우리의 프로토콜을 통해 연구자들은 정제 된 구성 요소에서 세포 골격 모티프를 구축하고 이러한 네트워크가 생성하는 힘을 직접 측정하여 세포의 기계적 구성 요소가 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 어떻게 기능하는지 이해할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 힘을 정량화하고 이러한 숫자를 직접 상관시켜 단백질 농도 및 밀도를 포함하여 관련된 단백질의 매개 변수를 유지할 수 있습니다. 일반적으로 셀 내에서 획득이 불가능한 매개 변수입니다.
이 방법은 유사분열이나 신경 발달과 관련된 것과 같은 모든 유형의 세포골격 네트워크에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 사용되는 이 특정 단백질을 단순히 교체함으로써 근육 수축 또는 세포 이동과 관련된 네트워크를 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 방법의 가장 까다로운 측면은 단일 빔 광학 트랩과 TIRF 현미경을 포함한 다양한 기술의 조정입니다.
또한 단일 분자 실험은 커버 슬립과 같은 표면을 신중하게 준비해야 하므로 고품질 샘플을 준비하는 것이 가장 중요합니다. 빈 피펫 팁 상자의 바닥에 초순수를 적신 보푸라기가 없는 접힌 티슈를 배치하여 습도 챔버를 구성하는 것으로 시작하십시오. 채널의 한쪽 끝에서 액체를 피펫팅하고 반대쪽 끝에서 액체를 배출하여 모든 시약을 주입합니다.
20 마이크로 리터 각도의 피펫 팁을 사용하여 밀리리터 당 0.5 밀리그램의 스트렙타 비딘 또는 NeutrAvidin의 10 마이크로 리터를 천천히 흘립니다. 커버 슬립이 아래를 향하도록 하여 습도 챔버에서 슬라이드를 4분 동안 배양합니다. 보푸라기가 없는 티슈를 사용하여 20마이크로리터의 1x BRB80을 사용하여 챔버를 플러시하여 액체를 꺼냅니다.
흐르는 시약을 반복하고 1회 더 인큐베이션한 후, 10 마이크로리터의 0.5 밀리리터 카제인 블로킹 용액으로 플러시 단계. 10마이크로리터의 희석된 비오티닐화된 원적색 미세소관을 챔버로 흘린 다음 20마이크로리터의 1x BRB80으로 챔버를 플러시합니다. 시약을 흘려주고 이전에 입증된 바와 같이 인큐베이션한 후, 연구할 적절한 농도의 비운동 단백질 10 마이크로리터로 단계를 플러시한 다음, 10 마이크로리터의 로다민 마이크로소관에 유동시키고, 인큐베이션 및 플러싱을 반복한다.
다음으로, 1마이크로리터의 리고르 키네신 코팅 비드와 19마이크로리터의 반응 완충액을 결합합니다. 투명한 매니큐어로 챔버의 양쪽 가장자리를 밀봉하고 광택제가 마를 때까지 기다리십시오. 전체 내부 반사 형광 이미징 기능이 있고 단일 빔 광학 트랩이 구성된 도립 현미경 기기를 사용하십시오.
샘플 챔버의 커버 슬립에 침지 오일 1방울을 추가합니다. 샘플 챔버의 커버 슬립 쪽이 아래를 향하도록 하여 이미징할 샘플을 현미경 플랫폼에 놓습니다. 커버 슬립과 오일을 통한 대물렌즈 사이에 접촉이 있도록 대물렌즈를 천천히 들어 올립니다.
샘플 챔버의 커버 슬립 표면에 초점이 맞춰지도록 대물 높이를 조정합니다. 세 채널 모두에서 샘플의 단일 프레임 이미지를 기록합니다. 여기서 실험하려면 100-200 밀리 초의 노출을 사용하십시오.
레이저 출력을 조정하여 샘플에서 우수한 신호 대 잡음비를 달성하는 동시에 개별 번들을 분석할 때 2-5분에 걸쳐 광 표백을 최소화합니다. 시야당 미세소관 다발의 빈도는 챔버당 100마이크로리터 시야 x 100마이크로리터당 약 3-4개의 미세소관 다발이어야 합니다. 현미경에서 명시야와 100x 대물렌즈를 사용하여 샘플의 비드 밀도를 관찰합니다.
