Name: method for obtaining primary ovarian cancer cells from solid specimens
Uploaded: 2014-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
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우리는 환자의 조직 샘플 수집에 대한 지원은 미네소타 대학의 조직 조달 시설의 직원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 MB에 미네소타 난소 암 얼라이언스와 MB의 부인과 종양학 부서 기금에 의해, 랜디 면도기 암 연구 및 MB에 커뮤니티 기금, 국방부의 난소 암 연구 프로그램 (OCRP) MB에 OC093424에 의해 지원되었다. 출자자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 할 수있는 결정 또는 원고의 준비에 역할을했다.

윤리 정책 난소 암의 고체 시료는 기관 심사위원회위원회 후 미네소타 대학의 조직 조달 시설 (TPF)으로 하였다 : 인간의 제목위원회 (IRB)의 승인을. 1. 시약 설치 <ol><li> 10 % FBS, 100 단위 페니실린 - 스트렙토 마이신과 DMEM을 보완하여 완전한 DMEM 매체를 준비합니다. 4 ° C에서 미디어를 저장하고 따뜻한 37 ° C는 사용하기 전에. </li><li> 다수의 동결을 방지하기 위해 5 ~ 10 ㎖를 별도의 볼륨으로 나누어지는 디스 파제 II는 nonfrost없는 냉동고에 -20 ° C에서 해동 및 저장. </li></ol> 2. 조직 컬렉션 <ol><li> 거시적으로 병리학 자에 의해 암으로 확인 된 지역에서 수술시 난소 암 (크기 ~ 5의 g)의 고체 시료를 수집합니다. 임상 표본 드 식별 및 기관 프로토콜에 따라 등록됩니다. </li><li> 멸균, 사우스 캐롤라이나에있는 표본을 배치REW 뚜껑, 폴리 프로필렌은 빙냉 PBS 30 ㎖로 채워진 용기 표본. 시험편 컬렉션에서 30 분 (그림 1) 내에서, 얼음 처리를 위해 연구소에 외과 병리 실험실에서 시료를 수송한다. </li></ol> 3. 조직 처리 <ol><li> 멸균 조건 하에서 작동하는 페트리 접시 위에 시료 (60mm X 60mm) 신선 빙냉 PBS 10 ㎖를 함유하고 추가로 (2 ㎜ 이하)가 가능한 작은 조각으로 잘라 멸균 면도날을 사용하여 (전송 도 2a 및도 2 B). </li><li> DMEM에 디스 파제 II (2.4 U / ㎖) (30 분 37 ° C) 데워진 10 ㎖를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 다진 조직을 전송하고 30 분 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다. 표본의 최적의 소화를 보장하기 위해, 수동으로 세포 슬러리마다 5 분을 선동. </li><li> 30 분 배양, 전송 (사용 후10 ㎖의 혈청 피펫) 셀 스트레이너 (70 μM 메쉬) 상으로 세포 슬러리를 50 ㎖ 원추형 튜브의 상단에 배치하고 시린지 플런저를 사용하여 메시에 대해 완만 한 압력을 적용 할 수있다. (메쉬의 상단에 남아있는) 모든 해리되지 않은 조직을 무시하고 50 ㎖ 멸균 원뿔 관에서 얻은 세포 현탁액을 수집합니다. 4 ° C에서 7 분 (그림 3)에 대한 320 XG에 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 버리고 10 % FBS를 함유하는 DMEM으로 10 ㎖ 중에 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 셀 5 % CO 2에서 배양 접시에있는 서스펜션과 37 ° C (그림 4)을 품어. </li><li> 초기 도금에서 24 시간 후 매체를 변경합니다. 이 세포 파편의 제거 및 문화에 존재하는 적혈구의 대부분을 수 있습니다. </li><li> 매체에게 차 EOC의 문화가 다운 스트림 애플리케이션을위한 준비가 된 후 다음 두 주 동안 매 3 일, 변경합니다. </li></ol>

