대형 DNA 주형의 상동성 매개 말단 결합을 통한 일차 인간 T 세포의 비바이러스 공학

CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 homology-mediated end joining (HMEJ) DNA repair pathway를 통해 1차 인간 T 세포에서 큰 multicistronic 구조체의 고효율 표적 knock-in을 달성하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 cGMP 적응 프로토콜로 조작된 T 세포는 우수한 세포 증식, 세포 독성 및 사이토카인 생산을 유지합니다.

현재 채택되고 있는 많은 세포 치료법은 렌티 또는 레트로바이러스 벡터에 의존하여 특정 종양 관련 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 외인성 T 세포 수용체(TCR)의 발현을 위한 T 세포를 엔지니어링합니다. 치료용 T 세포 생산을 위해 바이러스 벡터에 의존하면 제조 일정, 비용 및 복잡성이 크게 증가하며, 특히 학술 환경에서 새로운 치료법의 번역이 제한됩니다. CRISPR/Cas9 및 상동성 매개 말단 결합을 사용하여 T 세포의 효율적인 비바이러스 엔지니어링을 위한 프로세스를 제시하여 대규모 다중섬유닉 DNA 화물의 표적 통합을 달성합니다. 이 접근법은 바이러스 벡터와 유사한 통합 빈도를 달성했으며, in vitro 및 in vivo 모두에서 강력한 항종양 효능을 발휘할 수 있는 고기능성 T 세포를 생성했습니다. 특히, 이 방법은 현재의 우수제조관리기준(cGMP) 및 임상 규모 확대에 빠르게 적용할 수 있어 임상시험에 사용할 치료용 T 세포를 제조하기 위한 단기적인 옵션을 제공합니다.

T세포는 적응면역체계의 핵심 구성 요소로, 직접적인 세포용해 능력, 사이토카인 생성을 통한 면역 반응 조절 능력, B세포 및 수지상 세포의 허가, 면역학적 기억 확립 능력을 가지고 있다¹. 이들은 면역 발달, 항상성 및 감시, 병원체로부터의 보호, 암, 알레르기 및 자가면역¹에 대한 예방 및 방어에 중요한 역할을 합니다. T세포는 V(D)J 재조합을 통해 생성되는 매우 다양한 T세포 수용체(TCR)를 보유하고 있어 T세포가 다양한 항원을 인식하고 다양한 병원체에 대해 효과적인 면역 반응을 일으킬 수 있습니다 ^1,2. T 세포는 일반적으로 두 가지 범주로 분류할 수 있는데, 주로 B 세포와 같은 다른 면역 세포가 면역 반응을 조정하는 데 도움을 주는 보조 T 세포라고도 하는 CD4 T 세포와 표면에 존재하는 특정 항원을 인식하여 감염된 세포나 암성 세포를 직접 죽이는 CD8 T 세포 또는 세포독성 T 세포입니다¹.

키메라 항원 수용체(CAR)의 개발로 면역 요법을 위한 T 세포의 게놈 엔지니어링에 대한 관심이 크게 증가했습니다. CAR은 항체 유래 항원 결합 도메인과 T 세포 신호 전달 도메인을 병합하는 엔지니어링 단백질로, T 세포가 CAR³의 항체 부분에 의해 인식된 특정 항원결정기를 발현하는 세포를 식별하고 표적으로 삼을 수 있도록 합니다. 이 수용체는 감염성 질환 및 자가면역을 포함한 다양한 면역 요법에 사용되어 왔지만, 이 기술은 암 면역 요법에 가장 앞선 기술입니다.