비드가 평균적으로 서로 최소 10마이크로미터가 되도록 비드 농도를 사용하고 어떤 종류의 표면 구속 또는 클러스터링도 없는지 확인합니다. 비오티닐화된 원적색 미세소관이 커버 슬립 표면에 단단히 부착되어 있고 로다민이 눈에 띄는 브라운 움직임이 없는지 확인하십시오. 로다민 미세소관이 가교 지도를 통해 비오티닐화된 미세소관에 부착되고 자유 말단에서 눈에 띄게 변동하는지 확인합니다.
두 개의 미세소관만 포함하는 적합한 미세소관 다발을 식별하고, 하나는 전체 표면 부착으로 비오티닐화되고 다른 하나는 용액이 부분적으로 없고 x축 또는 y축에 정렬된 비오티닐화 미세소관을 식별합니다. 광학 트랩을 사용하여 브라운 운동을 보여주는 자유 비드를 캡처합니다. 비드가 포획되면 비드를 선택한 미세소관 다발로 조심스럽게 옮겨 공정에서 다른 비드가 트랩으로 당겨지지 않도록 합니다.
비드가 가교 단백질을 포함하는 중첩 영역으로부터 수 마이크론 떨어져 있는지 확인하십시오. 로다민 미세소관의 자유 세그먼트의 가장자리와 접촉할 때까지 z축의 비드를 조심스럽게 내립니다. 부드럽게 위로 당기고 미세소관 축에 수직으로 이동하여 로다민 미세소관이 구부러지는 것을 관찰하고 비드 위치를 따라 부착 여부를 확인합니다.
나노 포지셔닝 단계를 이동하여 표면 부착 미세소관의 미세소관 축을 따라 로다민 미세소관을 조심스럽게 재정렬하고 미세소관 다발을 자동으로 당기기 위한 매개변수를 설정합니다. 미세 소관의 평행 축을 따라 방향을 설정하십시오. 오버랩 길이에 따라 원하는 당김 속도와 원하는 당김 시간을 설정합니다.
초당 1-2 프레임의 속도로 3 개의 채널에 형광 데이터 기록을 시작합니다. 최적화 된 레이저 출력과 노출 시간을 사용하십시오. 자동 스테이지 모션을 시작하고 위치 감지 검출기 스테이지 및 전반사 형광 카메라 스테이지에서 트래핑 데이터를 기록합니다.
트랩을 비활성화하여 비드를 해제하고 원하는 대로 실험을 반복합니다. 필수 유사분열 운동 단백질 키네신-5의 앙상블은 중첩 길이에 따라 선형으로 확장되는 밀기력과 제동력을 모두 생성하여 미세소관 슬라이딩을 조절할 수 있습니다. C-말단 테일 도메인은 효율적인 가교 및 힘 생성을 위해 필요하다는 것을 알 수 있었다.
전장 단백질은 모든 운동 단백질이 개별 실속 력에 도달 할 때 정체되는 지속적인 힘을 생성 할 수 있습니다. 그러나 C- 단자 꼬리가없는 kinesin-5 모터는 크기가 거의 5 배 더 작은 최대 힘을 생성합니다. 비 운동 유사 분열 단백질 PRC1의 앙상블은 아나 페이즈 스핀들 중간 영역에서 미세 소관 미끄러짐에 저항하는 기계적 대시 포드로 작동합니다.
저항력은 미세소관 쌍 사이의 중첩 영역 길이 또는 국소 가교제 밀도에 의존하지 않지만 결합된 PRC1 분자의 총 농도에 크게 의존합니다. 이 방법은 대체 단백질을 사용하여 미생물 조직 및 뉴런과 같은 다양한 생물학적 시스템을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 또한 액틴 기반 네트워크 형상을 분석하여 근육 수축 또는 세포 운동성을 연구하기 위해 쉽게 확장할 수 있습니다.
이 기술을 통해 필라멘트가 트랙 및화물이며 단백질의 작은 앙상블로 구성된 고유 한 세포 전체 기하학을 연구 할 수 있습니다. 이러한 기하학은 수많은 생물학적 과정에서 세포에서 일어나는 일을 더 잘 모방합니다.
