Name: analyzing cell surface adhesion remodeling in response to mechanical tension using magnetic beads
Uploaded: 2017-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
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CG는 유럽 연합 (EU) 일곱 번째 프레임 워크 프로그램의 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR-13 JSV1-0008), (마리 퀴리 경력 통합 n˚8304162)에서 유럽 연합 (EU)의 지평선에서 유럽 연구위원회 (ERC)에서 보조금 지원 2020 연구와 혁신 프로그램 (ERC 시작 부여 n˚639300).

자석 구슬 1. 리간드 활용 주 : 리간드 결합은 2.8 μm의 직경 상자성 토실 활성화 된 비드를 사용하여 수행된다 (원액 농도 10 8 비드 / ㎖, 30 mg의 비드 / ㎖). 다음 프로토콜은 60mm 조직 배양 접시에서 80 % 컨 플루 언시로 성장 MRC-5 세포에 해당하는 약 2 × 105 세포의 샘플들에 기초한다. 따라서 다른 합류점에서 서로 다른 크기 또는 셀의 판을 사용하는 경우 구슬 및 시약의 볼륨을 조정합니다. 셀당 2 비드 있기 위하여 상자성 비드의 양을 사용한다. 따라서, 4 × 105 구슬은 60mm 플레이트 필요하다. <ol><li> 철저하게 적어도 30 초를 텍싱하여 원래 유리 병에 구슬을 재현 탁. 1.5 ML의 microcentrifuge 관 (4 × 106 비드에 대응하는) 재 부유 상자성 비드의 40 μL 분취. </li><li> 자기 separati에 튜브를 배치용액으로부터 자성 비드를 분리하기 위하여 스탠드. , 상층 액을 버리고 자기 분리 스탠드에서 튜브를 제거하고 1 mL의 0.1 M 나트륨 인산 산도 7.4의 구슬을 재현 탁. <ol><li> 1 mL의 0.1 M 나트륨 인산의 pH 7.4와 두 번 반복 세척 단계. </li></ol></li><li> 최종 세척 후, 1 mL의 0.1 M 나 - 인산염 pH가 7.4에서 구슬을 재현 탁. </li><li> 수확기 100 μg의 소 피브로넥틴 (FN) 또는 비드를 함유하는 1 ㎖의 0.1 M 나트륨 포스페이트 pH를 7.4으로 다른 세포 접착 수용체 리간드 피펫 팅하여 혼합한다. </li><li> FN 또는 음의 컨트롤에 대한 BSA, 폴리 D 라이신 또는 아포 트랜스페린과 다른 특정 리간드를 대체하여 이전 단계를 반복합니다. </li><li> 선택적으로, 겔 분석, 가교 효율 분석을위한 리간드 용액의 10 μL 나누어지는을 농축 램 믈리 샘플 버퍼의 적절한 볼륨과 혼합한다. </li><li> 회 전자에 37 ° C에서 12 ~ 24 시간 동안 리간드 함유 용액에 구슬을 품어. </li><li> 반응이 더 이상 10-20 초간, 초음파 처리 (39 W의 연속 전력)을 발생한 후 비드 응집체 나타나면. </li><li> 자기 분리 스탠드를 사용하여 구슬을 분리, 나머지 솔루션을 기음과 PBS 1 ㎖ / 0.2 % BSA의 pH가 7.6 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 37 ° C에서 회 전자에 1 시간 동안 품어. </li><li> 1 mL의 PBS / 0.2 % BSA의 pH를 7.6로 두 번 자석을 이용하여 구슬을 씻으십시오. 1 mL의 PBS에 재현 탁 비즈 / 0.2 % BSA의 pH가 7.6. </li><li> 초음파 처리 비즈 집계 이하 20 ~ 30 초 동안 표시합니다. </li><li> 선택적으로, 서양 얼룩에 의해 결합 효율을 분석하기 위해 10 μL 나누어지는을 제거 (농축 램 믈리 샘플 버퍼의 적절한 볼륨과 혼합). </li><li> 최대 1 개월 4 ° C에서 분석하거나 저장 비즈 셀로 이동합니다. </li><li> 선택적으로, 자석 구슬로 FN 가교를 분석 쿠마 블루와 SDS-PAGE 젤과 얼룩을 실행합니다. </li></ol> 지느러미에 부착 수용체에 결합 된 리간드 코팅 구슬에 인장 부대 2. 