This research was supported by a National Leading Research Laboratory Program (Grant NRF-2013R1A2A1A05006378) through the National Research Foundation of Korea funded by the Ministry of Science, ICT and Future Planning. The authors also acknowledge a KAIST Systems Healthcare Program.

1. Preparação da micropadronadas Moldes e hidrogéis <ol><li> Produzir os padrões de micro-escala desejada usando SU-8 fotorresistente na superfície de uma pastilha de silício através de um de dois passos 15,17 fotolitografia técnica padrão para a fundição de moldes de PDMS. O exemplo ilustrado utiliza um padrão de malha lóbulo semelhante fígado (Figura 1). </li><li> Pesar PDMS e uma solução de agente de cura com uma proporção de 1: 5 (isto é, 12,5 g de PDMS e 2,5 g de agente de cura). </li><li> Misturar a 15 g da solução exaustivamente, desgaseificar as bolhas numa câmara de vácuo, e depois espalhar a solução misturada sobre uma superfície micropadronadas da bolacha de silício uniformemente dentro de um prato de moldagem de folha. </li><li> Coloque a bolacha de silício sobre uma placa aquecida a 65 ° C durante 90 minutos sobre uma superfície plana para curar o PDMS. </li><li> Remover o PDMS curado a partir da placa de moldagem e a bolacha de silício. </li><li> Corte as bordas do PDMS e colocá-lo sobre uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro comDo lado de cima micropadronadas. </li><li> Lavar o PDMS curados micropadronadas na placa de petri usando etanol a 70% e água destilada para a esterilização primário. Em seguida, secá-las completamente durante 10 min numa estufa a 65 ° C. </li><li> Dissolve-se e mistura-O / N 3 g de um agente tensioactivo não iónico em pó em 100 ml de água destilada, a criação de um 3% (w / v) de solução de revestimento. </li><li> Colocar os moldes PDMS micropatterned em um aspirador de plasma e limpá-los durante 1 min (85 W, 0,73 mbar) para criar uma superfície hidrófila, a fim de facilitar a adição de líquidos aquosos. Em seguida, o revestimento da superfície do PDMS com a solução de 100 ml de agente tensioactivo, pelo menos, 3 h (ORO / N) utilizando um balancim laboratório. </li><li> Lava-se a solução de agente tensioactivo a partir dos moldes de PDMS e secá-las completamente num forno a 65 ° C durante 10 min. Em seguida, cada um dos moldes micropadronadas esterilizar por exposição a radiação ultravioleta (UV) ao longo de 30 min. </li></ol> 2. Preparar a suspensão de células num hidrogel Precursor <ol><li> Parapreparar hidrogel precursor, dissolver 0,1 g de alginato de sódio em pó em 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), a criação de um 1% (w / v) de alginato de precursor. Para dissolver completamente o pó, incubar e misturá-los O / N. </li><li> Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um ligado a uma seringa de 1 ml. </li><li> Cultura das células HepG2 em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina em um prato de cultura de tecidos convencional até 70% - 80% de confluência numa incubadora humidificada com 5% de CO2 a 37 ° C . </li><li> Lavar as células uma vez utilizando PBS, e em seguida, trypsinize-los por adição de 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA durante 4 minutos numa atmosfera de 5% de CO 2 a 37 incubadora humidificada ° C. Centrifugar as células colhidas a partir da placa de cultura a 250 xg durante 3 min e ressuspender utilizando 1 mL de PBS, após a remoção do sobrenadante. </li><li> Contar o número de células individuais distribuídos em PBS utilizando uma célula automatizadobalcão. </li><li> Após a centrifugação a 250 xg durante 3 minutos e remoção do PBS, adicionar 1 ml de 1% (w / v) da solução de alginato de sódio para o sedimento celular remanescente e misturá-las suavemente utilizando pipetagem. A densidade de sementeira final das células deve ser de 5 x 10 6 - 10 7 células / ml. Incubar a suspensão de células / hidrogel numa incubadora humidificada 5% CO 2 a 37 ° C. </li></ol> 3. Carregamento e Cross-linking de celular / Hidrogel Suspensão <ol><li> Dissolve-se 1,47 g de cloreto de cálcio desidratado em 100 ml de ddH2O para produzir um reagente de ligação cruzada (isto é, 100 mM CaCl2 · 2H 2 O em ddH2O). </li><li> Lave o interior de um umidificador com transdutor ultra-sônico usando 70% de etanol, e encha-o com 200 ml de reagente de reticulação. O umidificador é de 110 mm de largura, 300 mm de comprimento e 170 mm de profundidade (ou seja, 110 mm x 300 mm x 170 mm (W x H x