Name: measuring local anaphylaxis in mice
Uploaded: 2014-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
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The authors would like to acknowledge Dr. Ellen M. Fox for her work regarding this model of local anaphylaxis. This work was supported by the Uniformed Services University of the Health Sciences grant number R073UE.

1 민감 마우스 <ol><li> 20 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 1X PBS에 희석하여 OVA OVA 스톡 용액을 준비한다. 향후 사용을 위해 -80 ° C에서 cryovials 및 저장소에 분주을 동결. </li><li> 실온으로 20 ㎎ / ㎖ OVA 스톡 하나 이상의 분취 량을 준비한다. 모자 5 ㎖ 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 1X PBS에 희석 OVA. 소용돌이 간략하게 혼합한다. </li><li> : 1 비율 중속 설정 와류에 1 ㎎ / ㎖ OVA 함유 폴리스티렌 튜브 채 하나를 생성하기 위해 상기 튜브를 와동 계속하면서, 완전히 균질 Imject 명반 (40 ㎎ / ㎖)을 적하의 동량을 추가 면역원에 명반. </li><li> 소용돌이에 튜브 및 테이프 튜브에 뚜껑을 놓습니다. 낮은 설정에 소용돌이를 켜고 OVA가 30 분 동안 졸업생을 흡수 할 수 있습니다. <ol><li> 시간 많은 양의 OVA / 졸업생을 준비하고 쥐를 민감 사이를 통과하는 것을 허용하지 마십시오. 과민 반응은 OVA / 졸업생 후에는 준비를 직접 완료 할 수없는 경우상온에서 이온, 저장 OVA / 명반. 사용하기 전에 1 분 동안 소용돌이. </li></ol></li><li> OVA / 졸업생 혼합물과 함께 1 ml의 인슐린 주사기를로드합니다. 27 게이지 바늘과 주사기를 씌우고. </li><li> OVA의 50 μg 및 졸업생의 2 mg을 마우스 당 복용량 BALB / c 마우스의 복막에 OVA / 졸업생의 100 μl를 주입한다. </li><li> 음성 대조군의 경우, PBS에 쥐의 또 다른 그룹을 민감. OVA를 생략, 위에 나열된와 동일한 방식으로 졸업생과 PBS의 1 : 1 혼합물 일을 준비합니다. </li><li> 3 주사 총 삼주에 대한 일주일에 한 번 모든 마우스 (OVA와 PBS 제어) 민감. 최종 주입 한 후, 지역 아나필락시스 분석을 수행하기 전에 적어도 이주를 기다립니다. </li></ol> 2 지역 아나필락시스 분석 <ol><li> 실내 온도 OVA 원액을 가져와. (: 1X PBS에 희석 OVA 4 1) 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에, PBS 5 ㎎ / ㎖의 최종 농도 20 ㎎ / ㎖ OVA 스톡을 희석한다. 소용돌이 간략하게 혼합한다. </li><li> RC 2 &lt;사용하여 마우스를 마취/ SUP&gt; 설치류 마취 시스템 (또는 동등한 기화 전달 시스템). 이소 플루 란과 저수지를 채우고 O 2 공기 흐름을 켭니다. 유도 챔버에 넣어 마우스와는 마취를 시작하는 5 % 이소 플루 란 조절 다이얼을 조절합니다. 생쥐가 완전히 마취되면, 이동성의 부족에 의해 지시 깊은 마취를 유지하도록 3 % 이소 플루 란으로 제어 다이얼을 조정한다. 