응용 프로그램세포의 표면 <ol><li> 적절한 성장 배지 60mm 조직 배양 접시에 부착 배양 세포는 80 % 컨 플루 언시에 도달 할 때까지 (일반적 DMEM 4.5 g / L D- 글루코스는 10 % FCS로 보충). </li><li> 비 변성 비 이온 용해 완충액 (20 mM 트리스 염산 pH를 7.6, 150 mM의 NaCl을 2 밀리미터의 MgCl 2, 0.1 % NP-40) 및 냉각 마이크로 원심 튜브를 준비한다. </li><li> 1 mL의 PBS 섹션 1.10에 resuspend에서 리간드 - 코팅 된 비드 펠렛 / 0.2 % BSA의 pH가 7.6. 따뜻한 문화 매체와 소용돌이의 5 ㎖에 리간드 - 코팅 된 비드 용액 100 μL를 추가합니다. </li><li> 대기음 60mm 배양 접시에 중간 5 mL를 구슬로 보충 따뜻한 성장 매체를 추가합니다. </li><li> 세포 배양 조건에서 20 분 (37 ℃, 5 % CO 2) 비드 침전물과 셀에 부착 할 수 있도록 부화. 이 구슬은 식균 작용에 의해 내면화 될 수 있기 때문에 20 분을 초과하지에 매우 중요합니다. </li><li> 선택적으로, 10 배 또는 20 배 OBJE을 사용하여 광학 현미경 하에서 비드를 관찰이 뽑은 약간 부착 떠있는 구슬을 구별 할 수있는 요리를 흔들어 비드 부착을 확인합니다. </li><li> 인큐베이터에서 배양 접시를 유지하면서 상면에 부착 된 원형 38mm 네오디뮴 자석 덮개에 대한 일반 접시 뚜껑 교체. 자석은 상기 덮개의 하부면에 위치하는 두 개의 작은 13mm 네오디뮴 자석에 의해 제자리에 유지된다. 자석은 매우 강력하기 때문에, 신중하게 조작 할 수 있습니다. </li><li> 세포 배양 조건에서 원하는 시점에 대한 장력 (37 ℃, 5 % CO 2) 실시 세포를 인큐베이션. </li><li> 치료 후, 얼음에 접시를 놓고 조심스럽게 접시에서 전체 매체를 대기음. </li><li> 세포 용해 완충액 300 μL를 추가하고 얼음에 10 분 동안 품어. 미리 냉장 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 휴대 스크레이퍼 및 전송을 사용하여 해물를 수집합니다. </li><li> 자기 분리 스탠드를 이용하여 자성 비드를 펠릿 새로운 프리 진정 총 세포 용 해물을 전송할1.5 ML의 microcentrifuge 관 에드. 추가 분석을 위해 -20 ° C에서이 부분을 저장합니다. </li><li> 1 ML의 얼음처럼 차가운 용해 버퍼로 구슬을 3 회 반복한다. 비드 펠렛 50 μL 램 믈리 시료 완충액 추가 건조 히터 블록을 사용하여 5 분 동안 95 ℃에서 비등 피펫으로 혼합한다. 이 부분은 절연 접착 단지가 포함되어 있습니다. -20 ° C에서 생화학 분석이나 가게에 진행합니다. </li><li> 비즈 분리 (약 300 μL) 후의 전체 세포 용 해물에서 웨스턴 블롯 분석을위한 50 μL 나누어지는을 제거합니다. 주 : 단백질 - 단백질 상호 작용 연구 (면역, GST 풀다운 분석) 또는는 GTPase 활성 실험으로서 상기 생화학 적 연구에 사용될 수있는 남아 250 μL (용해 완충액 변화가 주목는 GTPase에 따라 필요할 수있다). </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+processes+mediate+cellular+mechanotransduction.">Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction.</a> Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).</li><li>Seo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mechanogenetic+Toolkit+for+Interrogating+Cell+Signaling+in+Space+and+Time.">A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time.</a> Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언합니다.