D)). </li><li> Coloque os PDMS micropatternedmoldes em um aspirador de plasma e limpá-los durante 1 min a 85 W para criar uma superfície hidrófila. </li><li> Firmemente carregar 7,2 ul da suspensão de células / hidrogel bem misturado na borda do micropadrão no molde. O exemplo ilustrado utiliza um padrão de malha lóbulo semelhante fígado (Figura 1). O volume da suspensão depende do padrão topográfico. </li><li> Para conseguir a gelificação da suspensão de células / hidrogel, ligar o humidificador e verificar que o humidificador produz uma névoa do reagente de reticulação. Pulverizar o reagente de ligação cruzada para o precursor de hidrogel durante 5 min, cobrindo a superfície topográfica dos moldes PDMS no intervalo de 5 cm. Nota: distâncias mais longas e mais curtas do que 5 cm poderia provocar a gelificação incompleta e desigual, respectivamente. Assegure-se que o humidificador tem uma taxa de pulverização de 250 ml / h, produzindo 20 ml de névoa do reagente de reticulação em 5 min. </li><li> Após o processo de cross-linking, desligue o humidificador e encher o mo PDMSLDS com PBS. </li></ol> 4. Transporte de folhas soltas Modular de hidrogel <ol><li> Retire cada folha hidrogel endurecido a partir dos moldes micropatterned via pipetando PBS suavemente em torno da folha de hidrogel com uma pipeta de ponta de 200 mL. </li><li> Pegue cada folha hidrogel flutuante usando um 1000 ul final da ponteira de corte final. Cada malha folha hidrogel lóbulo-como fígado tem dimensões de 8 mm x 8,7 milímetros, e ser 100-200 mm de espessura. </li><li> Transferir uma única camada de folha de hidrogel em 1 ml de DMEM numa placa de 12 poços, e a cultura das células in vitro, de uma forma flutuante utilizando o hidrogel de construir como um componente de unidade na placa de 12 poços durante uma semana num 5 % de CO 2 humidificado incubadora a 37 ° C. Trocar o meio de cultura todos os dias. </li></ol> 5. Fichas de hidrogel Assembléia de multi-camadas <ol><li> Repita os passos 1.1 a 1.5 para produzir uma armação de PDMS com as dimensões de 18 mm x 18 mm x 4 mm (W xH x D), e que contém estruturas de 170 mícrons de alta pilar na superfície inferior. Use 42 g da mistura de PDMS e agente de cura, com a mesma proporção que no passo 1.2. Coloque um molde de policarbonato especializada no wafer de silício para o quadro de PDMS para criar um quadro interior com dimensões de 8 milímetros x 9 mm x 2 mm (W x H x D). </li><li> Esteriliza-se o quadro de PDMS e 180 mícrons de poros papéis de filtro de nylon submerso em água destilada e pinças numa autoclave durante 15 min a 121 ° C. </li><li> Colocar o PDMS quadro esterilizado para um quarto de um pedaço de papel de filtro de nylon (com um diâmetro de 5 cm) de um 60-mm de diâmetro prato de petri. </li><li> Transferir uma folha de hidrogel modular para o interior da armação de PDMS usando uma pipeta de ponta de 1.000 ul de corte final. As folhas de hidrogel utilizados para a montagem deve ser cultivadas por pelo menos um dia depois de terem sido fabricados. </li><li> Alinhe a borda de cada folha hidrogel modular com o quadro PDMS usando um vazio de 200 ul ponteira. </li><li> Repita os passos 5.4 e 5.5 usando folhas de hidrogel modulares para formar uma pilha de 4 - 6 camadas. </li><li> Remover o meio de cultura por ele flui para fora através das estruturas de pilar na parte inferior da armação de PDMS. Em seguida, adicionar 2 ml de solução de alginato a 2% (w / v) a um canto da construção de multi-camada. </li><li> Pulverizar uma névoa do reagente de reticulação durante 30 seg para a construção de multi-camadas para ligar as pontas de cada uma das camadas com as de outro. Utilizar 2 ml de névoa de o reagente de ligação cruzada (a uma taxa de pulverização de 250 ml / hr). </li><li> Lavar a construção de multi-camadas suavemente com 400 mL DMEM e retire a armação PDMS usando uma pinça. </li><li> Retire a construção de multi-camadas de papel de filtro limpando suavemente com uma célula levantador após a adição de 4 ml de DMEM. </li><li> Transferir a multi-camadas para construção de uma placa de 6 cavidades contendo 3 mL de DMEM utilizando papel de filtro, e as células de cultura in vitro de uma forma flutuante, com o hidrogel como construirum andaime celular multi-escala na placa de 6 poços durante uma semana numa incubadora humidificada 5% CO 2 a 37 ° C. Trocar o meio de cultura todos os dias. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Este protocolo proporciona um método simples de fabricar folhas de hidrogel modulares, e montá-los para formar suportes celulares 3D. Para construir estruturas claras de alginato modelado num curto espaço de tempo, que deverá identificar um processo de ligação cruzada que pode criar estruturas suficientemente rígida para manter os micropadrões complexas do molde, bem como a manter a viabilidade celular e metabolismo. Desenvolvemos um processo de reticulação, incluindo uma transição sol-gel, para pulverizar um agente de reticulação usando um humidificador, sob a forma de uma névoa. Sem este processo de reticulação, os padrões em micro-escala não pôde ser gerado sob a forma de um hidrogel fina construir com a profundidade limitada difusora (100 - 200 um), que tem elevada permeabilidade difusiva aos metabolitos e nutrientes. Além disso, em comparação com os métodos baseados em difusão existentes, que exigem 30 - 60 min, 18 - 20 a TI de reticulaçãome foi relativamente curto (3-5 min). Além disso, também foi difícil de manipular as folhas finas de hidrogel, que foram mecanicamente estável apenas em um meio líquido. Como mostrado na Figura 1, a estrutura fina foi hidrogel simplesmente e de forma estável tratadas e manipuladas usando uma ponta convencional de corte final para transfercia entre diferentes condições de cultura. Usando técnicas de geração e manipulação, podemos fornecer não apenas uma folha de camada única de uma maneira flutuante para aplicações potenciais em ensaios de medicamentos, mas estruturas multicamadas também empilhados, com aplicações potenciais como andaimes para construções de tecido-like. Arquitecturas celulares multi-camadas pode ser gerado por empilhamento das folhas de hidrogel de camada única modulares (Figura 3A). Cada folha de hidrogel modular pode conter diferentes tipos de células, e podem ser expostos a diferentes condições de cultura. Estas construções de multi-camada podem então ser selectivamente assesangrou. No entanto, folhas de hidrogel simplesmente empilhamento pode levar a necrose celular no interior da estrutura montada, quando a profundidade total excede a profundidade limitada por difusão (Figura 3C). Para superar este problema, seria necessário alinhar padrões Micromesh, tais como malhas lóbulo-como o fígado, quando as folhas de hidrogel de multi-camada são montados. Por conseguinte, requerem um quadro de PDMS com o mesmo padrão que a fronteira interior da folha de hidrogel para alinhar as folhas empilhadas de hidrogel. Assim, alinhados micropadrões buraco-de matriz nas folhas de hidrogel de malha montados pode ser utilizado para formar estruturas expandidas de condutas, facilitando o transporte de nutrientes mais eficiente para melhorar a viabilidade celular (Figura 3B). Uma limitação desta técnica é a ausência de interacções célula-matriz do hidrogel de alginato. Alginato não pode fornecer ligantes de adesão celular para in vivo -como interações célula-matriz; 21 no entanto, ele faz foraer efeitos mecânicos e geométricos como um encapsulando células andaime 3D com interacções célula-célula. Para as células primárias e as células-tronco, o alginato pode ser utilizado após a modificação com peptídeos contendo RGD-21, ou em combinação com colagénio ou gelatina. 14,18 Outra limitação é que, uma vez que as folhas de hidrogel incorporado-celulares são fabricados com baixa densidade celular inferior 5 x 10 6 células / ml, a construção da estrutura multi-camadas pode causar anexos fracas entre as folhas de hidrogel porque apenas a borda da estrutura é fixo através da utilização de alginato adicional. No entanto, as camadas podem ser empilhados de forma compacta, como uma única estrutura de andaime através de drenagem por baixo do chassis de PDMS. Além disso, uma maior densidade de células das folhas de hidrogel pode proliferar na superfície bem como dentro da camada depois de cultura de um dia, o que contribuiria anexos entre as camadas, como mostrado na Figura 3A. A fabrica folha de hidrogelção e à manipulação técnica descrita aqui pode ser adaptado para os sistemas de cultura in vitro e modelos celulares de tecido semelhante para proporcionar um microambiente in vivo -como para aplicações, incluindo ensaios celulares e órgãos artificiais de engenharia. Esta técnica pode ser aplicada a baseados em células Os ensaios biológicos e estudos de drogas que requerem geometricamente diferente micro e macro-ambientes 3D celular que incorporam diferentes tipos de células ou de hidrogel.