이 절차에서 마취의 목적은 동물을 고정화하는 것이다. 귀와 꼬리 정맥 주사는 동물에 심각한 통증이나 고통을 유발하지 않습니다. 참고 : 아이소 플루 란 인간의 생식 시스템에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 배기 가스를 중화 환기가 잘되는 방에서 사용하고 유도 챔버에 청소 통을 첨부해야합니다. 이소 플루 란을 사용하는 동안 임신 한 경우 노출을 최소화하기 위해 카본 필터 마스크를 착용하십시오. </li><li> 로드 31 G 바늘로 덮인 10.3 cc의 인슐린 주사기로 5 ㎎ / ㎖ OVA의 10 μL. 10 μL와 또 다른 10.3 cc의 인슐린 주사기를로드의 1X PBS. </li><li> 해부 현미경을 사용하여, OVA의 50 μg의 도전 복용량 마취 마우스 오른쪽 귀에 OVA의 10 μl를 주입. 기타 용량은 같은 20 μg으로도 허용됩니다. <ol><li> 15 ML 원뿔 튜브 주위에 스카치 테이프 (접착면을 위로) 포장, 사출에 귀를 안정화합니다. 테이프에 오른쪽 손잡이의 등 쪽을 고정합니다. 귀의 두 잎 사이에 바늘 베벨 쪽을 삽입합니다. 천천히 모든 혈관을 칠 않도록주의하면서 귀 조직의 중심으로 OVA를 주입. </li></ol></li><li> 상술 한 바와 같은 방법을 사용하여, 음성 대조군으로서 왼쪽 귀에 10 ㎕의 PBS를 주입. </li><li> 3 분을 기다립니다. <ol><li> 이 시간 동안, 저 지부에 마우스를 위치시키고 1 분 혈관을 팽창하기위한 열 램프 하에서 나 온수 욕에서 꼬리를 잡아. </li></ol></li><li> 천천히 꼬리 V로 0.5 % 에반스 블루 염료의 200 μl를 주입, 27 G 바늘로 덮인 1 ml의 인슐린 주사기를 사용하여마우스의 EIN. 전체 200 μL 전에 용기 구조를 파괴 할 수있다 급속 주사 투여된다. 이 경우, 꼬리의 반대측에 정맥에 염료의 잔량을 주입하도록 시도한다. </li><li> 10 분을 기다립니다. </li><li> 마우스를 안락사와 집게 및 수술 가위를 사용하여 두 귀를 제거합니다. <ol><li> 어떠한 압력이 귀 중심에 주사 부위에 적용되지 않는 것을 확인하고, 겸자와 귀의 가장자리를 잡아. 주변 절단함으로써 최대한 귀 조직을 제거 아니지만 통해 귀 연골 기지 존재 릿지. 모피의 소량 절제 귀 존재할 수있다; 이 분석에 영향을 미치지 않습니다. </li></ol></li><li> 나누어지는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 포름 아미드 700 μL. 귀 당 하나의 튜브 (마우스 당 두 개의 튜브)를 준비합니다. 참고 : 포름 아미드가, 기형 돌연변이, 및 자극이다. 장갑, 보안경 및 안면 보호구를 착용 할 것. 취급시 임산부는주의해야합니다의 포름 아미드가 태아 독성이 될 수 있습니다. </li><li> , 포름 아미드 튜브를 모자, 그리고 63 ° C로 설정 건열 화장실에서 하룻밤 배양 귀를 추가합니다. 귀는 여전히 배양 후에 약간 푸른 나타날 수 있습니다; 그러나 염료의 대부분 포름으로 추출한다. </li><li> 96 웰 플레이트에, 중복, 각 샘플의 300 μl를 추가합니다. 이 샘플에 존재하는 경우 모피 전사 피한다. 우물에 존재하는 기포가 없는지 그들은 흡광도 판독에 영향을 미칠 것으로 확인합니다. </li><li> 96 웰 플레이트에, 중복, 포름 아미드 300 μl를 추가합니다. 이 우물은 공백으로 사용됩니다. </li><li> 620 nm에서 흡광도를 측정하는 분광 광도계를 사용한다. 각 샘플 독서에서 빼기 포름 아미드 우물. 참고 : 모든 실험 군인 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