여기에 기재된 방법은 세포 표면 접착 수용체에 장력을 적용하고 그 이후의 정제를 허용하는 간단한 방법을 구성한다. 그러나 일부 단계는 대상 접착 수용체에 따라 효율적으로 접착 정화 및 잠재적 인 최적화를 수행 할 수 있습니다 수행하는 것이 중요하다. 우리는 사용자가 아래에 발생할 수있는 잠재적 인 문제를 제시한다. 우리는 2.8 μm의 직경 자성 비드를 사용하지만, 더 큰 비드는 4.5 μm의 직경을 사용할 수있다. 식균 작용은 30 ~ 60 분 배양시보다 신속하게 발생할 수있는 그 구슬 변위가 자기장 (34), (35)에 따라 제한 될 수 있도록 더 큰 구슬이 강한 접착력을 가지고 있기 때문에, 구슬의 직경은 2-5 μm의 제한되어야한다. 따라서, 짧은 시간에 배양 시간을 제한하고 적절한 비드 크기를 사용하는 것이 중요하다. 셀당 인큐베이션 비드의 수 (F)의 양에 영향을 미칠하나의 세포에 의해 ORCE 경험. 일을 효율적으로 긴장과 세포를 자극하고 싶어하지만, 셀 당 너무 많은 구슬 관련이없는 신호 전달 경로의 활성화로 이어질 수 있습니다. 우리는 일반적으로 FN 코팅 비드 셀당 두 비드의 평균을 부화하지만,이 량은 세포 형태 및 세포 표면 수용체에 의존하여 1 내지 5 개의 비드 셀당] 조정될 수있다. 자석과 관련하여, 여기에 기재된 방법은 비록 원액 글리세롤 공지 점도 31 뉴턴 액체 중의 자성 비드의 변위를 측정하여 2.8 ㎛의 결과에 큰 힘 (약 30-40 PN 측정되어있는 자석을 사용 수 필요한 경우 힘의 큰 금액을 적용하기 위해 더 큰 자석을 사용합니다.이 자석은 매우 강력 참고하고주의 깊게을 조작하는 것이 중요하다. 뿐만 아니라 PBS / 0.2 % BSA 산도 7.6 버퍼 1 시간 보육 (단계 1.9) 이후로 ECM 리간드 (단계 1.7)에서, m와 12 ~ 24 시간 배양 후agnetic 마이크로 비즈가 집계를 형성 할 수 있습니다. 또한 셀당 2 비드 비율을 존중 가능한 비드를 분리하는 다음 중요하다. : 1 비율로 그러나 여전히 5가 허용된다면. 비즈 분리 혼합하고 피펫 또는 초음파를 사용하여 어느 달성 될 수 있지만, 짧은 기간 (20-30들). 다양한 단백질들은 인테그린 리간드 (FN, 콜라겐) 특정 세포 표면 수용체를 표적 재조합 단백질 또는 항체를 포함하는 비드에 접합 될 수있다. 지느러미 세포 표면에 리간드 - 코팅 자석 구슬의 첨부 파일은 구슬 위에 리간드의 낮은 커플 링 효율에 의해 약화 될 수 있습니다. 이는 비드와 커플 링 과정의 끝에서 비드의 분취 량을 첨가하기 전에 희석 된 리간드 용액의 분취 액을 수집하여 비드에 결합하는 리간드를 확인하기 위해 추천된다. 이 분취 량을 SDS-PAGE 분석하고 쿠마시 블루 염색으로 처리 될 수있다. 어떤 변화하는 경우경로 또는 감지 예상 mechanosensing 프로세스 신호, 다른 가능성을 고려하는 것이 중요합니다. 문제를 식별하는 방법 중 하나는 자석을 실험의 지속 기간을 조절하는 것이다. 또한 세포 프로세스의 속도가 사용 된 세포 유형에 따라 변화하는 것이 알려져있다. 또 다른 옵션은 알려진 장력에 민감한 분자를 테스트하고 블로 팅 서쪽으로 자신의 포스트 번역 수정을 확인하는 것입니다 (인스턴스 paxillin 인산화 또는 FAK 인산화 분석 할 수있다). 힘의 크기는 매우 중요하고 옵션 일 수있는 두꺼운 자석 (동일한 등급 N52) 또는 더 큰 비드를 사용 할 수있다. 또한, 리간드 / 수용체 결합 효율 분석 접착 복잡하여 탐색 (예 : 카데 또는 인테그린 등) 세포 표면 수용체에 대해보고 할 수있다. 세포의 생장은 장력에 세포 반응에 영향을 미칠 수있다. 이 세포 행동 cystokeletal 프리스트레스 영향을 미칠 수있는 세포 / 세포 부착을 관찰 한 바와 같이, 그것은 importan 인t는 포화 상태가 긴장에 대한 세포 반응에 영향을 미칠 수 있으므로주의한다. 우리는 인테그린 기반 유착에 장력을인가하여 80 %의 컨 플루 추천해도, 다른 조건이 실험 시스템을 최적화하기 위해 테스트 될 수있다. 이 방법은 인장 성 adhesome과 관련된 신호 전달 경로를 해독하는 강력한 도구를 제공하지만, 또한 몇 가지 제한이 있었다. 이러한 작은 크기의 자성 비드를 사용하여 주요 관심사가 세포에 의한 그들의 내재화의 위험이 있기 때문에 먼저, 본 방법은 분화 및 증식과 같이 세포의 운명을 수정 장기 mechanosensitive 시그널링 세포 반응 연구에 이용 될 수 없다. 또 다른 한계는 힘이 배양 접시에 세포의 레이어에 적용하는 방법의 방법에있다. 자기장이 자석의 주변에 항상 높기 때문에 실제로, 힘은 셀의 감소 구배로 배양 접시의 표면에 달라 있었다중심 주위에서 연신 이종 세포 반응을 초래할 수있다. 여기에 설명 된 절차 mechanosensitive 세포질 통로 연구뿐만 아니라 장력 실시 접착 착체의 분자 조성을 조사 할 수있는 간단하고 비용 효율적인 방법을 구성한다. 이러한 세포 환상 변형을 적용 장치를 신장과 같은 다른 접근 방법은, 세포 외 매트릭스와 상호 작용하는 모든 세포 표면 수용체에 대한 장력의 적용으로 이어질. 여기에 기재된 방법은, 리간드 또는 세포 표면 수용체를 표적으로하는 항체를 인테그린 많은 별개 mechanosensitive 시스템의 조사를 허용로서 사용될 수있다 세포 표면 수용체의 특정 서브 세트와 리간드의 많은 다양한 힘 자극 할 수있는 장점이있다. 이 방법의 또 다른 장점은 장력을 경험 eleme을 loadbearing에서 작동하는 단백질 복합체의 정제에 이르게한다는 것이다알려진 국세청은 mechanotransduction (36)에 중심적인 역할을합니다. 정제 접착 착물은 장력 또는 액틴 중합 분석에 응답 키나아제 활성을 검사하기 위해 키나아제 분석법 등의 다양한 생화학 적 방법 (14)에 사용될 수있다. 또한이 실험 시스템은 셀룰러 기계적 응답을 탐색하고, 상기 식별 된 신호 경로로이 응답을 상관시키는 자기 핀셋으로 연결될 수있다. 흥미롭게도, magnetoplasmonic 나노 입자는 시간과 공간 (37)의 정확한 제어와 부하 노치와 E-cadherin의를 기계적으로 최근에 사용되어왔다. 이 최근의 개발은 서로 다른, 공간, 시간 및 기계적 입력이 mechanosensitive 신호 전달 경로를 탐색하는 데 도움이 될 수 있습니다.