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	<li>Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. h. i. h. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+detection+and+treatment+of+ovarian+cancer:+shifting+from+early+stage+to+minimal+volume+of+disease+based+on+a+new+model+of+carcinogenesis.">Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).</li><li>Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+Cancer+Is+an+Imported+Disease:+Fact+or+Fiction.">Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction.</a> Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).</li><li>Sarojini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+detection+biomarkers+for+ovarian.">Early detection biomarkers for ovarian.</a> J. Oncol. , (2012).</li><li>Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nachtigal+M.W.+Primary+culture+of+ovarian+surface+epithelial+cells+and+ascites-derived+ovarian+cancer+cells+from+patients.">Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).</li><li>Tsao, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells+immortalized+by+human+papilloma+viral+oncogenes+(HPV-E6E7+ORFs).">Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs).</a> Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).</li><li>Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cultured+human+ovarian+surface+epithelial+cells:+phenotypic+plasticity+and+premalignant+changes.">Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes.</a> Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).</li><li>Brewer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+normal,+immortalized+ovarian+surface+epithelial+and+ovarian+cancer+cells+for+chemoprevention+of+ovarian+cancer.">In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer.</a> Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).</li><li>Sueblinvong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment,+characterization+and+downstream+application+of+primary+ovarian+cancer+cells+derived+from+solid+tumors.">Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li><li>Rockwell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-in+vitro+tumour+cell+lines:+characteristics+and+limitations+as+models+for+human+cancer.">In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer.</a> Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).</li><li>Wong, C., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+application+and+limitations+of+breast+cancer+cell+lines+to+study+tamoxifen+and+aromatase+inhibitor+resistance.">The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance.</a> J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

난소 암의 병인학 및 개발의 더 나은 이해가이 파괴적인 질환에 의해 영향을 여성의 결과를 개선하기 위해 매우 중요하다. 이러한 상황에서의 사용은 설립 &quot;시판되는&quot;난소 암 세포주는 의심 할 여지없이 대단히 유용왔다. 그러나 오늘 우리는 암 세포 라인들은 이성 9,10의 부족 등 많은 측면에서 시작된 인간의 종양을 반영하지 않고 있다는 것도 알고있다. 여기, 우리는 직접 수술 표본 격리의 30 분 이내에 난소 암의 임상 검체에서 분리 및 기본 난소 암 세포의 배양을위한 신속하고 신뢰할 수있는 방법을보고합니다. 일차 전지는 복수의 유체 대 고체 시료로부터 분리되어 있기 때문에,이 종래 복수 유체 형성이 발생 시간으로 질병의 초기 단계에서 세포를 분리하는 장점을 갖는다. 이 기술은 또한 ADV가 여기특정 사이트에서 일차 난소 암 세포를 단리 ANTAGE. 이 프로토콜을 이용하여 실행 가능한 기본 난소 암 세포를 얻는데 성공 샘플은 수술 후 처리 될 수있는 방법을 빨리에 크게 의존한다. 최상의 결과를 위해, 표본은 수술에서 30 분 이내에 접수해야한다. 이것이 가능하지 않으면, 시편을 밤새 (PBS에서) 4 ℃에서 보관하고 그 다음날 처리한다. 우리의 경험에서 하룻밤 저장 다음 샘플의 처리는 수율을 감소시킨다. 이상 30 분 디스 파제 II에 대한 노출은 또한 세포 생존 능력을 감소시키고 수행 할 수 없습니다. II 치료를 디스 파제에 대한 대안은 콜라게나 또는 히알루로 치료 될 수 있습니다. 그러나, 이는 감소 수율 8 초래한다. 다른 사람에 비해 때문에 임상 검체에서 큰 변화의 일부는 큰 적혈구의 오염이있을 수 있습니다. 그런 경우, 우리는 &quot;세탁&quot;다진 조직 (단계 제안3.1) PBS로 이전 소화 효소에 노출. 이 제제에서 적혈구의 수를 감소시키고, 궁극적으로 일차 상피 세포의 부착을 용이하게 할 것이다. 임상 표본 (그들이 빨리 그들이 외과 병리학 실험실에 도착 불임을 잃게) 멸균되지 않기 때문에 엄격히 무균 조건 하에서 모든 단계를 수행하는 것이 중요하다. 문화의 오염이 가능하지만, 일반적으로 그것은 케이스의 10 % 미만으로 발생한다. 위의 프로토콜은 임상 시료의 일관성과 함께 이용 될 수있다. 이 프로토콜의 주요 제한은 각 샘플에서 회수 된 세포의 수는 제공된 표본의 크기에 크게 의존한다는 것이다. 전형적인 표본의 크기는 약 3 센티미터 × 3 cm입니다. 또 다른 한계는 사실에 의해 표현되는 일차 난소 암 세포는 시험관 내에서 최대 10 개의 통로 (따라서 provi에 대해 지수 적으로 증가하면서딩 가능한 주식을 할 수있는 기회) 그들은 궁극적으로 senesce 죽어, 따라서 하나의 기증자의 세포의 가용성을 제한. 우리는 섬유 아세포에서의 종양 세포의 분리를 수행하지 않지만, 우리는 공정 전반에 걸쳐 혈청의 비교적 높은 (10 %)의 농도가 난소 암 세포에게 아세포 이상의 생존 이점을 줄 수 있다는 가설을 세웠다. 또한 간질 실 (섬유 아세포)에서 분리 적은 경향이 세포가 해리하는 수 없습니다 및 분리시 필터에 남아있을 가능성이 높습니다. 이 프로토콜을 사용하여 얻은 세포는 난소 암의 개시 및 개발로 이어지는 프로세스를 이해하는 것을 목표로 연구를 포함하여 미래의 애플리케이션에 매우 적합하다. 미래의 응용 프로그램은 체외 이러한 일차 전지를 사용하고 난소 암뿐만 아니라 조기 발견을위한 바이오 마커에 ​​대한 새로운 화학 요법 제의 생체 내 시험에 있습니다.

