Name: method for obtaining primary ovarian cancer cells from solid specimens
Uploaded: 2014-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
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私たちは、患者の組織サンプルの収集の支援については、ミネソタ大学の組織調達施設のスタッフに感謝したいと思います。この作品は、MBにし、MBに婦人科腫瘍学部門の資金によってミネソタ卵巣がんのアライアンスにより、MBにランディシェーバー癌研究およびコミュニティ基金によるMBに国防総省の卵巣癌研究プログラム（OCRP）OC093424、サポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割がありませんでした。

倫理に関する声明 ヒト被験者の委員会（IRB）の承認：卵巣癌の固体試料は、治験審査委員会委員の後にミネソタ大学の組織調達機能（TPF）から得た。 1。試薬のセットアップ<ol><li> 10％のFBS、100単位ペニシリン - ストレプトマイシンを含むDMEMを補充することにより完全DMEM培地を準備します。 4℃でメディアを格納し、温める37℃、使用前に。 </li><li>複数の凍結を回避するため5〜10 mlを別々のボリュームに分量のディスパーゼIIはnonfrostフリー冷凍庫に-20℃で解凍して保存。 </li></ol> 2。組織採取<ol><li>肉眼的病理学者によって癌と識別領域から手術時に卵巣癌（サイズは〜5グラム）の固体の試料を収集します。臨床検体は、制度的なプロトコルに従って脱識別され、登録されている。 </li><li>無菌、サウスカロライナ州での試験片を置きREW蓋、ポリプロピレン、氷冷PBS 30mlで充填された容器を片。氷上での処理のための研究室に外科病理検査室からの検体を輸送し、検体採取（ 図1）から30分以内。 </li></ol> 3。組織処理<ol><li> （（2mm以下）、さらに可能な限り最小の断片に切断、無菌条件下で作業し、ペトリ皿（X 60ミリメートル60ミリメートル）、新鮮な、氷冷PBSの10ミリリットルを含有し、滅菌したカミソリの刃を使用して上にサンプルを転送図2Aおよび2B）。 </li><li> DMEM中のディスパーゼII（2.4 U / ml）を（30分間37℃）温めておいた10mlのを含む15ミリリットルの円錐管に刻んだ組織を移し、30分間、5％CO 2、37℃でインキュベートする。標本の最適な消化を確実にするために、手動で細胞スラリーごとに5分を攪拌する。 </li><li> 30分間のインキュベーション、移動（使用した後10ミリリットルの血清学的ピペット）セルストレーナー（70ミクロンメッシュ）上に細胞スラリーは、50ミリリットルコニカルチューブの上に配置し、シリンジプランジャを使用してメッシュに対する穏やかな圧力を適用します。 （メッシュの上に残っている）すべての未解離組織を捨て、50ミリリットルの滅菌コニカルチューブ内の得られた細胞懸濁液を収集します。 4℃（ 図3）で7分間320×gで遠心します。 </li><li>上清を捨て、10％のFBSを含むDMEMの10ml中に細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li> 5％のCO 2、37℃（ 図4）でのシャーレ中の細胞懸濁液をインキュベートする。 </li><li>最初のプレーティングから24時間後に培地を変更します。これは細胞片の除去及び培養物中に存在する赤血球の大半を可能にします。 </li><li>メディアをプライマリEOCの文化が下流のアプリケーションのための準備ができているし、その後、次の2週間、3日ごとに変更します。 </li></ol>

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	<li>Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. h. i. h. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+detection+and+treatment+of+ovarian+cancer:+shifting+from+early+stage+to+minimal+volume+of+disease+based+on+a+new+model+of+carcinogenesis.">Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).</li><li>Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+Cancer+Is+an+Imported+Disease:+Fact+or+Fiction.">Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction.</a> Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).</li><li>Sarojini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+detection+biomarkers+for+ovarian.">Early detection biomarkers for ovarian.</a> J. Oncol. , (2012).</li><li>Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nachtigal+M.W.+Primary+culture+of+ovarian+surface+epithelial+cells+and+ascites-derived+ovarian+cancer+cells+from+patients.">Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).</li><li>Tsao, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells+immortalized+by+human+papilloma+viral+oncogenes+(HPV-E6E7+ORFs).">Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs).</a> Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).</li><li>Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cultured+human+ovarian+surface+epithelial+cells:+phenotypic+plasticity+and+premalignant+changes.">Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes.</a> Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).</li><li>Brewer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+normal,+immortalized+ovarian+surface+epithelial+and+ovarian+cancer+cells+for+chemoprevention+of+ovarian+cancer.">In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer.</a> Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).</li><li>Sueblinvong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment,+characterization+and+downstream+application+of+primary+ovarian+cancer+cells+derived+from+solid+tumors.">Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li><li>Rockwell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-in+vitro+tumour+cell+lines:+characteristics+and+limitations+as+models+for+human+cancer.">In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer.</a> Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).</li><li>Wong, C., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+application+and+limitations+of+breast+cancer+cell+lines+to+study+tamoxifen+and+aromatase+inhibitor+resistance.">The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance.</a> J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