후생 동물에서 기계적인 긴장은 증식, 분화 및 생존 1, 2 등 세포 프로세스의 무수의 조절을 통해 조직 개발 및 항상성을 지시합니다. 기계 긴장은 세포 외 기질에서 발생할 수 또는 부착 세포 샘플 세포 외 기질에 끌어과 긴장에 민감한 분자를 통해 강성을 프로브 액토 마이 오신의 수축성 기계를 통해 자신의 세포 외 환경을 생성 할 수 있습니다. 장력에 응답하여, mechanosensitive 접착 단백질은 복잡한 신호 캐스케이드를 트리거 형태 적 변화를 겪는다. 차례로,이 신호 전달 경로는 세포 외 환경에 세포의 행동을 조정 증식, 분화 및 생존을 포괄 mechanoresponse을 조율. 이러한 프로세스는 빠르게 메카의 루프에 다시 공급하는 (초 분) 단기 기간에 정착 될 수있다<html> mechanosensitive 구조를 수정하여 notransduction. 예를 들어, 인테그린 기반 유착의 Rho는 GTPase 매개 골격 리모델링 3, 4, 5 내지 장력에 응답하여 강화한다. 병행하여, 다른 신호 전달 경로는 결국 세포의 운명 (6) 영향을 미치는 유전 적 프로그램을 제어하는 시간 일 동안 활성화됩니다. 많은 연구가 세포 결정론 질병 발전 1, 2에 매트릭스 강성의 영향을 강조하는 반면, 접착 매개 mechanotransduction의 정확한 분자 메커니즘은 아직 어려운 남아있다. 다양한 방법은 유동 시스템, 형광 공명 에너지 전달 (FRET) -tension 센서 (7)를 포함하여 세포 행동에 셀 생성 힘이나 외력의 영향을 연구하기 위해 개발되어왔다아가씨 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 8 호환 기판 (9) 자기 핀셋, 광 핀셋 (10)과 원 자간 력 현미경 (AFM) 11. 여기에서 우리는 특정 접착 수용체에 적용되는 인장 힘에 반응 mechanotransduction 경로의 특성을 초상 자성 비드를 사용하여 프로토콜을 제시한다. 상자성 비드 자기장에 배치 될 때 가역적으로 자화 입자이다. 일단 특정 수용체에 대한 리간드로 코팅이 비드 외 힘 부여의 효과를 연구하기위한 강력한 도구를 제공한다. 이 방법은 여러 연구 3, 5, 12에 의해 검증 된 - (17)과 주로 부착 세포의 생화학 적 분석을 용이하게하는 이점을 제시한다. 생화학 분석 하였다 유사한 콜라겐 - 코팅 된 자성 비드를 이용하여, 초기 작업은 증가를보고긴장 5, 18, 19에 응답 단백질 티로신 인산화에서 RhoA 정품 인증. 후술하는 방법은 3 인테그린인가 장력으로부터 하류 신호 전달 경로의 특성을 피브로넥틴 (FN) 코팅 된 비드와 함께 사용되어왔다. 이 연구에서, Guilluy 등. 장력이 인테그린 접착 단지에 두 개의 구아닌 염기 교환 요인 (GEFs), larg의 및 GEF-H1의 모집을 통해에서 RhoA를 활성화 것으로 나타났다. 그 때문에, 다른 연구는 GEF-H1은 여기에 설명 된 방법론의 견고성을 보여주는, 다른 방법 (20), (21)를 사용하여 세포 생성 긴장에 대한 응답으로 접착 단지에 채용되는 것으로 나타났습니다. 결과적으로, 활성화는 세포 골격에서 RhoA 리모델링을 통해 접착력 강화를 촉진하기 위해 도시 하였다. 이 시스템은 또한 긴장 적용 t을 탐구하는 데 사용 된세포 / 세포 부착 수용체 O. 