민 마이크로 겔 막대는 탈 이온수에서 평균 길이가 553 마이크로 미터이고 평균 너비가 193 마이크로 미터 인 치수를 가지며 종횡비는 약 3.0입니다. 매크로 기공과 마이크로 겔 막대로 구성된 비계의 평균값은 100 마이크로 미터이며 기공 크기의 90 %는 30 마이크로 미터에서 150 마이크로 미터 이상입니다. 마이크로 젤과 같은 구체는 약 10에서 55 마이크로 미터 사이의 기공 크기를 가진 클러스터를 생성하며 평균값은 약 22 마이크로 미터입니다.
설명된 마이크로겔 로드는 무작위 혼합에 의해 상호연결된 마이크로포어 스캐폴드를 생성하도록 설계된다. 제어 된 혼합 절차를 통해 미래에보다 맞춤화 된 스캐 폴드 형상을 제조 할 수 있습니다. 마이크로 젤의 강성과 생화학적 단서는 판매 요구 사항에 따라 달라질 수 있습니다.
서로 다른 빌딩 블록을 결합하여 하나의 스캐폴드 내에서 다양한 형상과 특성을 얻을 수 있습니다. 이렇게하면 특정 세포를 효율적으로 표적으로 삼아 다세포 조직을 형성 할 수 있습니다.