卵巣がんの病因と開発のより良い理解は、この壊滅的な疾患に罹患した女性の結果を改善することが重要です。この文脈での使用が確立され、「市販の「卵巣癌細胞株は、間違いなく飛躍的に有用であった。しかし、今日、我々は癌細胞株は、彼らが異質9,10の欠如など、多くの面で由来するヒト腫瘍を代表するものではないことを知っている。 ここでは、直接手術標本の分離の30分以内に卵巣癌の臨床検体からの分離と原発性卵巣癌細胞を培養するための迅速かつ信頼性の高い方法を報告している。 初代細胞は、腹水対固体試料から単離されるので、これは前の腹水形成が起こる時間に疾患の初期段階からの細胞を単離するという利点を有する。この技術はまた、副を有する特定のサイトからの原発性卵巣癌細胞を単離するアンテージ。このプロトコルを使用して実行可能な原発性卵巣癌細胞を得ることに成功した試料は、手術後に処理することができるいかに迅速に大きく依存する。最良の結果を得るには、標本は手術から30分以内に受信する必要があります。これが不可能な場合、試料は、一晩（PBS）で4℃で保存し、翌日に処理されるべきである。我々の経験では、一晩保存後のサンプルの処理は、歩留まりを低下させる。 30分よりも長い間ディスパーゼIIへの曝露は、細胞の生存率を低下させ、実行しないでください。 II治療をディスパーゼの代替は、コラゲナーゼやヒアルロニダーゼによる治療することができます。しかしながら、これは収率低下8もたらす。なぜなら臨床検体における大きな変動のため、あるものは他のものと比較してより大きな赤血球汚染を有することができる。その場合は、我々は、「洗浄」みじん切り組織（工程を示唆している3.1）PBSで前に酵素消化にさらす。これは、製剤中の赤血球の数を減少し、最終的に一次上皮細胞の接着を促進する。 臨床検体は、（彼らはすぐに彼らは外科病理検査室に到着するように無菌性を失う）無菌ではないので、厳密に無菌条件下でのすべての手順を実行することが重要です。培養物の汚染が可能であるが、典型的には、症例の10％未満で起こる。上記のプロトコルは、臨床検体のいずれか一貫して使用することができる。 このプロトコルの主な制限は、各サンプルから回収された細胞の数が設けられて標本の大きさに大きく依存することである。典型的な試験片の大きさは約3センチ×3cmである。別の制限は、原発性卵巣癌細胞がin vitroで 10継代まで（従ってproviために指数関数的に増加しつつあるという事実によって表される。丁実行可能なストックを作る機会を）彼らは最終的には老化と死ぬ、このように単一のドナーからの細胞の利用可能性を制限する。我々は、線維芽細胞からの腫瘍細胞のいずれかの分離を行っておりませんが、我々はプロセス全体を通じて、血清の比較的高い（10％）濃度は卵巣癌細胞を線維芽細胞上の延命効果を与えることができると仮定した。また、間質コンパートメント（線維芽細胞）からの分離の可能性も低くなります細胞は脱凝集せず、分離中、フィルター上に残っている可能性が高い。 このプロトコルで得られた細胞は、卵巣癌の発生と発展につながるプロセスを理解することを目的とした調査を含めた将来のアプリケーションに非常に適している。将来のアプリケーションはまた、 インビトロのためのこれらの一次細胞を用いおよび卵巣癌などの早期発見のためのバイオマーカーのための新規の化学療法剤の生体内試験に含める。