인테그린 관련 접착 단지 (12)과 유사하게 vinculin 모집의 증가를 유도 E-cadherin의의 세포 외 도메인으로 코팅 된 자성 비드 상 힘의 응용 프로그램입니다. 콜린스와 그의 동료들은 PECAM-1 인테그린 촉진에서 RhoA 활성화 13 긴장의 응용 프로그램을 관찰했다. 자석 구슬을 사용하여 또 다른 실험 방법은 격리 된 핵에 적용 긴장의 연구이다. nesprin-1 핵 엔벨로프 단백질에 대한 항체로 코팅 된 비드를 사용하여, 핵막 착물들은 동적 기계적 장력 (22)에 응답하여 조절되는 것을 보여 정제 하였다. 이러한 결과는 mechanotransduction 경로의 연구에서이 방법의 강력 함을 지원합니다. 흐름 또는 견인력 시스템은 일반적으로 세포 과정을 촉진하면서 또한, 자성 비드는 특히 수용체 리간드를 사용하여 세포 부착 수용체 타겟팅 (13), (15)에 대한 모노클로 날 항체. 이 방법의 또 다른 장점은 간단한 리간드 친 화성 정제 절차를 접착 복합체의 분리이다. 잘 세포에 대한 리간드 - 코팅 구슬의 추가가 부착 수용체를 결합하여 여러 가지 접착 단백질 (23)의 채용을 유도하는 것으로 알려져있다. 리간드 - 코팅 자석 구슬에 힘 또한 응용 프로그램 (24)는, 다양한 장력에 의존하는 신호 전달 경로 (4)을 매개 거대 플랫폼으로 이러한 접착 단지를 켭니다. 자석을 이용하여 비드 농축하여 세포 용해는 접착 플랫폼의 격리를 허용한다. 접착 복합체를 정제하는 데 사용하는 다른 방법이 이미 부착 세포에 사용되어왔다. 이들은 단백질 - 단백질 상호 작용을 보존하는 화학 가교 결합세제 및 전단 흐름 또는 초음파 20, 21, 25, 26, 27, 28에 의해 세포 용해 단계. 마지막 단계는 접착 성 복합체를 함유하는 생성 된 복부 원형질막의 집합이다. 이들 방법과는 달리, 자성 비드를 선택적으로 접착 수용체의 특정 패밀리를 표적으로하여 세포 부착 복합체 더 정제 레벨을 허용한다. 자성 비드가 이미 리간드 피복 된 마이크로 비드 (29), (30)에 부착 된 비 - 부착 세포 접착 복합체를 정제하는 데 사용되어왔다. 힘이 짧은 지속 시간 (분 초)에 적용되는 모방 생물 상황을 설명하는 방법. 따라서, 정제 접착 착체의 분자 구성 모두를 조사하기위한 강력한 도구를 제공하며하류 mechanosensitive-신호 전달 경로. 여기에서 우리는 접착 표면 단백질에 인장 힘을 적용하는 자석 구슬 사용에 대한 자세한 실험 프로토콜을 제시한다. 영구 네오디뮴 자석은 배양 접시 표면의 상단에 배치됩니다. 단일 2.8 ㎛의 자성 비드의 힘 상수 (30-40 PN) (31)가되도록, 자석의 자극면을 6 mm의 높이로 배치된다. 인장 자극 시간은 관심과 활성화의 시간 스케일의 분자에 따라 작업자에 의해 결정된다. 세포는 마지막으로 접착 단지는 자석을 사용하여 비즈 분리로 정제하고, 생화학 적 분석 처리, 용해된다. 이 프로토콜은 리간드 - 코팅 된 상자성 비드의 제조 방법 및 생화학 적 분석 하였다 자석 관통 장력의 적용을 포함한다. 또한, 우리는 인테그린 기반 ADH에 적용하는 장력을 보여주는 데이터의 대표 샘플을 제공esions 접착 리모델링을 유도 단백질의 티로신 인산화를 바꾼다.