알레르기 질환의 많은 마커기도 도전의 설정에서 기관지 유체에 순환 히스타민의 Th2 사이토 카인의 생산, 세포 모집의 수준의 변화를 포함하여 알레르기 항원의 반칙으로 알레르기 반응의 강도를 평가하는 데 사용됩니다. 이러한 매개 변수에 변화를 모니터링하는 알레르기 반응을 연구하는 것도 중요하지만, 생물학적 마커는 항상 임상 알레르기 질환과 상관 관계가 없습니다. 이 프로토콜에 설명 된 지역 아나필락시스 분석은 현지화 된 알레르기 질환에 대한 상관 관계를 지역화 된 혈관 투과성의 재생 가능한 측정을 제공합니다. 파란색 염료의 혈관 외 유출을 사용하여,이 프로토콜은 시각화 및 지역화 알레르기 반응의 상대 정량을 모두 할 수 있습니다. 임상 스코어링에 의존 알레르기 분석법 달리 (분광 광도계로 측정 한 흡광도 청색 염료 넘쳐)이 분석의 일차 결과 쉽게 관찰자 편의를 실시하지 않는다. 또 다른 ADVAntage 동물이 잠재적으로 알레르기 항원의 도전과 염료 관리로 인한 불편을 제한, 곧 공격 후 안락사된다는 것입니다. 아키야마 외. (10)에 의해 설명 된 휴대용 분광 광도계의 사용 대안은 혈관 투과성의 변화의 연속 측정을 허용한다. 그러나 에반스 블루 염료는 독성 및 주입은 궁극적으로 동물이 안락사 할 필요가 이어질 것입니다. 이 분석은 장점을 가지고 있지만, 어느 정도 기술적 인 도전의 한계를 가지고있다. 신뢰할 수있는 결과는 일관되고 성공적인 귀와 꼬리 정맥 주사에​​ 의존한다. 전체 도전 도즈가 귀에 투여되지 않으면 에반스 블루 정맥 주사가 완료되지 않은 경우, 혈관의 명백한 천자 귀 주입의 결과는, 또는, 동물은 분석에서 제외해야하는지 여부. 우리 연구실에서 연구자들은 세비에 대한 피내 귀 주사를 연습해야했다능력을 개발하기 전에 RAL 주. 또한,이 분석을위한 적절한 제어를 실행하는 것이 중요하다. 동물 바늘 삽입으로 인한 손상에 약간 다르게 반응하는 것 구체적으로, PBS 주입은 정기적으로 내부 대조군으로 사용되어야한다. PBS 독서는 분사 자체에 의해 유도 된 혈관 투과성의 변화에​​ 대한 기준선 측정을 제공합니다. 귀에 피내 주사를 사용하는 대신에, 분석은 또한 마우스의 뒤쪽 피부에 도포 될 수있다. 조사자는 또한, 동시에 여러 항원 테스트를 허용,이 경로는 덜 기술적으로 어려운 것으로 발견하고있다. 도전 도즈가 실험에 따라 조작 될 수있는 로컬 아나필락시스 분석은, 매우 다재다능하다. 이 알레르기 반응의 변화를보고 할 필요가있는 경우, 이러한 20 μg 같은 저급 OVA 챌린지 도즈를 사용하는 것이 유리할 수있다. 이 같은 흡광도 변화를 모니터링의 감도를 증가 수 있습니다그것은 세포 활성화에 대한 포화 점에 도달 될 것임을 거의 없을 것이다. 또한,이 분석은 수동적 피부 아나필락시스 (PCA)를 연구하기 위해 사용될 수있다. 이 설정에서, 항원 특이 IgE은 다른에 한쪽 귀를 차량에 주입된다. 24 시간 후, 동물 항원 에반스 블루 염료의 정맥 도전을 주어집니다. PCA 모델은 실험 동물의 사용 개수를 완료하는 데 걸리는 시간을 단축하고, 연구자들은 IgE의 가교 결합의 특정 효과를 볼 수 있도록 할 수있다. 이상을 복용 수행에도 불구하고,이 문서에 설명 된 활성 피부 아나필락시스 (ACA) 모델을 사용하는 몇 가지 이점이 있습니다. 과민성은 보통 전신이고 사람들은 일반적으로 순환 알레르겐 - 특이 IgE 및 IgG를 모두 가지고 주간 노출되면 과민 반응은 모방 개인에게 알레르기 질환을 개발하는 과정을 항원. IgE의 가교는 MA의 기본 수단이지만성 세포 탈과립, 비만 세포는 또한 IgG의 가교 반응한다. 연구자 만의 IgE가 매개 질환 외에도 알러지 반응의 메커니즘을 조사하기 때문에, ACA 모델을 허용한다. 사용 감작 방법은 연구자의 판단 동안 결론적으로, 로컬 아나필락시스 분석은 다목적이고 감작 다양한 방법론 함께 사용될 수있다. 귀 부종, 알레르기 반응을 평가하기위한 일반적으로 사용되는 마커는 또한 OVA의 공격 후 측정 할 수있다. 우리는 OVA로 도전 귀를 1 시간 후 분사에 PBS와 도전 귀보다 훨씬 더 붓기가 있음을 발견 하였다. 에반스 블루 시험 대조적으로, 우리는 측정이 넘쳐 염료 및 측정 장치를 사용할 때 귀 두께 귀의 압축에 의해 변경 될 수 있기 때문에 연구자들 사이에 큰 변동을 나타내고보다 덜 민감하다 그 귀 두께를 관찰했다. 마우스가 아닌 다른 균주BALB / C는 로컬 아나필락시스 분석에 사용될 수있다; 그러나 흡광도 판독에 사용되는 균주에 따라 다소 차이가 있습니다. 강한은 Th2 반응을 개발하기 위해 자신의 성향 때문에, BALB / c 마우스는 일반적으로이 분석과 신뢰성, 재현성 측정을 생산하고 있습니다. 이 분석은 다양한 항원에 감작 동물에서 국소 알레르기 반응의 정량을 허용한다. 분석은 성공적으로 OVA와 키홀 삿갓 조개 헤 모시 아닌 (KLH)과 같은 일반적인 알레르겐, 수행 된 항원으로서 선택은, 유연하다. 또한, 감작 대신에, 로컬 알레르기 반응은 항체를 주입함으로써 순진한 동물에서 유도 할 수 호염기구와 비만 세포에 가교 IgE 항체 또는 IgE의 수용체 또는 CD200R3 한 이들 세포에 비 - 면역 글로불린 활성화 수용체를 결찰에 의하여 .