その比較的低い発生率にもかかわらず、卵巣癌は婦人科疾患と女性の1,2のがんによる死亡の第五の主要な原因の最も致命的である。これは主に忠実疾患3の開始および進行を再現信頼性の高いツールとモデルの不足が原因です。卵巣癌についての我々の知識今日のほとんどは、腹水から回収4-7不死化卵巣表面上皮細胞（IOSが）、卵巣癌細胞株および原発性卵巣癌細胞の使用により可能であった。残念ながら、それらの使用は、不死化プロセスまたは体外路及び腹水製剤から得られた集団の異質性に関連する遺伝的および表現型変化の数など、いくつかの制限があります。 そのため、卵巣癌の特定可能な、特定の固体標本由来の初代卵巣癌細胞はuniquを表す卵巣癌の進行を研究するための電子ツール。 これらの悪性細胞の取得に必要な主な困難は、生存率およびこれらのEOC細胞の培養における増殖能力の早期不足の損失に伴う間質細胞や線維芽細胞の異常増殖によるものである。固形腫瘍からの単細胞懸濁液を作成するには、いくつかの方法が、現在、しかし、特定の技術が有利な結果8より多くの量が得られ、機械的手段または酵素的解離によって、存在しています。ここでは、実行可能な、線維芽細胞のないEOC細胞の効果的な回復のディスパーゼIIの結果とその酵素消化を示しています。このようにして得られたEOC培養物は、遺伝子操作を非常に受けやすいと薬物スクリーニング試験においても有用であり、これらのEOC培養物は、多くの下流の用途に適していることを示している。

<table><tbody><tr><td>1x PBS, sterile&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Screw lid, polypropylene specimen container, sterile</td><td>Thermo Scientific</td><td>02 1090</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium, sterile&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum, sterile</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicillin-streptomycin, liquid</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, sterile</td><td>Roche</td><td>04942 078 001</td><td></td></tr><tr><td>Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile</td><td>Fisher Scientific</td><td>forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Small dissecting scissors, sterile</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-945</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical capped tubes, sterile</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical capped tubes, sterile</td><td>BD Falcon</td><td>352027</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serological pipette, sterile&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Syringe plunger, sterile&amp;nbsp;</td><td>Tyco Healthcare</td><td>8881516911</td><td></td></tr><tr><td>Nylon filter (70 &amp;mu;m ) cell strainer, sterile</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>5 cm Petri dish, sterile&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri dish, sterile&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr></tbody></table>

method for obtaining primary ovarian cancer cells from solid specimens

卵巣癌の発生および進行を調査するための信頼性の高いツールが緊急に必要とされている。卵巣癌細胞株の使用は、卵巣癌を理解するための貴重なツールのままで、それらの使用は多くの制限がある。これらは、異質性の欠如および拡張のin vitro継代に関連した遺伝子変異の過多があります。ここでは、手術時に回収した固体臨床検体を形成原発性卵巣癌細胞の迅速な確立を可能にする方法を記載している。この方法は、30分間酵素消化に臨床検体を施すからなる。単離された細胞懸濁液を増殖させ、薬物スクリーニングを含め下流側のアプリケーションのために使用することができる。確立された卵巣癌細胞株上の原発性卵巣癌細胞株の利点は、それらが由来し、異なる部位か否かに由来することができる元の特定の臨床検体の代表的なものであるということで一応RYまたは転移性卵巣癌。