<table><tbody><tr><td>Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)</td><td>K&amp;amp;J Magnetics, Inc</td><td>DX88-N52</td><td>grade N52 dimension: 1 1/2&quot; dia. x 1/2&quot; thick</td></tr><tr><td>Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)</td><td>K&amp;amp;J Magnetics, Inc</td><td>D84PC-BLK</td><td>grade N42 dimension: 1/2&quot; dia. x 1/4&quot; thick Black Plastic Coated&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dynabeads M280 Tosylactivated</td><td>Thermofisher</td><td>14203</td><td>superparamagnetic beads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermofisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><td>Fibronectin from bovine plasma</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1428-50MG</td><td>Bovine Apo-Transferrin</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>DMEM+GlutaMAX-I 500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>60*15 mm culture dish</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing cell surface adhesion remodeling in response to mechanical tension using magnetic beads

Mechanosensitive 세포 표면 접착 착물 셀들은 주변의 기계적 특성을 감지 할 수있다. 최근의 연구는 접착 부위에 힘을 감지 분자 및 혈통 특정 유전자 발현을 조절하고 표현형 출력을 구동 힘에 의존하는 전사 인자를 모두 확인했다. 그러나, 생화학 적 경로에 기계적인 긴장을 변환 신호 네트워크는 애매 남아있다. 세포 표면 수용체에 적용된 기계적 장력에 종사하는 신호 전달 경로를 탐색하기 위해, 초상 자성 마이크로 비즈가 사용될 수있다. 여기서 우리는 세포 표면의 접착 단백질의 힘을 적용하는 자성 비드를 이용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법을 사용하면, 리간드 피복 된 비드에 부착 된 접착 단지 자기 분리에 의해서도 힘 따라 다양한 생화학 적 방법에 의해 세포 내 신호 전달 경로, 또한 접착 리모델링을 조사 할 수있다. 이 프로토콜은 리간드 공동의 제조를 포함ated 초상 자성 구슬, 그리고 응용 프로그램이 생화학 적 분석 한 다음 인장 힘을 정의합니다. 또한, 우리는 인테그린 기반의 접착에 적용하는 장력을 보여주는 데이터의 대표 샘플이 부착 리모델링을 유발 단백질 티로신 인산화를 변경 제공합니다.