CAR-T 세포는 백혈병과 림프종의 치료에 매우 성공적이었으나, 고형 종양의 치료에는 제한적인 효능을 보였다 ^4,5. 이로 인해 고형 종양 적응증에 대한 CAR-T 세포의 효과를 개선하기 위한 추가 개발의 물결이 일고 있습니다. 사이토카인 아머링(cytokine armoring), 체크포인트 유전자 녹아웃(checkpoint gene knockout), 우성 음성 수용체(dominant negative receptor), 케모카인 수용체(chemokine receptor), 하나의 세포에서 여러 CAR을 발현하는 방법, 세포 내 신호 전달을 강화하기 위한 CAR 변형, 고갈을 방지하기 위해 숙주 조절 메커니즘을 활용하기 위한 미리 결정된 유전자좌(예: TRAC 유전자 자리)로의 통합 등 다양한 접근법이 개발되었습니다 ^6,7,8. 이러한 접근 방식 중 다수는 더 큰 유전 화물 및/또는 부위 특이적 통합을 필요로 합니다. 대안적인 접근법으로는 형질전환 TCR을 사용하여 T 세포가 세포 내 신생항원을 표적으로 삼을 수 있도록 하는 것도 포함됩니다 ^9,10. 그러나 이는 TCR이 신생항원 항원결정기와 HLA 분자 모두에 특이성을 가져야 한다는 중대한 단점이 있으며, 동족 HLA를 발현하는 환자에 대한 최종 치료제의 사용을 제한합니다. 또한, 많은 종양이 면역요법에 반응하여 HLA 발현을 변화시키거나 감소시켜 형질전환 TCR을 발현하는 T세포의 효과를 크게 감소시킨다¹¹.

임상시험에서 대부분의 CAR-T 또는 TCR-T 세포 치료제는 렌티바이러스 또는 감마레트로바이러스와 같은 레트로바이러스 벡터를 사용하여 제조되며, 중간 크기의 화물과 높은 통합 빈도를 달성합니다. 그러나 바이러스 벡터는 현재의 우수제조관리기준(cGMP) 요건과 삽입성 돌연변이 유발의 위험을 초래하는 비특이적 통합 프로파일로 인해 제조 일정이 길어지고 있습니다^12,13. 또한, 화물이 5kb를 초과하는 경우 높은 역가에서 형질전환 레트로바이러스를 생산하기 어려울 수 있습니다¹⁴. 재조합 아데노연관 바이러스(rAAV)에서 유래한 벡터와 같은 다른 벡터는 자연적으로 통합되지 않지만 DNA 공여체 템플릿을 핵으로 운반할 수 있으며 CRISPR/Cas9와 함께 사용하여 기존의 상동성 유도 재조합(HDR) 매개 게놈 엔지니어링을 용이하게 할 수 있습니다. 그러나 이러한 바이러스는 길고 복잡한 생산 워크플로우를 가지고 있으며 화물 크기(<4.7kb)와 긴 상동성 암(500-1000bp)을 포함해야 하는 필요성에 의해 제한됩니다15,16,17,18.

트랜스포손 또는 표적 뉴클레아제와 DNA 공여체 주형의 조합을 사용하는 비바이러스 게놈 엔지니어링은 1차 인간 림프구에서 보고되었습니다 ^8,19,20. 그러나 이러한 접근법은 림프구에서 발현되는 세포질 DNA 센서에 의한 인식에 따른 세포질의 벌거벗은 DNA 분자에 대한 독성 반응에 의해 제한됩니다²¹. transfection 동안 이러한 DNA 감지 경로의 소분자 억제제를 사용하려는 시도가 있었지만, 이러한 경로의 중복으로 인해 cGMP 프로토콜²²에서 사용하는 것이 복잡할 수 있습니다. 특히, 잠자는 숲속의 미녀(Sleeping Beauty), PiggyBac, Tc Buster와 같은 트랜스포존 벡터는 높은 효율로 큰 유전자 화물의 통합을 허용하지만, 비특이적 통합 프로파일을 가지고 있다^23,24. HDR에 대한 표적 뉴클레아제와 함께 플라스미드, 선형 또는 단일 가닥 DNA 템플릿을 사용하는 비바이러스, 표적 이식유전자 통합은 매력적인 대안이지만, 특히 점점 더 커지는 유전자 화물의 경우 효율성이 낮고 1.5kb 이상의 화물을 사용할 때 10% 미만의 효율이 보고되어 효율성이 낮기 때문에 제한적이었습니다 ^8,19.