상대적으로 낮은 발병률에도 불구하고, 난소 암은 부인과 질환과 여성, 2 중 암 사망의 다섯 번째 주요 원인의 치명적인입니다. 이 충실히 질병 3의 개시 및 진행을 요점을 되풀이 신뢰할 수있는 도구와 모델의 부족에 주로 기인한다. 난소 암에 대한 우리의 지식 오늘날 대부분 ascitic 유체 4-7로부터 회수 불멸화 난소 표면 상피 세포 (잃었 지), 난소 암 세포주 및 일차 난소 암 세포의 사용을 통해 가능했습니다. 불행히도, 그들의 사용은 불멸화 과정 또는 체외 통로에 관련된 유전자와 표현형의 변화의 수와 ascitic 유체 준비로 인한 인구의 이질성 등 여러 가지 제한 사항이 있습니다. 따라서 난소 암의 식별과 특정한 고체 시료 유래 차 난소 암세포 UNIQU을 나타내는난소 암의 진행을 연구하는 전자 도구입니다. 획득이 악성 세포에 관련된 주요 문제는 생존의 손실이 EOC 세포의 배양에서 증식 능력의 조기 부족과 함께 간질 세포 또는 섬유 아세포의 증식에 기인한다. 고형 종양에서 단일 세포 현탁액을 만들 수있는 몇 가지 방법은 현재 기계적인 방법 또는 효소 분해를 통해, 그러나 특정 기술을 선호하는 결과 8의 큰 금액을 산출 존재한다. 여기, 우리는 표시가 가능한, 섬유 아세포 무료 EOC 세포의 효과적인 복구 디스 파제 II 결과에 소화 효소. 이렇게 얻어진 EOC의 문화 유전자 조작에 매우 민감하고 또한 약물 선별 검사에 유용하다, 이러한 EOC 문화가 다양한 다운 스트림 애플리케이션에 적합하다는 것을 나타낸다.

<table><tbody><tr><td>1x PBS, sterile&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Screw lid, polypropylene specimen container, sterile</td><td>Thermo Scientific</td><td>02 1090</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium, sterile&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum, sterile</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicillin-streptomycin, liquid</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, sterile</td><td>Roche</td><td>04942 078 001</td><td></td></tr><tr><td>Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile</td><td>Fisher Scientific</td><td>forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Small dissecting scissors, sterile</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-945</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical capped tubes, sterile</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical capped tubes, sterile</td><td>BD Falcon</td><td>352027</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serological pipette, sterile&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Syringe plunger, sterile&amp;nbsp;</td><td>Tyco Healthcare</td><td>8881516911</td><td></td></tr><tr><td>Nylon filter (70 &amp;mu;m ) cell strainer, sterile</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>5 cm Petri dish, sterile&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri dish, sterile&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr></tbody></table>