Os hidrogéis são particularmente promissores biomateriais, e espera-se ser importante na biologia de base, os ensaios farmacológicos e medicina. 1 Biofabrication celulares de construções à base de hidrogel foi sugerido para reduzir o uso de experiências com animais, 2,3 substituir tecidos transplantáveis, 4 e melhorar ensaios baseados em células. 5,6-di-hidro- (contendo água) materiais viscoelásticos (geles) permitir que um grande número de células a ser encapsulado e mantida em uma estrutura de andaime para controlar o microambiente celular 3D. Em combinação com a orientação de tecnologias de microfluidos ou micropatterning, a geometria das construções de hidrogel pode ser controlada com precisão à escala celular. Até à data, uma variedade de formas, incluindo hidrogéis de partículas, 7 - 9, fibras 10 - 12 folhas, e 13 - 15 foram utilizados como unidades de construção na ascendente aprodores para a fabricação de macro-escala arquitecturas multicelulares. Ambas as partículas e fibras à base de hidrogel ter sido facilmente e rapidamente fabricados para aplicações como ambientes celulares micro-escala, com controles fluídicos usando dispositivos microfluídicos. No entanto, como as unidades básicas de tecidos artificiais, seria complicado para reorganizá-las e para ampliar seu volume de construções de macro-escala. 16 É mais difícil de alcançar construções macro-dimensionado do que produzir módulos básicos de tamanho mícron-. Unidades do tipo folha de construções à base de hidrogel podem ser utilizadas para aumentar o volume de andaimes por meio de um processo de montagem simples. Consequentemente, as camadas de folhas empilhadas hidrogel proporcionar não só um aumento volumétrico, mas também uma extensão geométrica no espaço 3D. Temos anteriormente relatado um método de fabrico de folhas de hidrogel micropatterned, 13 - 15, juntamente com a sua montagem em multi-layarquiteturas celulares recer. A técnica permite micropatterning complexo e design modular de construções de celulares através de um processo de empilhamento de estruturas multi-camadas. Através do fabrico de folhas de hidrogel modulares empilhados, os quais são micropadronadas, um sistema de cultura de células em 3D com um microambiente celular de macro-escala controlada pode ser realizada. Este protocolo de vídeo descreve um método de fabrico simples mas eficiente que pode ser utilizado para a construção de folhas de hidrogel modulares, com base na linha de células de carcinoma de fígado humano (HepG2). Nós demonstramos aqui simples manipulação dessas folhas hidrogel modulares padronizados, e sua montagem em uma estrutura multi-camadas.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Powdered nonionic surfactant&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alginic acid sodium salt, low viscosity</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25266</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic humidifier</td><td>MediHeim</td><td>MH-2800</td><td>Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr</td></tr><tr><td>Nylon net filter hydrofilic, 180 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>NY8H04700</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate mold</td><td></td><td></td><td>Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern</td></tr></tbody></table>

