Name: a novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy
Uploaded: 2014-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 30 s
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저자는 학제 간 혁신 이니셔티브 프로그램, 일리노이 대학을 감사드립니다, 12035을 부여합니다. SK는 국립 과학 재단 (NSF) 부여에서 UIUC에 투자되었다 0,965,918 IGERT : 세포 및 분자 역학 및 BioNanotechnology에 연구원의 차세대를 훈련.

제조 및 세포 배양 표면 근처에 포함 된 형광 미소와 강성을 변화의 PA 젤 관능. 1 상단 커버 유리 전표를 기능화 <ol><li> 청소 유리 커버 슬립 (# 1.0, 12mm의 DIAM.) 비누와 물, 에탄올 다음은 외부의 먼지를 제거합니다. </li><li> 도시 유리 커버들은 커버 슬립의 용이성과의 상호 작용을 용이하게 닿지 않도록되도록 강판의 표면 (즉, 피펫 팁 홀더)에 실수. </li><li> 코트 커버의 표면 전체가 폴리-D-라이신 1 시간 (도 1a)에 대한 (0.1 ㎎ / ㎖)와 함께 미끄러. </li><li> 이 시간 동안, 일 수행 0.1 μm의 직경의 콜로이드 용액 만 희석 탈 (DI) 물에 적색 형광 마이크로 스피어는 겔 표면에 20 μm의 2 당 약 1 마이크로 스피어의 입자 밀도를 얻었다. 다양한 희석의 결과는 그림 2를 참조하십시오. 이 dilutioN은 특정 실험의 필요성을 충족시키기 위해 변경 될 수있다. </li><li> 30 분 동안 초음파 물을 욕조에 희석 된 용액을 놓습니다. </li><li> 1 시간 후, 신중하게 각 커버 슬립을 들어 올려 공기와 바람을 불어 건조 핀셋을 사용합니다. 강판 표면에 건조 커버 전표를 돌려줍니다. </li><li> 각 커버 슬립 위에 초음파 목욕 및 피펫 150 μL의 희석 된 콜로이드 용액을 제거합니다. 10 분 (그림 1B)에 두십시오. </li><li> 주의 깊게 각 커버 슬립을 들어 올려 공기와 바람을 불어 건조 핀셋을 사용합니다. 사용할 준비가 될 때까지 건조 커버가 어둠 속에서 강판 표면과 가게에 미끄러 져 돌아갑니다. </li></ol> 직접 바닥이​​ 유리 페트리 접시에 PA 젤을 준비 2 <ol><li> 100 ° C로 예열 열판. </li><li> 유리 바닥 배양 접시의 원하는 수의 레이아웃 (14mm와 35mm 요리를 마이크로 웰, # 1.0) 화학 흄 후드의 평평한면에. </li><li> 97 % 3 - 아미노 프로필 trimethoxys 각 페트리 접시 마이크로 웰의 유리 부분을 덮리안 화학 활성화를위한 7 분 (3-APTES). 폴리스티렌의 열화를 방지하는 페트리 접시에서 플라스틱의 표면에 3-APTES 부주의 떨어지는 않도록주의하여주십시오. </li><li> 7 분 후, DI 워터와 페트리 접시를 작성하고 폐기물 용기에 폐기하십시오. </li><li> 를 반복 한 다음 각 요리에 대한 단계 2.4 배, 그리고 여분의 물을 제거하기 위해 페트리 접시를 흔들. 유리 부분은 물기가 없어 질 때까지 뜨거운 접시에 배양 접시를 놓습니다. </li><li> 핫 플레이트에서 배양 접시를 제거하고 화학 흄 후드에서 평평한 표면으로 돌아갑니다. </li><li> 화학 퓸 후드에서, 0.5 % 글루 타르 알데히드 용액을 잘 30 분 동안 용액으로 각각 페트리 접시의 유리 부분을 커버. 플라스틱의 열화를 방지하는 페트리 접시에서 플라스틱의 표면에 글루 타르 알데히드의 부주의 떨어지는 않도록주의하여주십시오. </li><li> 30 분 후, DI 워터와 페트리 접시를 채우고 씻어 폐기물 용기에 폐기하고 glutarald를 제거ehyde. </li><li> 를 반복 한 다음 각 요리에 대한 단계 2.4 배, 그리고 여분의 물을 제거하기 위해 페트리 접시를 흔들. 유리 부분은 물기가 없어 질 때까지 뜨거운 접시에 배양 접시를 놓습니다. </li><li> PA 겔 용액의 성분을 혼합하기 전에, 유리 바닥 겔의 짧은 협 허용들은 쉽게 접근 할 수 있도록 화학적 흄 후드로 기능화 된 유리 슬라이드를 이동 겔 용액을 혼합 한 후 배양 접시가. </li><li> 15 ㎖의 원심 관에, 표 1에 기재된 농도로 직접 연속적으로 40 % 비스 아크릴 아미드, 2 % 아크릴 아미드, 및 아크릴산을 혼합 행렬 원하는 탄성을 달성하기 위해 (출판 (10)로부터 적응 프로토콜). </li><li> 겔 용액을 완료하기 위해 필요한 매트릭스 탄성에 대응하는 표 1에 열거 개당 100 mM의 HEPES, 10 %의과 황산 암모늄,과 TEMED를 추가한다. </li><li> 즉시 유리 부의 중심에 겔 용액 15 μL 피펫배양 접시의. </li><li> 즉시 핀셋 기능화 된 유리 커버 슬립을 선택합니다. <ol><li> 형광 구슬이 젤 솔루션 측면 만드는 접촉이되도록 위에 유리 커버 슬립 플립. </li><li> 부드럽게 기능화 측 겔 (도 1C)와 접촉되도록 해주기 액체 PA 겔의 상단에 커버 슬립을 놓는다. 