타입 I의 과민 반응은 비만 세포와 호염기구의 표면에 IgE 항체의 항원 - 유도 된 가교 결합에 의해 매개된다. 이 세포의 탈과립과 히스타민, 트립 타제 및 혈소판 활성화 인자 (2)와 같은 혈관 작용 및 염증 매개 물질의 방출에 발생합니다. 탈과립 동안 예비 성형 매개 물질의 방출에 이어, 비만 세포는 합성하고 또한 혈관 투과성 3을 증가하는 프로스타글란딘과 류코트리엔을 놓습니다. 초기 임상 반응이 급격히 발생하여 &quot;즉각적인 반응&quot;이라한다. 피부에, 피부 발진 및 플레어 반응은 항원 도전 분 이내에 쉽게 볼 수 있습니다. 도전 복용량에 따라, &quot;늦은 위상 응답&quot;몇 시간 후를 관찰하는 것이 가능하다. 후기의 부종은 조직이로 현지화 부종 및 백혈구 모집 때문이다. 히스타민, 일반적에 참여 주요 매개체로 간주즉각적인 알레르기 반응은, 한 (HR1)의 선박과 히스타민 수용체 2 (HR2) 평활근에 표현에 표현 된 히스타민 수용체에 작용한다. 결합 된 효과는 염증 넷의 사이트에서 혈액의 흐름과 혈관 투과성을 증가시킨다. 알레르기 동물 모델의 다양한 알레르기 성 천식, 전신성 아나필락시스, 지역 과민증의 모델을 포함한 알러지 염증과 관련된 기전을 연구하기 위해 개발되었다. 정맥 염료 관리는 출판물이 1920 년대 5로 다시이 기술 데이트를 기술로, 거의 한 세기에 대 한 동물 모델에서 지역화 된 알레르기 반응을 측정하는 데 사용되었다. 토끼, 기니피그 즉각적인 과민성 반응을 검사하는 데 사용되는 제 동물 모델이었으며, 가장 민감한 반응은 일반적으로 귀 5,6에서 발견되었다. 분석은 이후 래트 (7) 및 마우스 (8)에 사용하기 위해 유효 하였다. 역사적으로,실험 다양한 방법 전에 염료를 주입, 염료를 주입하기 전에 항원의 주입에 항원을 주입하고, 염료 및 항원의 동시 분사로 사용되었다. 알레르기 반응을 측정하기위한 수단으로서 염료 정맥 투여는 수동, 활성 측정에 사용하고, 수동적 반응 5,9 반전 될 수있는 다목적 분석이다. 수많은 염료 트리 판 블루, Pontamine 스카이 블루, 에반스 블루,이기 블루 536, 인도 잉크 5,6,9 포함 알레르기 반응을 평가하기 위해 사용되었다. 0.5 % 에반스 블루의 용액은 현재 피부에 알레르기 반응을 측정하기 위해 사용되는 표준 염료이다. 도전에 대한 아나필락시스 반응은 과도하다; 최대 강도 (10) 내에 도달 - 염료 주입 15 분, 염료에 관계없이 구에 사용되는 동물 종, 공격 후 30 분을 투여하는 경우에는 반응은 볼 수 없습니다. 염료의 혈관 외 유출의 정량화는 원래이었다LY 파란색 염료 7-9으로 표시된 바와 같이 팽진 크기를 측정하여 얻을 수 있습니다. 또한 degranulated 비만 세포의 수는 반응 부위에서 피부 조직을 절개하고 7 톨루이딘 블루 염색에 의해 정량화 될 수있다. 비만 세포는 높은 친화도의 IgE 수용체 FcεRI를 발현 주요 지방 세포 집단 마찬가지로 비만 세포 탈과립은 종종 피부, IgE 매개 알레르기 반응을위한 마커로서 사용된다. 조직 염색에 넘쳐 분광 광도 측정을위한 기술은 1990 년 10 래트 및 마우스 (11)의 수동적 피부 아나필락시스 (PCA)를 위해 개발되었다. 다음 지역 아나필락시스 분석 프로토콜. 코지마 외에서 1을 적용하고, 알레르기 반응을 이끌어 내기위한 항원으로 닭 계란 난백 알부민 (OVA)를 사용 하였다. 그러나, 원한다면 이외 OVA 항원을 사용할 수있다. 분석은 다음 permeabilit 혈관의 변화를 모니터하는 에반스 블루 염료를 사용세포의 IgE 가교 및 히스타민의 방출을 비만으로 인해 발생하는 y를 입력합니다.