여기에서는 Webber, Johnson et al.에 기술된 바와 같이 1차 인간 T 세포에 큰 DNA 페이로드의 비바이러스, 상동성 매개 말단 결합(HMEJ) 삽입을 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다.²⁵. HMEJ는 Cas9 gRNA 타겟 부위 측면에 있는 짧은 48 bp 상동성 암을 사용하여 기존 HDR과 비교할 때 대형 DNA 화물의 고효율 타겟 통합을 가능하게 합니다. 일차 T 세포에서 플라스미드 DNA의 세포 독성을 감소시키는 한 가지 방법은 미니서클 또는 나노플라스미드와 같이 골격이 최소화된 플라스미드를 사용하는 것입니다²⁵. 미니서클(Minicircle)은 플라스미드 증폭 후 재조합을 통해 복제 기원과 항생제 내성 유전자를 절제하여 생성되는 소형화된 플라스미드 벡터입니다. 그들은 T 세포의 비 바이러스 공학을 개선하고 세포 독성을 감소시키는 것으로 나타났습니다^{23 , 24}. 나노 플라스미드는 또한 최소한의 복제 기원과 비 전통적인 선택 마커²⁶을 사용하여 전체 크기를 줄입니다. 경험에 비추어 볼 때, minicircle 및 nanoplasmid vector 플랫폼은 기존 plasmid에 비해 효율성이 비교합히 향상되고 독성이 감소한 것으로 나타났습니다²⁵.

여기에서는 시약 전달 및 시약 조성의 시간적 최적화를 시너지 효과로 시너지 효과를 내는 상세한 프로토콜과 HMEJ 및 CRISPR/Cas9를 사용하여 면역 요법 및 기타 다양한 응용 분야에 사용하기 위한 대형(>6.3kb), multicistronic DNA template을 가진 일차 인간 T 세포의 높은 효능, 부위 특이적 게놈 엔지니어링을 달성합니다²⁵. 우리는 특히 유전자 화물 >1.5kb^25,27)을 사용하여 1kb 상동성을 사용하는 기존 HR보다 HMEJ 및 48bp 상동성 암과의 더 높은 통합을 달성합니다. 중요한 것은 HMEJ 복구를 통해 조작된 T 세포가 고갈되지 않은 표현형²⁵을 유지하면서 우수한 세포 확장, 세포 독성 및 사이토카인 생산을 유지한다는 것입니다. 이 프로토콜은 cGMP 표준에 쉽게 적용할 수 있으며 임상적으로 관련된 세포 수로 확장할 수 있어 다양한 임상 시험에서 향후 사용으로 신속하게 전환할 수 있습니다²⁵.

모든 실험은 멸균/무균 기술, 개인 보호 장비 및 적절한 생물 안전 레벨 2(BSL2) 장비를 사용하여 혈액 매개 병원체에 대한 보편적인 예방 조치에 따라 수행되었습니다. 여기에 설명된 모든 실험은 미네소타 대학의 기관 생물 안전성 위원회(IBC)의 승인을 받았습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 배지 준비