주 : 최상의 결과를 위해, 두 번째 사람은 다수의 배양 접시에 액체 PA 겔 용액을 피펫 팅하면서 부분적인 중합을 방지하기 위해 커버 슬립을 추가의 역할을 위해 권장된다. </li></ol></li><li> PA 젤 낮은 수준으로 중합 형광 나노 입자에 중력 효과를 방지 지원하기 위해 모든 페트리 접시를 뒤집습니다. </li><li> PA 젤의 원액이 눈에 띄게 그 원심 분리 관에서 중합했다 적어도 35 분 동안, 또는 때까지 기다립니다. </li><li> 다시 이상 배양 접시를 뒤집어 커버 슬립을 제거 지원하기 위해 PBS로 채운다. </li><li> 조심스럽게 커버 슬립의 둘레를 긁어 핀셋을 사용하여, 배양 접시의 유리 부와 커버 슬립의 개요와 접촉. 커버 슬립이 빠질 때까지 여러주기를 수행합니다. 커버 슬립을 제거하고 적절한 날카로운 물건 폐기 용기에 폐기하십시오. </li><li> 모든 커버 전표를 제거한 후, 형광 구슬은 겔 (그림 1D)에 전송 한 것입니다. 완전히 PBS와 PA 젤 커버 각 접시에 페트리 접시의 뚜껑을 배치하고 4 ° C에서 보관. </li></ol> 3 피브로넥틴과 PA 젤 기능화 <ol><li> 설립 프로토콜 11에 설명 된대로 다음과 같은 예 혼합 솔루션을 준비 : 솔루션을 적시 (137 mM의 NaCl을, 5 % (v / v)로 글리세롤) 및 2 배 접합 버퍼 (0.2 M 2 (N의 -morpholino) 에탄 술폰산 (MES), 10 % (v / v)로 글리세롤, 산도 4.5). </li><li> PA 겔을 함유하는 유리 - 바닥 접시에서 모든 PBS를 제거하는 생물학적 후드에서 진공 펌프를 사용한다. </li><li> 피펫테 겔이 완전히 침수 될 수 있도록 각 젤에 솔루션을 흡수. 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 온난 한 에틸 3 - [3 - 디메틸 아미노 프로필] 카르 보디이 미드 히드로 클로라이드 (EDC) 및 실온의 N -hydroxysulfosuccinimide (NHS). </li><li> EDC의 10 배 용액 (150 mM의 DI 물에, 19 ㎎ / ㎖) 및 NHS (250 mM의 DI 물에, 29 ㎎ / ㎖)를 혼합한다. </li><li> 1 부를보기 배 EDC, NHS 1 부를 10 배, 3 부 DI 물, 및 5 중량 배 공액 버퍼를 섞는다. </li><li> 흡수 용액을 제거하는 생물학적 후드에서 진공 펌프를 사용합니다. 모든 유체가 겔 표면으로부터 제거되어 있는지 확인합니다. </li><li> 겔 표면을 커버하고 페트리 접시 (150 ~ 250 μL)의 유리 바닥을 잘 채울 수있는 충분한 NHS / EDC 솔루션을 추가합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 실온에서 해동 피브로넥틴. 일단 해동, 50 μg / ml의 피브로넥틴 솔루션을 만들기 위해 멸균 DI 물을 섞는다. </li><li> NHS / EDC의 솔루을 제거하는 생물학적 후드에서 진공 펌프를 사용하여기. 모든 유체가 겔 표면으로부터 제거되어 있는지 확인합니다. </li><li> 각 겔에 피브로넥틴 용액 150 μl를 추가합니다. 피브로넥틴의 부착을 허용하기 위해 35 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 35 분 후 최대 2 주 동안 4 ° C에서 각 페트리 접시 및 저장에 PBS를 추가합니다. </li></ol> 4 트랙션 포스 실험 <ol><li> 물을 욕조에 따뜻한 세포 미디어, PBS, 37 ° C에 트립신. </li><li> 젤 린스 사이에 PBS를 흡입, 멸균 PBS로 5 배, 그리고 후드에 덮여있는 상태로 둡니다 씻어. </li><li> 플라스크를 포함하는 셀에 1 ㎖의 트립신이 25cm 당을 추가합니다. 세포가 플라스크에서 해제 된 후, 세포 미디어 트립신을 희석 세포를 계산합니다. 겔 표면 영역에 기초하여, / cm 2 3,000 세포의 최종 세포 밀도 시드 젤 당 필요한 세포의 수를 결정한다. 희석 또는 셀 미디어 혼합물의 150 μL 세포의 숫자를 포함하도록 서스펜션을 집중한다. 세포 suspens의 나누어지는 150 μL각 젤에 이온. </li><li> 30 분 동안 인큐베이터에서 세포를 포함하는 페트리 접시를 놓습니다. 이어서, 신중 배양 접시를 제거하고 접시의 표면이 완전히 잠기도록 용지 (약 2 mL)로 페트리 접시의 나머지 부분을 채운다. </li><li> 이미지 수집 될 때까지 배양기에서 배양 접시를 다시 배치합니다. </li><li> , 미분 간섭 대비 (DIC) 프리즘을 삽입, 40 배 침수 목적을 삽입 mCherry 또는 이에 상응하는 형광 필터를 선택하고 환경 챔버를 켜 : 이미징 현미경 및 데이터 수집 시스템을 준비합니다. </li><li> 영상을 준비 할 때, 인큐베이터에서 한 페트리 접시를 제거하고 현미경 무대에 조심스럽게 놓습니다. DIC 이미징 페트리 접시의 뚜껑을 제거합니다. </li><li> 하나의 셀을 찾아 DIC의 셀의 하나의 정지 영상을 캡처합니다. </li><li> 현미경 스테이지를 이동하지 않고 형광하는 촬상 모드를 전환. 형광 마이크로 및 녹화에 초점미소 구체의 화상 함수 ord. </li><li> 조심스럽게 피펫으로 배양 접시에서 세포 미디어를 제거하고 0.05 % 트립신-EDTA를 추가합니다. </li><li> 이미지 셀 후 셀 아래 미소 구는 분리했다. </li><li> ImageJ에 12에서 사용 입자 영상 유속계 (PIV) 분석에 의한 세포 힘 변위 필드를 계산합니다. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