construction of modular hydrogel sheets for micropatterned macro-scaled 3d cellular architecture

Os hidrogéis podem ser modelado na micro-escala utilizando tecnologias de microfluidos ou micropatterning para proporcionar uma geometria de tecido vivo -like (3D) tridimensional. As construções resultantes celulares baseados em hidrogel 3D foram introduzidos como uma alternativa para as experiências com animais para estudos biológicos avançados, os ensaios farmacológicos e as aplicações de transplantes de órgãos. Embora as partículas e fibras à base de hidrogel pode ser facilmente fabricado, é difícil para manipulá-los para a reconstrução de tecidos. Neste vídeo, nós descrevemos um método de fabrico de folhas de hidrogel de alginato micropatterned, juntamente com a sua montagem para formar um sistema de cultura celular 3D macro-escala com um microambiente celular controlada. Utilizando uma forma de névoa do agente gelificante de cálcio, folhas finas de hidrogel são facilmente gerado com uma espessura na gama de 100 - 200 um, e com micropadrões precisas. As células podem ser cultivadas, em seguida, com a orientação geométrica das folhas de hidrogel emcondições independentes. Além disso, as folhas de hidrogel pode ser prontamente manipulada utilizando uma micropipeta com uma ponta de corte final, e podem ser montados em estruturas de camadas múltiplas por empilhá-los utilizando um polidimetilsiloxano modelado (PDMS) moldura. Estas folhas de hidrogel modular, que pode ser fabricado usando um processo fácil, têm potenciais aplicações de ensaios in vitro e estudos biológicos de drogas, incluindo estudos funcionais de micro- e macro-estrutura e a reconstrução de tecidos.

Nós descrevemos a fabricação e manipulação de autônomo folhas hidrogel celulares. Como mostrado na Figura 1, nos moldes fabricados micropatterned PDMS, e hidrogel contendo as células foi carregada na superfície hidrofílica destas moldes e reticulada usando um humidificador para gerar uma névoa de aerossol de agente gelificante. Após libertação dos moldes, as células HepG2 foram cultivadas em folhas independentes de hidrogel com diferentes padrões (Figura 2). Assim, as folhas finas de hidrogel proporcionado um ambiente de cultura 3D. Além disso, as folhas de hidrogel modulares podem ser montados por camadas das folhas utilizando uma micropipeta com uma ponta de corte final, e utilizando uma moldura de PDMS, o que permite a cultura de células 3D macro-escala (Figura 3). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxo Chart Mostrando a fabricação de uma folha de hidrogel e Fichas de hidrogel Multi-camada. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53475/53475fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig2.jpg" /> Figura 2. Independente 3D Cultura celular em diversas folhas de hidrogel. O método de fabricação de pulverização reagente de ligação cruzada activado modelação exacta de hidrogel de alginato na micro-escala. Além disso, as folhas de hidrogel fabricadas poderia ser colhida a partir do molde e facilmente manipulado em condições independentes. As células HepG2 foram cultivadas em modelado e uma folha plana de hidrogel (A), as folhas de hidrogel com pilares hexagonais (B), (C) de malha, malha-lóbulo do fígado como (D), uma matriz de furos (E), e multiple microcomb-like microfibras (F). As barras de escala são os seguintes:. 500 mm (A, D, F), 100 mm (B, C), e 2 mm (E) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53475/53475fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig3.jpg" /> Figura 3. Assembleia da micropatterned Folhas de hidrogel para Macro escala celulares Construções. Vários tipos de folha de hidrogel pode ser montado através de empilhamento camada por camada, com o alinhamento, incluindo a montagem de cinco folhas de hidrogel contendo células HepG2 coradas com fluorescência verde e células NIH3T3 coradas com fluorescência vermelha (A). Um conjunto de folhas de hidrogel micropatterned com estrutura gasoduto expandido (B) proporcionou maior viabilidade celular thaN o de folhas de hidrogel não estampados (C) após 7 dias. A viabilidade foi avaliada por coloração das células HepG2 com calceina-AM (células vivas mostrados como verde) e de etídio homodímero-1 (células mortas mostrados como vermelho). Barras de escala:. 500 mm (A) e 200 mm (B, C) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53475/53475fig3large.jpg" target="_blank">​​Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Construção de Fichas de hidrogel modular para micropadronadas Macro-escalado 3D Cellular Arquitetura

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K visualizações.  Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment. 