1. T cell Complete Media(TCM)에 대한 보충제를 준비합니다.
   1. 필터 멸균된 100mM 아세트산을 첨가하여 재조합 human IL-2를 12000 IU/mL 농도로 재구성하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 그런 다음 1x 인산염 완충 식염수(1x PBS)에서 필터 멸균된 0.2% 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 6000IU/mL의 농도로 더 희석하고 피펫팅으로 잘 혼합하여 확장 저장 용액을 만듭니다.
   2. 재조합 human IL-7을 멸균수로 200ng/μL 농도로 재구성하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 그런 다음 PBS에서 필터 멸균된 0.2% BSA를 사용하여 100ng/μL의 농도로 더 희석하고 피펫팅으로 잘 혼합하여 확장 보관 용액을 만듭니다.
   3. 재조합 human IL-15를 멸균수로 200ng/μL 농도로 재구성하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 그런 다음 PBS에서 필터 멸균된 0.2% BSA를 사용하여 100ng/μL의 농도로 더 희석하고 피펫팅으로 잘 혼합하여 확장 보관 용액을 만듭니다.
      참고: 각 사이토카인을 -20 °C에서 -80 °C의 작은 부분 표본에 최대 6개월 동안 보관하고 반복적인 동결/해동 주기를 피하십시오.
2. TCM 미디어를 준비합니다.
   1. T-세포 확장 기저 배지에 2.6% T-세포 확장 보충제와 2.5% 면역 세포 혈청 대체물을 첨가하여 기저 배지를 준비합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
      1. 기저 배지에 L-글루타민 1%, 페니실린/스트렙토마이신 10mM, N-아세틸-L-시스테인 10mM, 300IU/mL 재조합 인간 IL-2, 5ng/mL 재조합 인간 IL-7 및 5ng/mL 재조합 인간 IL-15를 첨가하여 TCM을 준비합니다.
      2. 0.22μm 필터를 통해 배지를 멸균 배지 병에 통과시켜 TCM을 멸균합니다.
      3. 최대 2주 동안 TCM을 4°C로 유지하십시오.
3. 복구 미디어를 준비합니다.
   1. T-세포 확장 기저 배지에 2.6% T-Cell Expansion Supplement 및 2.5% Immune Cell Serum Replacement를 첨가하여 기저 배지를 준비합니다.
      1. 기저 배지에 1% L-글루타민, 10mM의 N-아세틸-L-시스테인, 300IU/mL 재조합 인간 IL-2, 5ng/mL 재조합 인간 IL-7, 5ng/mL 재조합 인간 IL-15 및 1μg/mL DNase를 첨가하여 회수 배지를 준비합니다.
         참고: 페니실린/스트렙토마이신을 전기 천공 후 세포 회수를 감소시킬 수 있으므로 회수 배지에 첨가하지 마십시오.
      2. 0.22μm 필터를 통해 여과재를 멸균된 매체 병에 통과시켜 회수 매체를 멸균합니다.
      3. 회수 매체를 최대 2주 동안 4°C로 보관하십시오.

2. 넉인 사이트 선택 및 템플릿 디자인

1. knock-in을 위한 게놈 표적 위치를 결정합니다.
   참고: 대상 셀에 대한 영향을 최소화하려는 경우 AAVS1과 같은 세이프 하버 위치를 사용할 수 있습니다. 유전자 발현을 방해하는 타겟 부위를 사용하여 단일 단계에서 타겟 유전자를 knock-out하는 동시에 관심 구조체를 knock-in할 수 있습니다. 내인성 유전자와 프레임 내(in-frame)를 통합하도록 설계된 표적 부위 및 공여체를 사용하여 유전자 융합을 생성하거나 2A 리보솜 스킵 서열과 결합하여 구축물을 내인성 프로모터의 전사 제어 하에 배치할 수 있습니다(그림 1).
2. 발현 카세트가 통합 부위와 일치하는 48 bp homology arm의 측면에 있고 gRNA 타겟 부위를 선형화하여 측면에 위치하도록 화물 템플릿을 설계합니다.
   참고: plasmid-linearizing gRNA는 human 또는 murine genome²⁵에서 발견되지 않는 염기서열 (GGGAGGCGTTCGGGCCACAG) 또는 게놈 표적 gRNA 염기서열을 타겟하도록 설계된 범용 gRNA²⁸ (UgRNA) (GGGAGGCGUUCGGGCCACAG)일 수 있으며, 이를 통해 단일 gRNA가 게놈 knock-in site에서 절단하고 cargo template을 선형화할 수 있습니다(그림 1). 나노플라스미드 또는 미니서클은 화물 템플릿의 벡터로 사용할 수 있습니다. 표준 플라스미드는 일부 형질전환된 라인에 대해 나노플라스미드 또는 미니서클 대신 사용할 수 있지만, T 세포와 같은 더 민감한 일차 세포에서 knock-in 및 세포 확장을 감소시킵니다.

3. T 세포 분리 및 활성화

1. 상용 공급업체에서 T 세포를 얻거나 면역자기 분류¹⁸을 사용하여 PBMC에서 T 세포를 분리합니다.
2. 실험에 필요한 T 세포의 수를 결정한 다음 TCM에서 mL당 1 × 10⁶ 세포의 농도로 T 세포를 해동, 세척 및 재현탁합니다. 이 혼합물 1mL를 24웰 플레이트의 웰에 추가합니다.
   1. T 세포 활성화 비드를 소용돌이치게 하여 비드를 재현탁시키고 각 웰에 2:1 비드: 세포의 비율로 비드를 추가합니다. T 세포 엔지니어링을 시작하기 전에 37°C 및 5% CO₂ 인큐베이터에서 36시간 동안 이러한 세포를 배양합니다.
      참고: 활성화 후 36시간 이하의 배양 시간은 T 세포 knock-in 효율, 생존력 및 엔지니어링 후 세포 확장을 감소시킵니다²⁵.