<table><tbody><tr><td>BALB/c Mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>651</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Quality Biologic</td><td>114-058-101</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>Sigma</td><td>A5503-10G</td><td></td></tr><tr><td>Imject Alum</td><td>Thermo Scientific</td><td>77161</td><td>Mix thoroughly before use</td></tr><tr><td>Evans Blue Dye</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>295876</td><td>99%+ Spectrophotometric grade</td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-474-06</td><td></td></tr><tr><td>1cc Insulin syringes</td><td>BD</td><td>329654</td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle</td><td>Terumo</td><td>NDC 100861</td><td></td></tr><tr><td>27 G Needles</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>F.S.T.</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>F.S.T.</td><td>14070-12</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene round-bottom tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge tubes</td><td>Medical Supply Partners</td><td>15-1151</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottom 96 well plate</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Rodent Anesthesia System</td><td>VetEquip</td><td>922100</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Model G560 with 3 inch platform</td></tr></tbody></table>

measuring local anaphylaxis in mice

알레르기 반응은 비만 세포 및 호염기구, 및 혈관 작용 및 염증 매개체의 후속 릴리스의 활성화의 결과이다. 감작 된 개인의 알레르기 항원에 노출되면 약간의 홍반에서 생명을 위협하는 아나필락시스까지 다양 임상 증상이 발생할 수 있습니다. 실험실에서, 다양한 동물 모델은 알레르기 반응을 구동 메커니즘을 이해하기 위해 개발되었다. 여기서, 우리는 지역화 알레르기 반응을 정량화 혈관 투과성의 변화를 측정하기위한 자세한 방법을 설명합니다. 지역 아나필락시스 분석은 첫째 1920 년대에보고하고, 코지마 외 출판 기술에서 적응하고있다. 2007 년 한.이 분석에서, OVA로 감작 마우스는 차량 왼쪽 귀에 및 OVA와 오른쪽 귀에 도전한다. 이것은 에반스 블루 염료의 정맥 내 주사에 의해 이어진다. 텐 분 에반스 블루를 주입 한 후, 동물은 extravasated에있다 염료 안락사되고귀에 포름 아미드 하룻밤 추출된다. 추출 염료의 흡광도 후 분광 광도계 정량화된다. 이 방법은 확실하게 지역의 알레르기 반응의 시각 및 정량화 할 수있는 징후가 발생합니다.

성공적으로 분석을 시행 한 동물 피부와 푸른 눈을 표시해야합니다. PBS 감응 동물 따라서 양쪽 귀에 흰색 (그림 1A) 남아 있어야, PBS 또는 OVA 도전 중 하나에 반응하지 않아야합니다. OVA 감작 동물, PBS 챌린지를 수신하는 귀 (왼쪽)이 완전히 흰색 또는 주사 부위에서의 국소 방식으로 가볍게 푸른 여야한다. OVA 도전을 받고 귀 (오른쪽) 염료 관리 (그림 1B) 후 10 분 동안 점진적으로 어두운 파란색이 될 것이다. PBS 감응 동물은 PBS와 OVA 도전 (그림 2A) 모두 무시할 수 흡광도 측정을해야합니다. OVA 감작 동물을, PBS 주사는 일반적으로 0.13의 평균 흡광도 판독과 0.04의 표준 편차를 초래한다. 반대로, 0.58의 평균 흡광도 판독과 0.18의 표준 편차를 50 μg OVA 챌린지 결과 (FIgure 2B). 필요한 경우에 사용 OVA 챌린지의 양은 각각의 실험을 위해 조정될 수있다. 예를 들어, 0.30의 평균 흡광도와 0.10 (그림 2C)의 표준 편차의 20 μg의 OVA 도전 결과는 20 μg 이하 그러나 문제는 신뢰성있는 결과를 제공하지 않을 수 있습니다. OVA 농도의 변화는 최적화 사용하기 전에 확인해야합니다. PBS의 흡광도 OVA 흡광도 비교로 결과를 그래픽으로 페어링을 할 수 있습니다. 대안 적으로, 결과는 각 동물에 대한 OVA 흡광도로부터 감산 PBS 흡광도와, 단일 값으로 나타내 어질 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52005/52005fig1highres.jpg" /> 그림 1 : PBS 및 OVA 감작 된 동물의 귀 색소 침착. (A). PBS에 이어 색소 침착은 동물을 증감. 오와 도전 (PBS와 도전) 왼쪽 귀와 오른쪽 귀 (0 μg OVA)가 더 염료 넘쳐 거의 보여줍니다. (B). OVA 감작 된 동물의 귀 색소 침착. 파란색 염료의 혈관 외 유출의 부재로 표시된 바와 같이 (PBS와 도전) 왼쪽 귀에는 알레르기 반응이 없다. (50 μg OVA와 도전) 오른쪽 귀는 증가 된 혈관 투과성, 귀 조직에서 세포 활성화의 직접적인 결과를 나타내는 밝은 파란색 색상을 보여줍니다. <img alt="그림이" src="/files/ftp_upload/52005/52005fig2highres.jpg" /> 그림 2 : OVA 감작 된 동물 용 대표 OD 값을 620 nm에서 찍은 분광 광도 측정에서 파생 된 OD 값 (A)... PBS 감응 동물에서 50 μg OVA 도전. 모두 PBS 및 OVA의 반칙으로 OD 값은 무시할 수 있습니다. (B). OVA 감작 된 동물에서 50 μg OVA 도전. OD 값의 PBS 도전 결과 &lt;0.2 OVA 도전 resuOD 값에서 LTS&gt; 0.3. (C). 20 μg OVA 도전. OD 값의 PBS 도전 결과 &lt;0.2. 오른쪽 귀는 약간 사용 OVA의 작은 도전의 투여에 의한 OD 값을 감소시켰다.