이 방법을 사용할 때, 비드 용액 적절히 희석 및 비즈 원하는 직경에 기초하여 선택되는 것이 필수적이며, PA 겔 기판 강성이고 원하는 실험 탐구되는 현상의 크기 스케일. 상단 유리 커버 슬립을 기능화하기 전에 비드 솔루션을 희석 할 때주의를 기울여야한다. 겔 표면에 구슬 사이의 간격은 콜로이드 용액의 희석 배수를 변화시킴으로써 변경 될 수있다. 너무 용액을 희석하여 커버 슬립에 그 커플 구슬의 수를 감소시키고, 궁극적으로 겔 비드의 수를 감소시킬 것이다. 너무 적은 용액을 희석하는 것은 그들이 접촉과 서로 구별 될 수 없도록 겔 비드 너무 높은 밀도를 얻을 수있다. 완전히 통합 된 나노 입자의 존재를 방지하는 것이 불가능하지만, 희석 한 용액에 초음파의인가는 효과적으로 최소화 유모oparticle 집계. 우리는이 프로토콜에서 이용 콜로이드 용액의 10000 배 희석액을 3.64 × 10 8 비드 / ㎖의 비드 농도를 제공하고, 0.1 μm의 직경 구슬 0.05 비즈 / μm의 (2)의 바람직한 입자 밀도를 얻을 수 있음을 발견 하였다. 1 : 20000 희석액 (1.82 × 10 8 비드 / ㎖) 당 52 μm의 입자 (2)의 평균을 산출이 다양한 희석액과 겔의 표면의 이미지를 보여준다.. 이 겔 비드로 전송할 수의 변동이 있음을 주목해야한다. 이 작용 동안 압축 공기로 커버 슬립에서 비드 용액을 제거와 관련된 변화에 기인한다. 일반적으로, 우리는 두 가지 중 적어도 배 희석 계수의 증가는 지속적으로 비드 당 분야에서 적어도 두 배 증가를 초래 것을 발견 하였다. 그것은 t의 완전 침수가 발생합니다 구슬의 크기 (직경)를 선택하는 것이 중요하다그는 PA 중합시 젤 내부에 구슬. 도 5a에 도시 한 바와 같이 겔 강도는 구슬의 위치에 영향을 미친다. 0.1 μm의 직경 구슬, 비드 깊이 강성 저하에 따라 증가한다. 이것은 기공 크기 및 PA 겔 강성 (13) 사이의 반비례 관계의 결과 일 수있다. 테스트 셋 강성 겔 모두, 비드 일관 겔 내부에 지역화 및 겔 표면의 1 μM에서도 8a에 도시 된 바와 같이. 겔 내에서 1 μm의 구슬의 평균 위치는 강성에 따라 달라집니다. 그들은 1 kPa의 젤에 대해 깊이 (약 1.25 μm의) 포함됩니다. 구슬이 종종 겔의 상단을 통해 돌출 의미 10, 40 kPa의 젤의 경우, 1 μm의 직경 구슬의 상단의 위치가 젤 아래 0.5 μm의 위의 약 0.5 μm의 범위 (그림 5) 표면 (그림 8B). 이 topogra을 소개하기 때문 해로운셀 PHY 및 지형은 셀 기판 (14)의 상호 작용에 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 따라서, 특정 강성의 겔을 제조 할 때이 기술에 대한 선택의 비드 유념 할 필요가있다. 이 방법을 특성화하기 위해 사용되는 두 개의 구슬 크기의 0.1 μm의 직경은 최적의 크기를 증명한다. 다른 비드 크기는이 기술과 함께 이용 될 수 있지만, 여기서 설명하는 바와 같이 겔 비드 중합시 지역화되는 정확한 깊이를 이해하기 위해, 공 초점 현미경을 사용하여 캘리브레이션되어야한다. 이 기술은 시야 내에 구별 입자의 수​​를 증가시킴으로써 PA 겔 구슬의 공간 분해능을 향상시킨다. 겔의 상단에 레이어에 구슬을 해당 지역의 언어로 크게 겔의 합성 강성에 영향을주지 않습니다. Isostress 복합 이론 겔 함유 BEA 만 1 μm의 두께의 층으로, 복합 탄성률 E의 C를 계산하기 위해 이용된다DS로 <img alt="식 (1)" fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51873/51873equation1.jpg" width="262" /> E의 f는 폴리스티렌 비드 (3 GPa로)의 탄성 계수이고, E의 m은 겔 매트릭스 (10 kPa의)의 탄성 계수이고, V의 F 및 V m은 각각 구슬 및 겔 매트릭스의 체적 분율이다. 