기술의 개략도는도 1a에 도시되어있다. 리간드 결합 후, 자성 비드를 20 분 동안 세포를 배양 한 후 영구 자석은 시간의 다양한 시간 동안 30-40 PN의 인장력을 적용하기 위해 사용된다. 도 1b는 MRC5 세포 부착 수용체에 결합 2.8 μm의 FN 코팅 된 자성 비드를 나타낸다. 세포 용해 후의 초상 자성 비드의 세정 단계는 매우 중요 및 정제의 정도를 결정한다. 세 세척의 최소 권장합니다. 장시간 노출과 GADPH의 면역 블롯은 접착 단지의 순도 (그림 2a)을 테스트하는 데 유용 할 수 있습니다. FN 코팅 비드 장력에 응답하여 접착 복합체에서 시간이 지남에 따라 발생하는 mechanotransduction 프로세스를 조사 하였다. 접착 복잡한 분획 자기 분리 한 후, 파쇄물 및 밀착성 복잡한 분획을 분석 하였다웨스턴 블롯. 예상대로, 우리는 심지어 기계적 자극 (그림 2b)의 부재에 접착 단지의 부분에서 talin, vinculin 및 paxillin,하지만 GAPDH를 관찰했다. 이전 보고서 (32)과 일치, 33, 긴장 접착 단지에 vinculin 모집을 트리거. 장력이 접착 복합체 paxillin 채용에 영향을주지 않았으나, 31 티로신 인산화의 총 세포 용 해물과 밀착성 복잡한 분획 모두 기계적 장력에 응답하여 확장되었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55330/55330fig1.jpg" /> 방법 1. 설명도. (A) 기술의 도식입니다. 원하는 포화 상태에 도달 할 때까지 세포는 우선 매체 문화에서 배양된다. 그런 다음, 초상 자성 구슬은 15 ~ 20 분 동안 추가됩니다. 인장 힘은 약 30 ~ 40 PN 있습니다다음 시간에 다른 양 보정 자석을 사용하여 적용 하였다. (B) 피브로넥틴 - 코팅 된 상자성 비드는 세포 접착 수용체에 결합한다. 세포 매체의 초상 구슬 (흰색 화살표)를 추가 한 후 전송 된 광 현미경 15 분에 위상차에 의해 촬영된다. (위 이미지 : 스케일 바 = 25 μm의, 하단 이미지 : 스케일 바 = 100 μm의) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55330/55330fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55330/55330fig2.jpg" /> 도 2 기계적 장력은 접착 성숙을 유도한다. 접착 착물 (A)의 정제. GAPDH의 면역 전체 세포 용 해물에 대한 로딩 대조군으로 사용되는 접착 성 복합체의 순도를 확인하기 위해. 니트로 셀룰로오스 막을 일을 보여 긴 노출을 사용하여 몇 군데있다접착 복잡한 부분에서 신호의 전자 부재. (B) 인장 접착 성숙을 유도한다. 로드 제어 (GAPDH) 및 기계적 장력에 대한 응답으로 모집 또는 접착 단지에서 인산화되는 것으로 알려져 후보 (vinculin, talin 및 paxillin는) immunoblotted된다. 이 실험은 MRC5 세포에서 수행되었다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55330/55330fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