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Measuring Local Anaphylaxis in Mice

비만 세포와 호염기구의 활성화를 특징으로 알레르기 반응은, IgE 항체의 가교 및 염증 매개 물질의 방출에 의해 구동된다. 알레르기 반응의 정량적 인 평가는 알레르겐 공격 후 혈관 투과성의 변화를 모니터하는 에반스 블루 염료를 사용함으로써 달성 될 수있다.

마우스에 현지 아나필락시스 측정

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.2K 조회수.  Uniformed Services University of the Health Sciences.  비만 세포와 호염기구의 활성화를 특징으로 알레르기 반응은, IgE 항체의 가교 및 염증 매개 물질의 방출에 의해 구동된다. 알레르기 반응의 정량적 인 평가는 알레르겐 공격 후 혈관 투과성의 변화를 모니터하는 에반스 블루 염료를 사용함으로써 달성 될 수있다. 

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Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

알레르기 항원 유도 천식의 Murine 모델

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

연구

면역학 및 감염병학

Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

One desirable endpoint of general anesthesia is the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is less straightforward than it is in human patients. A widely used behavioral surrogate for hypnosis in rodents is the loss of righting reflex (LORR), or the point at which the animal no longer responds to their innate instinct to avoid the vulnerability of dorsal recumbency. We have developed a system to assess LORR in 24 mice simultaneously while carefully controlling for potential confounds, including temperature fluctuations and varying gas flows. These chambers permit reliable assessment of anesthetic sensitivity as measured by latency to return of the righting reflex (RORR) following a fixed anesthetic exposure. Alternatively, using stepwise increases (or decreases) in anesthetic concentration, the chambers also enable determination of a population's sensitivity to induction (or emergence) as measured by EC50 and Hill slope. Finally, the controlled environmental chambers described here can be adapted for a variety of alternative uses, including inhaled delivery of other drugs, toxicology studies, and simultaneous real-time monitoring of vital signs.

Loss of the righting reflex has long served as a standard behavioral surrogate for unconsciousness, also called hypnosis, in laboratory animals. Alterations in volatile anesthetic sensitivity caused by pharmacological interventions can be detected with a carefully controlled high-throughput assessment system, which may be adapted for delivery of any inhaled therapeutic.

로컬 또는 전신 약물 개입 후 마우스의 휘발성 전신 마취 감도의 변화를 평가

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

의학

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain perception in rodents. Withdrawal thresholds can be measured first at baseline and then following drug, venom, injury, allergen,&#160;or otherwise evoked inflammation by applying an accurate force on very specific areas of the skin. An electronic von Frey apparatus allows precise assessment of mouse hind paw withdrawal thresholds that are not limited by the available filament sizes in contrast to classical von Frey measurements. The ease and rapidity of measurements allow for incorporation of assessment of tactile sensitivity outcomes in diverse models of rapid-onset inflammatory and neuropathic pain as multiple measurements can be taken within a short time period. Experimental measurements for individual rodent subjects can be internally controlled against individual baseline responses and exclusion criteria easily established to standardize baseline responses within and across experimental groups. Thus, measurements using an electronic von Frey apparatus represent a useful modification of the well-established classical von Frey filament-based assays for rodent mechanical allodynia that may also be applied to other nonhuman mammalian models.