4. T 세포 공학

1. 실험 대조군을 포함하여 실험을 완료하는 데 필요한 실험 조건을 결정합니다.
   참고: 플라스미드 단독 조건을 일회적 발현에 대한 대조군으로 포함하는 것이 중요합니다. 플라스미드 공여체가 없는 상태에서 화학적으로 변형된 타겟 부위 gRNA²⁸ 및/또는 Cas9 mRNA를 사용한 전기천공(electroporation) 조건도 negative control로 사용할 수 있습니다.
2. 회수 플레이트를 준비합니다.
   1. 실험 대조군을 포함한 각 실험 조건에 대해 24웰 조직 배양 플레이트의 웰에 300μL의 회수 매체를 추가하고 37°C 및 5% CO₂ 인큐베이터에서 플레이트를 가열합니다.
      참고: 대체 셀 번호, 회수량 및 상태에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
3. T 세포를 준비합니다.
   1. 자극된 T 세포/T 세포 활성화 비드 혼합물을 수확하고, 생존 가능한 세포를 계수하고, 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브의 TCM 배지에서 1-5 × 10⁶ cells/mL의 농도로 T 세포/T 세포 활성화 비드를 재현탁합니다.
   2. 마이크로 원심분리기 튜브를 자석에 넣고( 재료 표 참조) 3분 동안 배양합니다.
      참고: T 세포 활성화 비드를 사용하여 T 세포를 활성화하는 경우 비드 제거가 필요합니다. 대체 활성화 방법을 사용하는 경우 비드 제거가 필요하지 않을 수 있습니다.
   3. 배양 후 자석에서 제거하지 않고 배지와 T 세포를 새 튜브로 옮깁니다. 이 튜브에는 T 세포 활성화 비드가 제거된 자극된 T 세포가 들어 있습니다. T 세포를 다시 세고 14mL 또는 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 튜브를 1×PBS로 채우고 원심분리 준비가 될 때까지 37°C 및 5% CO₂ 인큐베이터에 세포를 유지합니다.
4. T 세포 믹스를 준비합니다.
   1. 필요한 마스터 믹스 완충액(82% Primary Cell Solution 및 18% Supplement)의 양을 전기천공법 조건의 수에 1(n + 1)을 곱하여 계산합니다. (예: 계획된 6가지 전기천공 조건 + 1 = 7. 조건당 18 μL × 7 = 마스터 믹스 버퍼 126 μL).
      참고: 이 볼륨은 이 연구에 사용된 4D 전기천공법 시스템에만 해당됩니다( 재료 표 참조). 다른 electroporation 시스템은 다른 부피와 농도를 필요로 합니다. Volume of Primary Cell Solution = 필요한 Master Mix Buffer의 총 부피 × 0.82 및 Volume of Supplement = 필요한 Master Mix Buffer의 총 부피 x 0.18. (예: 126 μL = 103.32 μL의 1차 세포 용액 0.82 × 및 0.18 × 126 μL = 22.68 μL).
   2. Primary Cell Solution과 Supplement를 함께 혼합하여 Master Mix Buffer를 만듭니다.
   3. 200 × g (실온에서)에서 10분 동안 1x PBS의 T 세포를 원심분리하고 상층액을 흡인합니다.