비드 체적의 단지 0.03 %를 포함하기 때문에, E의 C = 10.0025 kPa의 강성은 10 kPa의 등방성의 겔의 탄성률보다 크게 다르지 않다. PA 겔의 제조 방법은, 이와 같이 설정된 중합 중에 비드 (15)의 분포에 대한 중력의 영향을 최소화하고, 30 초에 중합 시간을 감소시킨다. 비즈 겔로 중합하는 우리의 방법은 더 이상 (~ 30 분) 중합 시간에 의존그들은 겔 표면에 돌출하지 않도록. 단일 층으로 비드를 지역화 것은 상당히 복합 겔 강도 및 겔 매트릭스에 구슬의 전송에 더 긴 중합 시간 원조에 영향을주지 않기 때문에, 우리는 우리의 기술에서는 중합 시간을 줄일 수있는 측정 값을 포함하지 않는다. 우리의 기술은 기판의 변형의 측정, 따라서 세포 견인 힘의 계산을 향상 PA 젤 내부에 알려진 깊이에 구슬을 지역화하는 방법을 보여줍니다. 휴대 견인 힘을 정량화하는 이론적 접근 방법은 이전에 16, 17을보고되었다. 이 방법은 탄성 반 공간에서 반 무한 고체로서 겔 기판을 취급한다. Boussinesq 용액 변위 필드로부터 견인력을 계산의 역 문제를 해결하기 위해 사용된다. 우리 의한 겔의 비드로부터 원위 변위 측정에 오차를 정량화 Boussinesq 적분의 단순화 된 버전을 사용urface 18. 전단 응력인가에 기초하여 주어진 방향으로의 변위 방정식은, τ은 소정 반경 R 위에 주어진다 <img alt="식 (2)" fo:content-width="3.7in" src="/files/ftp_upload/51873/51873equation2.jpg" width="558" /> U X가 X 방향의 변위이고, μ는 전단 계수이며, z는 겔 비드 표면으로부터의 깊이이다. 겔의 비드 깊이에 걸쳐 다양한 위치는, 대응하는 변위를 표 2에 나타낸다. 여기에 도시 된 경우에 대해, 반경 1 μm의 평균 크기 초점 접착 것으로 추정된다. 비드가 세포 (Z = 0)과 동일 평면으로 가정하는 경우, 배기량은 0.75 τ / μ에 의해 주어진다. 비드 만 1 μm의 겔 표면 아래를 경우 변위 0.24 τ / μ에 의해 주어진다. 이1 μm의 아래 위치에 표면에 구슬 평면에서 변위 배 감소보다 더 큰 나타냅니다. 이것은 정확한 겔 내에서 위치를 알 수없는 임베디드 구슬의 움직임에 따라 표면의 견인 세력의 계산에 오류를 소개합니다. 제안 된 전통적인 제조 방법 모두에 대한 겔의 비드의 깊이의 함수로서 τ / μ에 의해 정의 된 견인력에 편차가 중요하다.도 9는 힘의 분포를 나타낸다 (비 τ 주어진다을 / μ) 기반 Boussinesq 이론 비드 균일 겔 분포 및 표면 근처에서 국소 때 피사계 심도 내의 광학 비드 깊이 (Z)의 분포를 이용하여 연산 결과가. 비드가 세포, Z = 0 및 τ / μ = 0.0133으로 동일 평면에있을 때의 휴대 힘의 가장 정확한 측정을 초래할 것이다. (118)에 의해이 경우, τ / μ 증가에 비해%, 80 %, 및 1 kPa의 10 kPa의, 및 40 kPa의 겔, 50 %는 각각, 비드 우리가 제안하는 기술을 사용하여 표면 근처에 국부적 때. 비드 균일 겔 깊이에 걸쳐 분산 될 때, τ / μ는 각각 1 kPa의 10 kPa의, 및 40 kPa의 겔에 대해, 표면 근처 비드 지역화 의한 증가를 넘어 부가적인 60 %, 80 % 및 150 % 증가한다. 구슬이 겔 깊이에 분포하는 경우에 견인 계산 거의 200 % 오차의 합계를 나타냅니다. 따라서, 겔 내부에 알려진 깊이에 구슬을 국산화하는 변위 측정 및 세포 견인 세력의 정확도를 향상시켜줍니다. 여기에 설명 된 기술은 구슬 겔 표면 근처 지역화되도록 견인 현미경 애플리케이션을 위해 PA 겔 기판을 제조하는 새로운 방법을 제시한다. PA 겔 내에서 알려진 깊이에 구슬을 한정하는 것은시를 만드는 세포 하중 적용에 따라 구슬의 실제 변위에 대한 새로운 정보를 제공합니다세포가 하부 기판을 변형하는 방법의 정확한 포토 광석.