이들은 기계적 장력 송신 조직 항상성 및 개발에 관여하는 신호 전달 경로를 시작으로 세포 표면 유착은 mechanotransduction 중앙이다. 여기서는 리간드 피복 된 자성 마이크로 비드 접착 수용체 포스 응용 프로그램을 사용하여, 인장에 응답하여 활성화되는 생화학 적 경로를 해부위한 프로토콜을 제시한다.

자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K 조회수.  Centre de recherche UGA - INSERM U1209 - CNRS UMR.  이들은 기계적 장력 송신 조직 항상성 및 개발에 관여하는 신호 전달 경로를 시작으로 세포 표면 유착은 mechanotransduction 중앙이다. 여기서는 리간드 피복 된 자성 마이크로 비드 접착 수용체 포스 응용 프로그램을 사용하여, 인장에 응답하여 활성화되는 생화학 적 경로를 해부위한 프로토콜을 제시한다. 

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Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

세포 수축을 Quantifying에 대한 불만 사항 매트릭스의 준비

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

연구

생체공학

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

트위스트와 토크의 측정을위한 자석 집게

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

상상 속의 세포 부착 분자의 특성에 대한 비드 집계 분석 실험

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

견인 힘 현미경의 세포 배양 표면 근처 지역화 기자 형광 구슬을위한 새로운 방법

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

생화학

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

힘에 민감한 요소에 대한 나노 역학 측정을 위한 고속 자기 핀셋

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

<meta charset="utf8"></head><body>제브라피시 심장의 자성 구슬을 사용한 생체 내 기계형질 도입 연구

Manipulating Mechanical Forces in the Developing Zebrafish Heart Using Magnetic Beads

Mechanical forces continuously provide feedback to heart valve morphogenetic programs. In zebrafish, cardiac valve development relies on heart contraction and physical stimuli generated by the beating heart. Intracardiac hemodynamics, driven by blood flow, emerge as fundamental information shaping the development of the embryonic heart. Here, we describe an effective method to manipulate mechanical forces in vivo by grafting a 30 &#181;m to 60 &#181;m diameter magnetic bead in the cardiac lumen. The insertion of the bead is conducted through microsurgery in anesthetized larvae without perturbing heart function and enables artificial alteration of the boundary conditions, thereby modifying flow forces in the system. As a result, the presence of the bead amplifies the mechanical forces experienced by endocardial cells and can directly trigger mechanical stimulus-dependent calcium influx. This approach facilitates the investigation of mechanotransduction pathways that govern heart development and can provide insights into the role of mechanical forces in cardiac valve morphogenesis.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 제브라피시 심장 형성에 관련된 기계적 힘 이해

This protocol outlines a method for grafting a magnetic bead into the developing zebrafish heart through microsurgery, enabling the manipulation of mechanical forces in vivo and triggering mechanical stimulus-dependent calcium influx in endocardial cells.

자성 구슬을 사용하여 발달 중인 제브라피시 심장의 기계적 힘 조작

Mechanical forces continuously provide feedback to heart valve morphogenetic programs. In zebrafish, cardiac valve development relies on heart contraction ...

자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석

요약

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세포 수축을 Quantifying에 대한 불만 사항 매트릭스의 준비

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

트위스트와 토크의 측정을위한 자석 집게

상상 속의 세포 부착 분자의 특성에 대한 비드 집계 분석 실험

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Magnetic Tweezers in a Microplate Format

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자성 구슬을 사용하여 발달 중인 제브라피시 심장의 기계적 힘 조작

자성 구슬을 사용하여 발달 중인 제브라피시 심장의 기계적 힘 조작

자성 구슬을 사용하여 발달 중인 제브라피시 심장의 기계적 힘 조작