   4. Master Mix Buffer의 T 세포를 18μL의 Master Mix Buffer당 1 × 10⁶ 개의 세포 농도로 재현탁합니다.
5. 시약을 준비합니다.
   1. 원액의 농도를 사용하여 전기천공법당 표시된 질량을 달성하는 데 필요한 HMEJ 플라스미드, 타겟 부위 gRNA, 플라스미드 선형화 gRNA(UgRNA) 및 Cas9 mRNA의 부피를 측정합니다(표 2).
   2. 각 조건에 대해 얼음 위의 96웰 플레이트의 웰에 시약을 추가합니다.
6. Electroporation Mix를 준비합니다.
   1. 필요에 따라 18μL의 T 세포 혼합물을 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
   2. 필요에 따라 마스터 믹스 버퍼를 추가하여 모든 전기천공법 조건이 최종 총 부피 22μL가 되도록 합니다.
      참고: 22 μL 부피에는 잠재적인 파이펫팅 손실을 설명하기 위해 10%의 초과 부피가 포함됩니다.
7. 전기천공법을 수행합니다.
   1. 장비를 켜고 프로그램을 로드합니다.
   2. 필요한 큐벳 수를 결정하고 필요한 큐벳 수를 엽니다. 큐벳과 캡의 한쪽 끝을 표시하고 큐벳에서 캡을 제거합니다.
      참고: 20μL 반응을 위해 큐벳당 16개의 웰이 있습니다.
   3. 96웰 플레이트의 웰에서 20μL의 Electroporation Mix를 1-2회 위아래로 부드럽게 피펫팅하고 큐벳에 로드합니다.
   4. 캡을 거꾸로 씌우지 않도록 4.7.2단계에서 만든 표시를 사용하여 큐벳을 다시 닫습니다. 큐벳을 3-5회 두드려 잠재적인 기포를 제거한 다음 장비를 놓고 큐벳을 전기천공합니다.
   5. 장비에서 큐벳을 부드럽게 제거하고 후드에 놓고 세포를 실온에서 15분 동안 휴지시킵니다.
   6. 나머지 휴식 후, 회수 플레이트에서 80μL의 가열된 회수 매체를 당겨 각 샘플에 추가하고(세포에 직접 추가하지 않고 큐벳 측면에 추가) 매우 부드럽게 위아래로 한 번 피펫팅한 다음 총 100μL 부피를 회수 플레이트로 다시 옮깁니다.
      참고: 세포는 전기천공 후 매우 취약합니다. 부드러운 취급이 매우 중요합니다.
   7. 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 30 분 동안 세포를 배양합니다.
   8. TCM을 추가하여 세포를 1 × 10⁶ cells/mL의 농도로 희석합니다. 다음날 배지의 절반을 교체한 다음 실험 기간 동안 3-4일마다 2× 사이토카인 농도의 TCM으로 교체하십시오.
   9. 1 × 10⁶ cells/mL로 희석한 후 각 웰에 0.5:1 비드:세포의 비율로 T 세포 활성화 비드를 첨가하여 세포를 재충전합니다.
      참고: 세포가 빠르게 확장될 수 있습니다. 절반의 배지 교체를 수행해야 할 수 있으며 세포를 더 큰 웰로 이동해야 할 수 있습니다.
   10. 3일째에는 T 세포 활성화 구슬을 제거합니다.
   11. 원하는 성장 기간이 지나면 세포를 수확합니다.
       참고: 큐벳에 사용하지 않은 웰이 있는 경우 사용된 웰을 표시할 수 있으며 전체 큐벳을 50mL 원뿔형에 넣고 나중에 사용할 수 있도록 4°C에서 보관할 수 있습니다.