로컬 환경과 살아있는 세포의 기계적 상호 작용은 일반적으로 PA 젤을 이용하여 연구하고있다. 이러한 기판이 기판의 주요 이점 중 하나. 한 1997 Dembo 및 왕에 의해 설립 간단한 잘 특성화 프로토콜에 의존하는 그들의 강성 겔 용액의 특정 구성 요소의 농도를 변경함으로써 조절 될 수 있다는 것이다. 이것은 서로 다른 강성의 환경과 세포의 상호 작용을 연구하는 것이 바람직 플랫폼을 제공합니다. PA 젤은 세포 외 기질 (ECM) 단백질로 코팅하는 경우, 세포가 힘을 생성,이를 준수합니다. 셀 힘의 결과로,이 겔 탄성체로 변형된다. 이 변형은 세포 및 겔의 탄성 특성에 의해 가해지는 힘의 크기에 따라 달라진다. 다양한 연구 셀룰러 견인 세력을 조사하기 위해 PA 젤을 사용했다. PA 겔 제조의 한 변형에서, 형광 마이크로 스피어 (구슬) t을 포함하는다른 경직성이의 젤에 세포 견인 힘을 정량화하기 위해 젤을 hroughout. 셀 힘 부여되면, 비즈 겔 변형 전의 초기 위치로부터 변위. 변형 필드는 각각의 비드로부터의 변위를 측정한다. 이 변형 필드는 탄성 이론 및 견인력을 계산하는 겔의 탄성 특성과 함께 이용된다. 이러한 측정은 세포가 기계적으로 감지하고 해당 지역의 미세 세와 상호 작용하는 방법에 대한 통찰력을 제공합니다. 많은 널리 사용되는 PA 겔 제조 프로토콜에서 구슬은 액체의 비중 합 상태에서 PA 젤에 걸쳐 혼합된다. 완전히 중합 PA 젤은 볼륨에 걸쳐 형광 구슬이 포함되어 있습니다. 셀 견인력을 계산할 때, 겔 표면 (셀 기판 계면)에 가까운 가장 구슬 모니터링된다. 이러한 비드의 변위는 하중 calculatio의 간략화를 위해 세포 배양 표면에서 발생하는 것으로 가정명. 겔의 깊이 내의 비드의 실제 위치는 무시된다. 그러나, 탄성 매체 (예 PA 겔 등), 힘 적용 점에 가까운 비드 멀리 포인트로부터 비드보다 더 이동한다. 따라서, 셀룰러 트랙션의 과소에 표면에 그 결과로서 표면으로부터 말단 (비드 위치에서) 점의 변위를 치료. 에러의 정도는 표면으로부터의 비드의 거리에 의존한다. 오류가 비드의 위치의 지식없이 추정 될 수 없다. 매우 세포 배양 표면 근처 비드를 한정하는 간단한 방법의 필요성이 몇 가지 기술에 의해 해결되었다. 하나의 방법은 매우 표면 근처 움직임을 측정하는 상부 초점면에 비드 충분한 숫자가되도록 전체에 걸쳐 겔 비드의 밀도를 증가시키는 것이다. 또 다른 기술은 광으로부터 생균 이미징 촛점 촬상 챔버 건물 포함최상위 초점 평면에서만 비드 (4)를 수집한다. 다른 방법은 구슬 다섯없이 이미 중합 된 겔의 상단에 구슬을 포함하는 PA 젤의 매우 얇은 층을 오버레이 포함한다. 이러한 기술의 각각의 단점은 겔 내의 비드의 정확한 위치를 알 수없는 점이다. 이 비드의 변위 필드, 따라서 세포의 힘의 계산의 계산에 오류를 소개한다. 또 다른 기술은 설포 SANPAH 6을 이용하여 이미 중합 PA 겔의 상면에 접합 비드를 포함한다. 이 기술은 비드 만 PA 겔 위에 실로 보장하지만, 그들은 겔의 깊이에 매립되어있는 정도를 알 수있다. 이전 작품은 세포가 힘 마이크론 멀리 칠을 감지 할 수 있음을 제안했다 이것은 잠재적으로 세포의 동작을 변경할 수있는 세포에 대한 지역의 지형을 만들 수 있습니다. 최근에, 1 μm의 직경 F와 PA 젤을 패터닝하는 기술정규화 배열 luorescent 피브로넥틴 도트 마커 팔을 설립되었습니다. 이 경우, 형광 마커의 깊이가 알려져 있으며, 피브로넥틴 패턴 간접적 겔 표면 상에 인쇄 될 때, 본질적으로 제로이다. 그러나,이 방법은 ECM 단백질 1 μm의 직경 도트로 한정되는 바와 같이 세포가 부착 할 수있는 연속적인 환경을 제공하지 않는다. 완전히 매우 표면 근처 알려진 위치 PA 겔 내에 추적기 구슬을 통합하고이를 한정하는 방법이 아직 확립되어야한다. 