method for obtaining primary ovarian cancer cells from solid specimens

난소 암의 개시 및 진행을 조사하는 신뢰할 수있는 도구가 절실히 필요합니다. 난소 암 세포주의 사용이 난소 암을 이해하기위한 유용한 도구가 남아 있지만, 이들의 사용은 많은 제한이있다. 이러한 이질성의 부족 및 확장 체외 계대과 관련된 유전 변경의 과다 있습니다. 여기에서 우리는 기본 난소 암 세포의 빠른 구축을 허용하는 방법은 수술시에 수집 된 고체 임상 검체를 형성 기술한다. 상기 방법은 30 분 동안 효소 소화에 임상 검체를 행하여 이루어져있다. 격리 된 세포 현탁액을 성장시킨다 및 약물 스크리닝 하류 애플리케이션에 사용될 수있다. 설립 난소 암 세포주 이상의 일차 난소 암 세포주의 이점은 그들이 유래되고 다른 사이트 여부로부터 유도 될 수있는 일본어 특정 임상 검체의 대표 점이다 프리마공예 또는 전이성 난소 암.

난소 암의 임상 검체는 신선한 (도 1)는 수술 후 수거하고, 세포 슬러리를 구성하는 작은 조각 (도 2a 및 2b)에서 절단된다. 이 효소 치료에 대한 표본의 최적의 노출을 할 수 있습니다. 셀룰라 슬러리 소화 효소에 노출하고, 30 분간 37 ℃에서 배양된다. 배양 시간 동안 슬러리 (특히 각 교반 후) 점차 구름이되고이 조직 세분화의 표시이다. 배양 시간의 끝에서, 슬러리는 임의의 해리되지 않은 조직 (도 3)로부터 EOC 세포를 분리하는 세포 고사에 전사된다. 회수 된 세포 현탁액은 5 % CO 2와 37 ° C (F의 igure 4)에 배치됩니다. 이 단계에서 세포 배양의 형태는 단일 세포 현탁액과 같은 작은 덩어​​리 모두 EOC 세포의 존재를 드러낸다. 이 시점에서 문화는 또한 프리젠 밝혀<html> 적혈구 및도 5에 도시 된 바와 같이 작은 파편의 세륨. EOC는 천천히 (1 ~ 3 일의 기간 동안) 플라스틱, 적혈구 세포 파편을 준수합니다 중요한 동안하지 않으며 그들은 결국 점진적으로 &quot;문화에서 사라질 것이다&quot;. 초기 판에서 3 일으로, EOC의 문화가 부착 EOC 세포 클러스터와 그림 6과 같이 점진적으로 적은 적혈구와 파편을 증가합니다. 일 6-7함으로써, EOC 세포는 소용돌이 형상의 도형 (화살표)을 형성하고,도 7에 도시 된 바와 같이 EOC 세포의 전형적인 조약돌 형태 선도 다세포 큰 응집체를 형성하기 위해 플라스틱으로 확산하기 시작한다. 하루 (14)에 의해, EOC 세포는 일반적으로 합류 (그림 8)가 현재 다운 스트림 테스트 및 응용 프로그램에 대한 준비가되어 있습니다. pload/51581/51581fig1.jpg &quot;/&gt; 임상 검체의 그림 1. 컬렉션. 난소 암의 고체 시료는 수술시 수집하고 얼음처럼 차가운 PBS의 30 ML 가득 살균, 나사 뚜껑, 폴리 프로필렌 시료 용기에 배치됩니다. <img alt="그림 2a" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51581/51581fig2ahighres.jpg" src="/files/ftp_upload/51581/51581fig2a.jpg" /><img alt="그림 2b" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51581/51581fig2bhighres.jpg" src="/files/ftp_upload/51581/51581fig2b.jpg" /> 임상 검체의 그림 2. 처리. A) 신선 빙냉 PBS 1X. B 10 mL를 함유하는 페트리 접시에 전사 단단한 시험편) 임상 검체 더 크기 약 2mm로 절단. <p cl엉덩이 = &quot;jove_content&quot;FO : 유지 - together.within 페이지를 = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51581/51581fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51581/51581fig3.jpg" /> 해리되지 않은 조직에서 EOC 셀의도 3. 분리. 효소 소화에 따라, 임상 검체는 세포 고사에 전사하고 부드러운 압력이 시린지 플런저를 사용하여 소화 임상 검체에인가된다. 이것은 결합 조직 및 EOC 세포의 회복 EOC의 기계적 박리 수 있습니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51581/51581fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51581/51581fig4.jpg" /> 도 4. EOC 세포 현탁액을 결과의 도금. 해리되지 않은 임의의 조직을 제거한 후, 세포 현탁액을 원심 분리하여 DMEM (CONT)에 10 ㎖에 재현 탁aining 10 % FBS와 5 % CO 2, 37 ℃에서 배양 접시에서 배양 <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51581/51581fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51581/51581fig5.jpg" /> 즉시 즉시 도금 후 처리. 세포 현탁액 후 EOC 세포 배양의 그림 5. 형태론은 단일 세포 현탁액으로 EOC를 보여줍니다 덩어리 (모두 화살표로 표시)에, 적혈구 세포의 파편은 아직이 단계에 풍부하다. 원본 확대, 20X. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51581/51581fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51581/51581fig6.jpg" /> 3 일에 EOC 세포 배양의 그림 6. 형태론 도금 반 부착 EOC의 C를 표시 한 후 3 일에서. EOC 세포 배양을 도금 한 후(화살표로 나타낸) ELL 클러스터 이하 적혈구 오염. 원본 확대, 20X. <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51581/51581fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51581/51581fig7.jpg" /> 그림 7. 초기 도금 후 1 주일. EOC 세포 배양 도금에서 일주일 후 설립 EOC 문화는 조직 배양 플라스틱에 확산 세포의 소용돌이 모양의 클러스터를 보여줍니다. 원본 확대, 20X. <img alt="그림 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51581/51581fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51581/51581fig8.jpg" /> 그림 8. 합류 EOC 문화. 문화에서 14 일 후에 일반적인 상피 조약돌 형태를 보여주는 EOC 세포의 플루 단층.