Electronic von Frey measurements are an effective and improved alternative to classical von Frey filaments, as they allow rapid and precise measurement of changes in rodent mechanical withdrawal thresholds to continuously applied pressure stimuli before and after an inflammatory event.

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

신경과학

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

에어웨이 저항 측정 및 마우스에 Bronchoalveolar 세척 유체 샘플링에 대한 가역, 비침습 방법

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

생물학

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for vaccination as well as understand how pathogenic antibody responses develop in allergies and autoimmune disease. Generating robust antigen-specific antibody responses is not always trivial. In mouse models, it often requires multiple rounds of immunizations with adjuvant that leads to a great deal of variability in the levels of induced antibodies. One example is in mouse models of peanut allergies where more robust and reproducible models that minimize mouse numbers and the use of adjuvant would be beneficial. Presented here is a highly reproducible mouse model of peanut allergy anaphylaxis. This new model relies on two key factors: (1) antigen-specific splenocytes are adoptively transferred from a peanut-sensitized mouse into a na&#239;ve recipient mouse, normalizing the number of antigen-specific memory B- and T-cells across a large number of mice; and (2) recipient mice are subsequently boosted with a strong multivalent immunogen in the form of liposomal nanoparticles displaying the major peanut allergen (Ara h 2). The major advantage of this model is its reproducibility, which ultimately lowers the number of animals used in each study, while minimizing the number of animals receiving multiple injections of adjuvant. The modular assembly of these immunogenic liposomes provides relatively facile adaptability to other allergic or autoimmune models that involve pathogenic antibodies.

Described is the preparation of antigenic liposomal nanoparticles and their use in stimulating B-cell activation in vitro and in vivo. Consistent and robust antibody responses led to the development of a new peanut allergy model. The protocol for generating antigenic liposomes can be extended to different antigens and immunization models.

질병-특정 항 체의 생성에 대 한 항 원 리

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature readings is common, and they have been proven to be accurate and invaluable in this regard. However, this method of temperature measurement requires the mice to be anesthetized in order to insert the probe without injury to the animal. This limits the ability to observe other phenotypes of the mouse simultaneously. In order to investigate other phenotypes while measuring temperatures, rectal probes are not ideal, and another method is desired. Here, we introduce a noninvasive method of temperature measurement that foregoes the requirement for mouse anesthesia while maintaining equal reliability to rectal probes in measuring body temperature. We use an infrared thermometer that detects body surface temperatures at ranges between 2 and 150 mm. This method of body temperature measurement is successful in reliably replicating temperature change trends during passive system anaphylaxis experiments in mice. We show that body surface temperatures are about 2.0 &#176;C lower than rectal probe measurements, but the degree of temperature drop follows the same trend. Furthermore, we use the same technique to observe mice in a food allergy model to evaluate temperature and activity levels simultaneously.

Here we present a new method to accurately measure body temperature differences in passive systemic anaphylaxis (PSA) and food allergy mouse models using an infrared thermometer. This procedure has been accurately duplicated in previous PSA results.

수동 체계 알레르기 및 식품 알레르기 평가 하는 동안 적외선 온도계를 사용 하 여 마우스 신체 온도 측정

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

Cheek Injection Model for Simultaneous Measurement of Pain and Itch-related Behaviors

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts are typically counted to evaluate itch induced by pruritogens. However, previous reports have shown that algesic substances also induce scratching behaviors in a mouse neck injection model, which is the most common test used for scratching behaviors. This finding makes it difficult to study itch in mice. &#160;In contrast, capsaicin, a common algogen, reduced scratching behaviors in some neck injection experiments. Therefore, the effect of pain on scratching behaviors remains unclear. It is thus necessary to develop a method to concurrently investigate itch and pain sensation using behavioral tests. Here, a cheek injection model is introduced which can be used to simultaneously measure pain- and itch-related behaviors. In this model, pruritogens induce scratching behaviors while algesic substances induce wiping behaviors. Using this model, lysophosphatidic acid (LPA), an itch mediator found in cholestatic patients with itch, is shown to exclusively induce itch but not pain. However, in mouse models, LPA has been reported to be both a pruritogen and an algogen. Investigation into the effects of LPA in a mouse cheek injection model showed that LPA only induced scratching, but not wiping behaviors. This indicates that LPA acts as a pruritogen similarly in mice and humans, and demonstrates the utility of a cheek injection model for itch research.

Typically, the mouse neck injection model is used for evaluate pruritogen-induced scratch behaviors. However, the model provides information only on itch, not pain. Here, a cheek injection model is introduced in mice which can be used to simultaneously measure pain and itch-related behaviors.