여기서, 우리는 매우 PA 겔 내의 세포 배양 표면 근처 초점면에 μm의 직경 형광 비드 부 μM을 제한하는 기술을 개발한다. 겔은 전형적으로 두 개의 유리판 사이에 미 중합 액체 겔 용액을 개재하여 경화된다. 겔에 강하게 밀착되도록 플레이트 중 하나가 작용된다. 다른 작용 화하고 겔 경화 후에 제거된다. 우리는이 이동식 유리 스와 수정비즈의 층으로 코팅하여 rface. 기능화 및 비드 코팅 유리 표면 사이의 액체 겔을 끼운 후, 겔 비드 전송은 경화된다. 이것은 표면의 1.6 μM 내의 겔화 구슬 &#39;통합의 거리를 제한한다. 유리 바닥 페트리 접시는 젤이 경화되는 부착면으로 사용된다. 중합시 겔 평면형 표면을 형성하도록, 원형 유리 커버 슬립이 샌드위치에 유리 바닥 페트리 접시와 겔을 사용한다. 겔의 제조에 앞서, 상부 유리 커버 슬립은 양성 표면 전하를 산출, 폴리-D-라이신 (PDL)로 코팅된다. PDL은 압축 공기를 분출하고, 물에 비드 용액 커버 슬립 상에 증착된다. 우리는 음전하를 운반 카르 형광 마이크로 비즈를 이용하고, PDL로 처리하여 생성 된 양으로 대전 된 표면과 상호 작용. 압축 공기의 단일 층 커버 슬립 오프 비드 용액을 불어 후에구슬은 정전 건조 커버 슬립에 연결 상태를 유지합니다. 유리 슬라이드가 완전히 손상되지 않은 그대로 PA 겔로부터 제거됨에 따라 PDL 코팅은 겔 표면에 유리의 접착에 영향을 미치지 않는다. 유리 바닥 페트리 접시는 97 % 3 - 아미노 프로필 - trimethoxysliane 및 0.5 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)로 처리하여 부착 만들어집니다. 원하는 경직성의 PA 젤은 표준 절차 구를 통해 비스 아크릴 아미드와 아크릴 아미드의 적절한 농도를 혼합하여 만들어집니다. 겔 용액의 액체 방울은 유리 바닥 배양 접시 상에 피펫 팅한다. 비드를 함유 유리 커버 슬립이 샌드위치에 페트리 접시와 겔을 사용한다. 겔이 경화 될 때, 상단 커버 슬립은 표면으로부터 1.6 μM 내에 PA 겔에 포함 된 비드를 남겨 제거된다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>70% Glutaraldehyde</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES buffer solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>2% Bisacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>0.1 &amp;micro;m Fluorescent microspheres (mCherry)</td><td>Invitrogen</td><td>F8801</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin, Human, 1 mg</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Bio-RAD</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Bio-RAD</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>147230</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-14-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Glass cover slips, 12 mm diam.</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>26023</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy

PA 젤 긴 제조 및 조정 자신의 탄성을 할 수있는 기능의 용이성으로 인해 세포 견인 힘을 연구하기위한 플랫폼으로 사용되어왔다. 기판은 세포 외 기질 단백질로 코팅되는 경우, 세포 부착 및 겔 겔 변형 일으키는 힘을 적용한다. 변형은 세포 견인 및 겔의 탄성 특성에 의존한다. 표면 변형 필드가 알려진 경우, 표면 정지 마찰은 탄성 론을 이용하여 계산 될 수있다. 겔 변형은 일반적으로 균일하게 겔화 형광 마커 비드 매립에 의해 측정된다. 젤 변형으로 프로브는 변위. 겔의 표면 근처에 프로브를 추적됩니다. 이러한 프로브에 의해보고 된 변위는 표면 변위로 간주됩니다. 표면에서 그들의 깊이는 무시됩니다. 이 가정은 견인력 평가에 오류를 소개합니다. 비드의 위치가 알려 져야하는 셀의 힘의 정확한 측정을 위해, 중요하다. 우리는 개발표면의 1.6 μm의 내 PA 젤에, 형광 마커 구슬, 직경 0.1 μm의 한을 제한하는 간단한 화학을 활용하는 기술. 우리는 코트 폴리-D-라이신 (PDL)과 형광 구슬 커버 슬립. PA 겔 용액을 커버 슬립과 접착면 사이에 개재된다. 형광 비드가 경화 중에 겔 용액에 옮긴다. 중합 후, PA 겔은 겔 표면에 비행기 주변에 형광 구슬이 포함되어 있습니다.