卵巣癌の臨床検体を、新鮮な細胞スラリーを構成する（ 図1）手術後に収集し、小片（ 図2Aおよび2B）に切断される。これは酵素処理への検体の最適な露出が可能になります。細胞スラリーを酵素消化に曝し、30分間37℃でインキュベートする。インキュベーション時間の間、スラリーは、（特に、各攪拌後）ますます濁り、これは、組織脱凝集のサインです。インキュベーション時間の最後に、スラリーは、任意の組織解離していない（ 図3）からEOC細胞を分離する細胞ろ過器上に転写される。回収した細胞懸濁液を、5％CO 2、37°C（Fのigure 4）に配置される。この段階で、細胞培養物の形態は、単一細胞懸濁液として、小塊の両方のEOC細胞の存在を明らかにする。この時点での培養もPRESENを明らかに<html>赤血球と、図5に示すように、小さな破片のCE。 EOCがゆっくり（1〜3日の期間にわたって）プラスチックに付着する重要なのが、赤血球や細胞破片が、彼らは最終的かつ漸進的」文化から消え」になることはありません。最初のプレーティングから3日目までに、EOC培養は、接着性、EOC細胞クラスターと図6に示すように徐々に少なく赤血球や破片の増加を示している。一日6-7により、EOC細胞は、スワール状の形状（矢印）を形成し、 図7に示すように、EOC細胞の典型的な敷石状形態をもたらすより大きな多細胞凝集体を形成するためにプラスチックに拡散し始める。 14日までに、EOC細胞は、典型的にコンフルエント（ 図8）になり、現在は下流のテストとアプリケーションのための準備が整いました。 pload/51581/51581fig1.jpg &quot;/&gt; 図1の臨床検体の収集。卵巣癌の固体片は、手術時に採取し、氷冷PBS 30mlで充填し、滅菌したネジ蓋、ポリプロピレン検体容器内に配置される。 <img alt="図2a" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51581/51581fig2ahighres.jpg" src="/files/ftp_upload/51581/51581fig2a.jpg" /><img alt="図2b" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51581/51581fig2bhighres.jpg" src="/files/ftp_upload/51581/51581fig2b.jpg" /> 図2。臨床検体の処理。新鮮な氷冷した1×PBSを10ミリリットルを含むペトリ皿上に移しA）固体試料。さらに、サイズが2ミリメートル程度の断片に切断B）臨床検体。 <p clお尻= &quot;jove_content&quot; FO：キープtogether.withinページ= &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51581/51581fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51581/51581fig3.jpg" /> 図3解離していない組織からEOC細胞の分離。酵素消化に続いて、臨床検体は、細胞ストレーナーに転写され、穏やかな圧力は、シリンジプランジャーを用いて消化し ​​た臨床検体に適用される。これは結合組織とEOC細胞の回収によるEOCの機械的剥離を可能にします。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51581/51581fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51581/51581fig4.jpg" /> 図4 EOC細胞懸濁液を得られるのメッキは解離していない任意の組織を除去した後、細胞懸濁液を遠心分離し、DMEMの続き10mlに再懸濁aining 10％FBSおよび5％CO 2、37℃でペトリ皿中でインキュベートし<img alt="図5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51581/51581fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51581/51581fig5.jpg" /> 図5直ちに処理後のEOC細胞培養物のモルフォロジー。細胞懸濁液めっき（共に矢印で示される）単一細胞懸濁液として塊にEOCを示した直後に、赤血球および細胞破片は、まだこの段階ではたくさんある。オリジナルの倍率、20倍。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51581/51581fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51581/51581fig6.jpg" /> 3日目EOC細胞培養物の図6形態メッキ半付着EOC cを示した後3日目。EOC細胞培養物をプレーティングした後（矢印で示される）のエル·クラスターの少ない赤血球汚染。オリジナルの倍率、20倍。 <img alt="図7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51581/51581fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51581/51581fig7.jpg" /> 図7。初期めっき後一週間。EOC細胞培養をメッキから一週間後に確立EOC培養は組織培養プラスチック上で広がった細胞の渦巻き状のクラスターを示しています。オリジナルの倍率、20倍。 <img alt="図8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51581/51581fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51581/51581fig8.jpg" /> 図8。コンフルエントEOC培養。培養14日後に、典型的な上皮丸石の形態を示すEOC細胞のコンフルエントな単層。

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Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

本研究では、固体の臨床検体からの原発性卵巣癌細胞の単離および特徴付けのための詳細な方法を記載している。卵巣癌臨床検体は、下流の用途に非常に適した生存可能な、線維芽細胞を含まない上皮性卵巣癌（EOC）細胞を得るために酵素消化に供される。

ソリッド検体からの原発性卵巣癌細胞を得る方法

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K ビュー.  University of Minnesota. 本研究では、固体の臨床検体からの原発性卵巣癌細胞の単離および特徴付けのための詳細な方法を記載している。卵巣癌臨床検体は、下流の用途に非常に適した生存可能な、線維芽細胞を含まない上皮性卵巣癌（EOC）細胞を得るために酵素消化に供される。 

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Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

三次元異<em&gt; in vitroで</em卵巣がんの発生と進行中に間質相互作用の上皮&gt;モデリング

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

医学

Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues

The theory of a "sterile" female upper reproductive tract has been encountering increasing opposition due to advancements in bacterial detection. However, whether ovaries contain bacteria has not yet been confirmed yet. Herein, an experiment to detect bacteria in ovarian tissues was introduced. We chose ovarian cancer patients in the cancer group and noncancerous patients in the control group. 16S rRNA gene sequencing was used to differentiate bacteria in ovarian tissues from the cancer and control groups. Furthermore, we predicted the functional composition of the identified bacteria by using BugBase and PICRUSt. This method can also be used in other viscera and tissues since many organs have been proven to harbor bacteria in recent years. The presence of bacteria in viscera and tissues may help scientists evaluate cancerous and normal tissues and may be aid in the treatment of cancer.

Immunohistochemistry staining and 16S ribosomal RNA gene (16S rRNA gene) sequencing were performed in order to discover and distinguish bacteria in cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ. The compositional and functional differences of the bacteria were predicted by using BugBase and Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).

卵巣組織における細菌の特性評価と機能予測

The theory of a "sterile" female upper reproductive tract has been encountering increasing opposition due to advancements in bacterial detection. However, ...