통증과 가려움관련 행동을 동시에 측정하기 위한 뺨 주입 모델

Itch was defined as &#34;an unpleasant cutaneous sensation that provokes a desire to scratch&#34;&#160;by Rothman in 1941. In mouse models, scratch bouts ...

Analysis of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor-Producing T Helper Cells in a Mouse Model of Contact Hypersensitivity

Parallel to traditional Th1/Th2/Th17/Treg lineages, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper (Th-GM) cells have been identified as a distinct subset of T helper cells (GM-CSF+ IFN-&#947;- IL-17A- IL-22- effector CD4+ T cells) in human and mice. Contact hypersensitivity (CHS) is considered an excellent animal model for allergic contact dermatitis (ACD) in human, manifesting an intact T cell-mediated immune response. To provide a standardized and comprehensive assay to analyze the Th-GM cell subset in the T cell-dependent immune response in vivo, a murine CHS model was induced by sensitization/challenge with a reactive, low-molecular-weight, organic hapten, 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB). The Th-GM subset in effector CD4+ T cells generated upon immunization with the hapten was analyzed by flow cytometry. We found that Th-GM was mainly expanded in lesions and draining lymph nodes in the DNFB-induced CHS mouse model. This method can be applied to further study the biology of Th-GM cells and pharmacological research of therapeutic strategies centered on GM-CSF in various conditions, such as ACD.

Here, we present a simple and standardized method of analyzing the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper subset in vivo.

Parallel to traditional Th1/Th2/Th17/Treg lineages, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper (Th-GM) cells have been identified ...

Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis

Contact hypersensitivity (CHS) is an experimental model of allergic contact dermatitis (ACD) that can be studied in mice. This study aims to present an objective laboratory method that may help to study the CHS reaction in mice, which can be measured and quantified by various tests. To induce CHS, on day "0", mice were sensitized on a previously shaved spot by abdominal skin painting with the hapten 2,4,6-trinitrochlorobenzene (TNCB) in an acetone-ethanol mixture, whereas negative control mice were sham sensitized with vehicle alone-acetone-ethanol mixture. On day "4", the baseline ear thickness was measured with a micrometer prior to the elicitation of CHS (challenge) by painting both ears with diluted TNCB both in the test and control groups. After 24 h, the ear swelling was measured with a micrometer. CHS is an example of a T cell-mediated immune response that causes swelling in inflamed tissue, peaking 24 h after the skin challenge with the same hapten. An increase in ear edema correlated with augmented ear weight, myeloperoxidase (MPO) activity, pro-inflammatory cytokine concentration in the ear extracts, increased thickening of the edematous dermis in the histological examination, and ear vascular permeability. There was also an increase in the concentration of TNP-specific IgG1 antibodies in the sera of the test group when compared with the control mice. Additionally, CHS can be successfully transferred with the CHS-effector cells obtained from donors previously sensitized with TNCB. The CHS-effector cells were administered intravenously into na&#239;ve recipient mice, which were subsequently challenged with the same diluted hapten. Ear swelling was measured with a micrometer 24 h later.

Contact hypersensitivity (CHS) is a murine experimental model of allergic contact dermatitis (ACD). CHS is based on sensitization with reactive hapten by painting the shaved skin of the chest and abdomen, with a subsequent ear skin challenge with a diluted hapten, causing a swelling reaction that is assessed in various ways.

알레르기 성 접촉 피부염의 뮤린 모델로서의 접촉 과민증

Contact hypersensitivity (CHS) is an experimental model of allergic contact dermatitis (ACD) that can be studied in mice. This study aims to present an ...

A Mouse Ear Model for Allergic Contact Dermatitis Evaluation

Skin is the human body&#39;s first line of defense and one of the most exposed organs to environmental chemicals. Allergic contact dermatitis (ACD) is a common skin disease that manifests as a local rash, redness, and skin lesions. The occurrence and development of ACD are influenced by both genetic and environmental factors. Although many scholars have constructed a series of models of ACD in recent years, the experimental protocols of these models are all different, which makes it difficult for readers to establish them well. Therefore, a stable and efficient animal model is of great significance to further study the pathogenesis of atopic dermatitis. In this study, we detail a modeling method using 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) to induce ACD-like symptoms in the ears of mice and describe several methods for assessing the severity of dermatitis during modeling. This experimental protocol has been successfully applied in some experiments and has a certain promotional role in the field of ACD research.

Here, we describe the methods for inducing allergic contact dermatitis in mouse ears by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) and how to evaluate the severity of allergic contact dermatitis.

알레르기성 접촉성 피부염 평가를 위한 마우스 귀 모델

Skin is the human body&#39;s first line of defense and one of the most exposed organs to environmental chemicals. Allergic contact dermatitis (ACD) is a ...