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Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

이 연구는 고체 임상 검체에서 기본 난소 암 세포의 분리 및 특성에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 난소 암 임상 검체는 다운 스트림 애플리케이션에 매우 적합 가능한, 섬유 아세포없는 상피 난소 암 (EOC) 세포를 얻기 위해 소화 효소를 실시하고 있습니다.

고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K 조회수.  University of Minnesota.  이 연구는 고체 임상 검체에서 기본 난소 암 세포의 분리 및 특성에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 난소 암 임상 검체는 다운 스트림 애플리케이션에 매우 적합 가능한, 섬유 아세포없는 상피 난소 암 (EOC) 세포를 얻기 위해 소화 효소를 실시하고 있습니다. 

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Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

3 차원 Heterotypic<em&gt; 체외에서</em난소 암 개시 및 진행하는 동안 Stromal - 상피 조직의 상호 작용&gt; 모델링

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

연구

의학

Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues

The theory of a "sterile" female upper reproductive tract has been encountering increasing opposition due to advancements in bacterial detection. However, whether ovaries contain bacteria has not yet been confirmed yet. Herein, an experiment to detect bacteria in ovarian tissues was introduced. We chose ovarian cancer patients in the cancer group and noncancerous patients in the control group. 16S rRNA gene sequencing was used to differentiate bacteria in ovarian tissues from the cancer and control groups. Furthermore, we predicted the functional composition of the identified bacteria by using BugBase and PICRUSt. This method can also be used in other viscera and tissues since many organs have been proven to harbor bacteria in recent years. The presence of bacteria in viscera and tissues may help scientists evaluate cancerous and normal tissues and may be aid in the treatment of cancer.

Immunohistochemistry staining and 16S ribosomal RNA gene (16S rRNA gene) sequencing were performed in order to discover and distinguish bacteria in cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ. The compositional and functional differences of the bacteria were predicted by using BugBase and Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).

난소 조직에서 박테리아의 특성화 및 기능적 예측

The theory of a "sterile" female upper reproductive tract has been encountering increasing opposition due to advancements in bacterial detection. However, ...

암 연구학

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the discovery of novel therapeutics and predictive biomarkers for ovarian cancer. These models recapitulate clonal heterogeneity, the tumor microenvironment, and cell-cell and cell-matrix interactions. Additionally, they have been shown to match the primary tumor morphologically, cytologically, immunohistochemically, and genetically. Thus, organoids facilitate research on tumor cells and the tumor microenvironment and are superior to cell lines. The present protocol describes distinct methods to generate patient-derived ovarian cancer organoids from patient tumors, ascites, and pleural fluid samples with a higher than 97% success rate. The patient samples are separated into cellular suspensions by both mechanical and enzymatic digestion. The cells are then plated utilizing a basement membrane extract (BME) and are supported with optimized growth media containing supplements specific to the culturing of high-grade serous ovarian cancer (HGSOC). After forming initial organoids, the PDOs can sustain long-term culture, including passaging for expansion for subsequent experiments.