がん研究

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the discovery of novel therapeutics and predictive biomarkers for ovarian cancer. These models recapitulate clonal heterogeneity, the tumor microenvironment, and cell-cell and cell-matrix interactions. Additionally, they have been shown to match the primary tumor morphologically, cytologically, immunohistochemically, and genetically. Thus, organoids facilitate research on tumor cells and the tumor microenvironment and are superior to cell lines. The present protocol describes distinct methods to generate patient-derived ovarian cancer organoids from patient tumors, ascites, and pleural fluid samples with a higher than 97% success rate. The patient samples are separated into cellular suspensions by both mechanical and enzymatic digestion. The cells are then plated utilizing a basement membrane extract (BME) and are supported with optimized growth media containing supplements specific to the culturing of high-grade serous ovarian cancer (HGSOC). After forming initial organoids, the PDOs can sustain long-term culture, including passaging for expansion for subsequent experiments.

Patient-derived organoids (PDO) are a three-dimensional (3D) culture that can mimic the tumor environment in vitro. In high-grade serous ovarian cancer, PDOs represent a model to study novel biomarkers and therapeutics.

高悪性度漿液性卵巣癌患者由来オルガノイドの作製と培養

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

子宮摘出標本から初代ヒト子宮内膜間質細胞の確立するための2つの方法

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

卵巣がん-大網相互作用のための3D ex vivoモデルの確立

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian cancer cells as well as immune modulatory signals that allow tumor tolerance. However, we have limited models that closely mimic the interaction between ovarian cancer cells and adipose-rich tissues. To further understand the cellular and molecular mechanisms by which the omentum provides a pro-tumoral microenvironment, we developed a unique 3D ex vivo model of cancer cell-omentum interaction. Using human omentum, we are able to grow ovarian cancer cells within this adipose-rich microenvironment and monitor the factors responsible for tumor growth and immune regulation. In addition to providing a platform for the study of this adipose-rich tumor microenvironment, the model provides an excellent platform for the development and evaluation of novel therapeutic approaches to target metastatic cancer cells in this niche. The proposed model is easy to generate, inexpensive, and applicable to translational investigations.

著者スポットライト:がんと脂肪微小環境の相互作用を調査するための高度なex vivoモデル 

This protocol describes the establishment of a three-dimensional (3D) ex vivo model of cancer cell-omentum interaction. The model provides a platform for elucidating pro-tumor mechanisms within the adipose niche and for testing novel therapies.

ヒト大網を用いた卵巣癌腹膜転移の Ex vivo モデル

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

卵巣がんオルガノイドバイオバンキングの標準化

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in research and patient care, standardization remains a challenge due to the heterogeneity of this lethal malignancy, combined with the inherent complexity of organoid technology. This adaptable protocol provides a systematic framework to realize the full potential of ovarian cancer organoids considering a patient-specific variability of progenitors. By implementing a structured experimental workflow to select optimal culture conditions and seeding methods, with parallel testing of direct 3D seeding versus a 2D/3D route, we obtain, in most cases, robust long-term expanding lines suitable for a broad range of downstream applications. 
Notably, the protocol has been tested and proven efficient in a great number of cases (N = 120) of highly heterogeneous starting material, including high-grade and low-grade ovarian cancer and stages of the disease with primary debulking, recurrent disease, and post-neoadjuvant surgical specimens. Within a low Wnt, high BMP exogenous signaling environment, we observed progenitors being differently susceptible to the activation of the Heregulin 1 &#223; (HER&#223;-1)-pathway, with HER&#223;-1 promoting organoid formation in some while inhibiting it in others. For a subset of the patient's samples, optimal organoid formation and long-term growth necessitate the addition of fibroblast growth factor 10 and R-Spondin 1 to the medium. 
Further, we highlight the critical steps of tissue digestion and progenitor isolation and point to examples where brief cultivation in 2D on plastic is beneficial for subsequent organoid formation in the Basement Membrane Extract type 2 matrix. Overall, optimal biobanking requires systematic testing of all main conditions in parallel to identify an adequate growth environment for individual lines. The protocol also describes the handling procedure for efficient embedding, sectioning, and staining to obtain high-resolution images of organoids, which is required for comprehensive phenotyping.

著者スポットライト:卵巣がんにおける個別化医療の推進 

This protocol offers a systematic framework for the establishment of ovarian cancer organoids from different disease stages and addresses the challenges of patient-specific variability to increase yield and enable robust long-term expansion for subsequent applications. It includes detailed steps for tissue processing, seeding, adjusting media requirements, and immunofluorescence staining.

卵巣がんオルガノイドのバイオバンキング戦略:組織学的サブタイプと疾患病期にわたる患者間の不均一性への対処

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