Vídeo: Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

Fabricação de hidrogéis micropatterned para Sistemas de Cultura Neural usando fotolitografia Projeção Dinâmica Máscara

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Bioengenharia

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

Fácil manipulação das arquiteturas em hidrogel à base de proteínas para aplicações de cultura de células

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Bioquímica

Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact bioprinting1-4 (extrusion, dip pen and soft lithography), contactless bioprinting5-7 (laser forward transfer, ink-jet deposition) and laser based techniques such as two photon photopolymerization8. It can be used for many applications such as tissue engineering9-13, biosensor microfabrication14-16 and as a tool to answer basic biological questions such as influences of co-culturing of different cell types17. Unlike common photolithographic or soft-lithographic methods, extrusion bioprinting has the advantage that it does not require a separate mask or stamp. Using CAD software, the design of the structure can quickly be changed and adjusted according to the requirements of the operator. This makes bioprinting more flexible than lithography-based approaches.
Here we demonstrate the printing of a sacrificial mold to create a multi-material 3D structure using an array of pillars within a hydrogel as an example. These pillars could represent hollow structures for a vascular network or the tubes within a nerve guide conduit. The material chosen for the sacrificial mold was poloxamer 407, a thermoresponsive polymer with excellent printing properties which is liquid at 4 &deg;C and a solid above its gelation temperature ~20 &deg;C for 24.5% w/v solutions18. This property allows the poloxamer-based sacrificial mold to be eluted on demand and has advantages over the slow dissolution of a solid material especially for narrow geometries. Poloxamer was printed on microscope glass slides to create the sacrificial mold. Agarose was pipetted into the mold and cooled until gelation. After elution of the poloxamer in ice cold water, the voids in the agarose mold were filled with alginate methacrylate spiked with FITC labeled fibrinogen. The filled voids were then cross-linked with UV and the construct was imaged with an epi-fluorescence microscope.

A bioprinter was used to create patterned hydrogels based on a sacrificial mold. The poloxamer mold was backfilled with a second hydrogel and then eluted, leaving voids which were filled with a third hydrogel. This method uses fast elution and good printability of poloxamer to generate complex architectures from biopolymers.

Impressão de Moldes reversa Thermoresponsive para a Criação de Patterned hidrogéis de dois componentes para Cultura de Células em 3D

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

Imunologia e Infecção

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single strain-induced cellular alignment on a cell-laden hydrogel by using complex experimental processes and mass controlling systems, which are usually associated with contamination issues. Thus, in this article, we propose a simple approach to building a gradient static strain using a fluidic chip with a plastic PDMS cover and a UV transparent glass substrate for the stimulation of cellular behavior in a 3D hydrogel. Overloading photo-patternable cell prepolymer in the fluidic chamber can generate a convex curved PDMS membrane on the cover. After UV crosslinking, through a concentric circular micropattern under the curved PDMS membrane, and buffer washing, a microenvironment for investigating cell behaviors under a variety of gradient strains is self-established in a single fluidic chip, without external instruments. NIH3T3 cells were demonstrated after observing the change in the cellular alignment trend under geometry guidance, in cooperation with strain stimulation, which varied from 15 - 65% on hydrogels. After a 3-day incubation, the hydrogel geometry dominated the cell alignment under low compressive strain, where cells aligned along the hydrogel elongation direction under high compressive strain. Between these, the cells showed random alignment due to the dissipation of the radical guidance of hydrogel elongation and the geometry guidance of the patterned hydrogel.

This article introduces a simple approach to providing non-continuous gradient static strains on a concentric cell-laden hydrogel to regulate cell alignment for tissue engineering.