Patient-derived organoids (PDO) are a three-dimensional (3D) culture that can mimic the tumor environment in vitro. In high-grade serous ovarian cancer, PDOs represent a model to study novel biomarkers and therapeutics.

고급 장액성 난소암 환자 유래 오가노이드의 생성 및 배양

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

자궁 적출술 검체에서 차 인간의 자궁 내막 기질 세포를 구축하는 두 가지 방법

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

난소암-오멘텀 상호작용을 위한 3D Ex Vivo 모델 구축

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian cancer cells as well as immune modulatory signals that allow tumor tolerance. However, we have limited models that closely mimic the interaction between ovarian cancer cells and adipose-rich tissues. To further understand the cellular and molecular mechanisms by which the omentum provides a pro-tumoral microenvironment, we developed a unique 3D ex vivo model of cancer cell-omentum interaction. Using human omentum, we are able to grow ovarian cancer cells within this adipose-rich microenvironment and monitor the factors responsible for tumor growth and immune regulation. In addition to providing a platform for the study of this adipose-rich tumor microenvironment, the model provides an excellent platform for the development and evaluation of novel therapeutic approaches to target metastatic cancer cells in this niche. The proposed model is easy to generate, inexpensive, and applicable to translational investigations.

저자 스포트라이트: 암-지방 미세환경 상호작용 조사를 위한 고급 생체 외 모델 

This protocol describes the establishment of a three-dimensional (3D) ex vivo model of cancer cell-omentum interaction. The model provides a platform for elucidating pro-tumor mechanisms within the adipose niche and for testing novel therapies.

인간 Omentum을 사용한 난소암 복막 전이의 생체 외 모델

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

난소암 오가노이드 바이오뱅킹 표준화

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in research and patient care, standardization remains a challenge due to the heterogeneity of this lethal malignancy, combined with the inherent complexity of organoid technology. This adaptable protocol provides a systematic framework to realize the full potential of ovarian cancer organoids considering a patient-specific variability of progenitors. By implementing a structured experimental workflow to select optimal culture conditions and seeding methods, with parallel testing of direct 3D seeding versus a 2D/3D route, we obtain, in most cases, robust long-term expanding lines suitable for a broad range of downstream applications. 
Notably, the protocol has been tested and proven efficient in a great number of cases (N = 120) of highly heterogeneous starting material, including high-grade and low-grade ovarian cancer and stages of the disease with primary debulking, recurrent disease, and post-neoadjuvant surgical specimens. Within a low Wnt, high BMP exogenous signaling environment, we observed progenitors being differently susceptible to the activation of the Heregulin 1 &#223; (HER&#223;-1)-pathway, with HER&#223;-1 promoting organoid formation in some while inhibiting it in others. For a subset of the patient's samples, optimal organoid formation and long-term growth necessitate the addition of fibroblast growth factor 10 and R-Spondin 1 to the medium. 
Further, we highlight the critical steps of tissue digestion and progenitor isolation and point to examples where brief cultivation in 2D on plastic is beneficial for subsequent organoid formation in the Basement Membrane Extract type 2 matrix. Overall, optimal biobanking requires systematic testing of all main conditions in parallel to identify an adequate growth environment for individual lines. The protocol also describes the handling procedure for efficient embedding, sectioning, and staining to obtain high-resolution images of organoids, which is required for comprehensive phenotyping.

저자 스포트라이트: 난소암의 맞춤형 의학 발전 

This protocol offers a systematic framework for the establishment of ovarian cancer organoids from different disease stages and addresses the challenges of patient-specific variability to increase yield and enable robust long-term expansion for subsequent applications. It includes detailed steps for tissue processing, seeding, adjusting media requirements, and immunofluorescence staining.

난소암 오가노이드의 바이오뱅킹 전략: 조직학적 아형 및 질병 단계에 걸친 환자 간 이질성 해결

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...

고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법

요약

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3 차원 Heterotypic

난소 조직에서 박테리아의 특성화 및 기능적 예측

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인간 Omentum을 사용한 난소암 복막 전이의 생체 외 모델

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