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A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

형광 프로브를 함유하는 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔을 제조하기위한 전통적인 기술은 접착 표면 및 유리 슬라이드 사이에 겔을 개재 포함한다. 여기서, 우리는 폴리-D-라이신 (PDL) 및 형광 프로브이 슬라이드 코팅은 겔 표면으로부터 1.6 μM 내로 프로브 지역화 것을 보여준다.

견인 힘 현미경의 세포 배양 표면 근처 지역화 기자 형광 구슬을위한 새로운 방법

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

a-novel-method-for-localizing-reporter-fluorescent-beads-near-cell

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.7K 조회수.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  형광 프로브를 함유하는 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔을 제조하기위한 전통적인 기술은 접착 표면 및 유리 슬라이드 사이에 겔을 개재 포함한다. 여기서, 우리는 폴리-D-라이신 (PDL) 및 형광 프로브이 슬라이드 코팅은 겔 표면으로부터 1.6 μM 내로 프로브 지역화 것을 보여준다. 

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Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

연구

생체공학

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

발생학

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

레퍼런스 프리 견인력 현미경 플랫폼 제작 및 구현

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

B 림프구 활성화를 연구하는 견인력 현미경 검사법

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

액틴 다이내믹스, 클러치 커플링, 성장 콘 발전을 위한 견인력 분석

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

신경과학

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

생물학

Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles

Microtubule networks are employed in cells to accomplish a wide range of tasks, ranging from acting as tracks for vesicle transport to working as specialized arrays during mitosis to regulate chromosome segregation. Proteins that interact with microtubules include motors such as kinesins and dynein, which can generate active forces and directional motion, as well as non-motor proteins that crosslink filaments into higher-order networks or regulate filament dynamics. To date, biophysical studies of microtubule-associated proteins have overwhelmingly focused on the role of single motor proteins needed for vesicle transport, and significant progress has been made in elucidating the force-generating properties and mechanochemical regulation of kinesins and dyneins. However, for processes in which microtubules act both as cargo and track, such as during filament sliding within the mitotic spindle, much less is understood about the biophysical regulation of ensembles of the crosslinking proteins involved. Here, we detail our methodology for directly probing force generation and response within crosslinked microtubule minimal networks reconstituted from purified microtubules and mitotic proteins. Microtubule pairs are crosslinked by proteins of interest, one microtubule is immobilized to a microscope coverslip, and the second microtubule is manipulated by an optical trap. Simultaneous total internal reflection fluorescence microscopy allows for multichannel visualization of all the components of this microtubule network as the filaments slide apart to generate force. We also demonstrate how these techniques can be used to probe pushing forces exerted by kinesin-5 ensembles and how viscous braking forces arise between sliding microtubule pairs crosslinked by the mitotic MAP PRC1. These assays provide insights into the mechanisms of spindle assembly and function and can be more broadly adapted to study dense microtubule network mechanics in diverse contexts, such as the axon and dendrites of neurons and polar epithelial cells.

Here, we present a protocol for reconstituting microtubule bundles in vitro and directly quantifying the forces exerted within them using simultaneous optical trapping and total internal reflection fluorescence microscopy. This assay allows for nanoscale-level measurement of the forces and displacements generated by protein ensembles within active microtubule networks.