Gradiente de pressão Chip para estimulantes comportamentos celulares em hidrogel de célula-carregado

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formação Light-mediada e padronização de hidrogéis para aplicações de cultura celular

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Um método versátil de padronização proteínas e células

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

An Additive Manufacturing Technique for the Facile and Rapid Fabrication of Hydrogel-based Micromachines with Magnetically Responsive Components

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels have simple monolithic architectures and often function as scaffolding materials for tissue engineering applications. More sophisticated structures typically take a long time to fabricate and do not contain moving components. This protocol describes a photolithography method that allows for facile and rapid microfabrication of PEG structures and devices. This strategy involves an in-house developed fabrication stage that allows for the rapid fabrication of 3D structures by building upwards in a layer-by-layer fashion. Independent moving components can also be aligned and assembled onto support structures to form integrated devices. These independent components are doped with superparamagnetic iron oxide nanoparticles that are sensitive to magnetic actuation. In this manner, the fabricated devices can be actuated using external magnets to yield movement of the components within. Hence, this technique allows for the fabrication of sophisticated MEMS-like devices (micromachines) that are composed entirely out of a biocompatible hydrogel, able to function without an onboard power source, and respond to a contact-less method of actuation. This manuscript describes the fabrication of both the fabrication set-up as well as the step-by-step method for the microfabrication of these hydrogels-based MEMS-like devices.

An additive manufacturing strategy for processing UV-crosslinkable hydrogels has been developed. This strategy allows for the layer-by-layer assembly of microfabricated hydrogel structures as well as the assembly of independent components, yielding integrated devices containing moving components that are responsive to magnetic actuation.

Um aditivo fabricação técnica para a preparação fácil e rápida de Micromachines baseada em hidrogel com componentes magneticamente responsivos

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its restrictions. Producing few repeatable results of pattern formation deteriorates the analysis of the mechanisms underlying the self-organization. Reducing variation in initial culture conditions, such as the cell density and distribution in the extracellular matrix (ECM), is crucial to enhance the repeatability of a 3D culture. In this article, we demonstrate a simple but robust procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain highly repeatable pattern formations. A micromold with a desired shape was fabricated by using photolithography or a machining process, and it formed a 3D pocket in the ECM contained in a hybrid gel cube (HGC). Highly concentrated cells were then injected in the pocket so that the cell cluster shape matched with the fabricated mold shape. The employed HGC allowed multi-directional scanning by its rotation, which enabled high-resolution imaging and the capture of the entire tissue structure even though a low-magnification lens was used. Normal human bronchial epithelial cells were used to demonstrate the methodology.&#160;

We present a procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain a repeatable pattern formation. A cubic device containing two different hydrogels is employed to achieve multi-directional imaging for tissue pattern formation.

Controle de Cluster inicial célula 3D em um dispositivo de cubo híbrido Gel para formações padrão repetitivo

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

Protocolos de bioimpressão 3D de bioinks baseados em hidrogel de gelatina

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions without further additives. Continuous photoinitiated on-chip gelation enables variation of the microgel aspect ratio, which determines the building block properties for the obtained constructs. Glycidyl methacrylate (GMA) or 2-aminoethyl methacrylate (AMA) monomers are copolymerized into the microgel network based on polyethylene glycol (PEG) star-polymers to achieve either epoxy or amine functionality. A focusing oil flow is introduced into the microfluidic outlet structure to ensure continuous collection of the functionalized microgel rods. Based on a recent publication, microgel rod-based constructs result in larger pores of several hundred micrometers and, at the same time, lead to overall higher scaffold stability in comparison to a spherical-based model. In this way, it is possible to produce higher-volume constructs with more free volume while reducing the amount of material required. The interlinked macroporous scaffolds can be picked up and transported without damage or disintegration. Amine and epoxy groups not involved in interlinking remain active and can be used independently for post-modification. This protocol describes an optimized method for the fabrication of microgel rods to form macroporous interlinked scaffolds that can be utilized for subsequent cell experiments.

Microgel rods with complementary reactive groups are produced via microfluidics with the ability to interlink in aqueous solution. The anisometric microgels jam and interlink into stable constructs with larger pores compared to spherical-based systems. Microgels modified with GRGDS-PC form macroporous 3D constructs that can be used for cell culture.

Andaimes 3D macroporosos interligados de hastes de microgel

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...