여기에서 "Giant Minicircle" 구조체라고 하는 대형(>6.3kb) multicistronic 템플릿이 CRISPR/Cas9 편집을 사용하여 1차 인간 T 세포의 TRAC 유전자 자리에 통합되었습니다. TRAC 특이적 gRNA(TCTCTCAGCTGGTACACGGC), UgRNA 및 HMEJ 나노플라스미드(그림 2A)는 TRAC 특이적 gRNA, 범용 gRNA 및 음성 대조군으로 사용된 Cas9 mRNA가 결핍된 상태입니다. Giant Minicircle 구조체, TRAC 특이적 gRNA, 범용 gRNA 및 Cas9 mRNA를 포함하는 샘플은 GFP 발현을 측정할 때 평균 23.35%(23.5% ± 5.247)인 반면, 음성 대조군은 GFP 발현이 없었습니다(그림 2B). 실험 조건 간에 접힘 확장(그림 2C)과 생존력(그림 2D)에는 유의한 차이가 없었습니다. 이러한 결과는 매우 큰 템플릿의 고효율 knock-in을 보여주면서 우수한 세포 생존력과 세포 확장을 유지합니다.

그림 1: HMEJ 구성 설계의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 거대 미니서클 구조체로 전기천공된 T 세포의 특성화. (A) Giant Minicircle 구성의 개략도, GSG 링커, anti-CD19 CAR 및 MND 프로모터 아래의 DHFR 뮤테인 및 eGFP를 사용하여 TRAC 프로모터 하에서 항-메소텔린 CAR 및 RQR8을 인코딩하는 대형(>6.3kb) 다중시스트로닉 템플릿. (B) Giant Minicircle 구조체 및 CRISPR-Cas9 시약을 사용한 전기천공 후 9일 후 T 세포의 RQR8 발현 비율, (C) 접힘 확장 및 (D) 생존율, CRISPR-Cas9 시약이 없는 Giant Minicircle로 전기천공된 음성 대조군과 비교. (***p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 큐벳 및 회수 플레이트의 세포 농도.

표 2: 필요한 CRISPR/Cas9 시약 및 DNA 템플릿의 양.

양자 세포 치료(ACT)가 계속 발전함에 따라 바이러스 기반 벡터와 관련된 높은 비용과 복잡성 없이 면역 세포를 엔지니어링할 수 있는 효율적인 비바이러스 방법에 대한 수요가 증가하고 있습니다. 이 분야의 핵심 목표는 엔지니어링된 세포 제품의 일관성, 안전성 및 기능을 개선하는 현장별 통합을 달성하는 것입니다. 최근 연구에서 리포터 유전자 및 단일 CAR 또는 TCR 염기서열과 같은 작은 유전자 구조체의 성공적인 비바이러스 통합이 입증되었지만(²⁹), 이러한 방법을 더 큰 다중 유전자 발현 카세트로 확장할 필요가 있습니다. 이러한 대형 카세트는 케모카인 수용체 또는 사이토카인 아머링의 추가와 같은 면역 세포 기능을 향상시키거나, 특이성을 개선하거나(예: 로직 게이트 시스템) 킬 스위치로 안전성을 높이는 데 필요합니다. 이를 위해 우리는 더 큰 유전자 화물의 효율적인 부위 특이적 통합이 가능한 비바이러스 접근법을 개발하고자 했습니다²⁵.

프로토콜 전반에 걸쳐 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 독성을 최소화하기 위해 고품질의 깨끗한 나노플라스미드 또는 미니서클이 필요합니다. 이 연구에서는 상업적으로 제조된 플라스미드가 가장 우수한 성능을 발휘했습니다. T 세포 활성화와 전기천공 사이의 36시간 간격도 이상적인 결과를 위해 중요합니다. 또한 세포가 회복되는 동안 전기천공법 직후 세포 취급 및 조작을 최소화하는 것도 중요합니다. 또한 전기천공법 후 배양액에 새로운 T 세포 활성화 비드를 다시 추가하여 최상의 화물 통합 빈도와 세포 확장을 달성하는 것도 중요합니다.

여기에 설명된 바와 같이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 electroporation 시스템을 사용합니다( 재료 표 참조). 다른 electroporation 시스템도 적합할 수 있지만 장치별 electroporation 조건의 최적화와 electroporation 후 셀 처리가 필요할 수 있습니다.

인간 T 세포의 HMEJ 매개 엔지니어링에는 몇 가지 한계가 있습니다. 이 프로토콜은 플라스미드와 함께 작동할 수 있지만, 최적의 결과를 얻으려면 표준 플라스미드만큼 제조가 쉽지 않은 화물 배송을 위해 나노 플라스미드 또는 미니서클을 사용해야 합니다. 더욱이, 매우 큰 멀티시스트로닉 카세트의 성공적인 통합이 입증되었지만, 유전자 통합 빈도가 떨어지기 시작하는 화물 상한이 있을 가능성이 있습니다.

이 연구는 특히 암 면역 요법의 맥락에서 조작된 T 세포 생산을 위한 강력하고 효율적인 비바이러스 게놈 엔지니어링 방법으로 HMEJ를 제시합니다. 기존 바이러스 벡터의 한계를 극복함으로써 이 접근법은 향상된 기능을 가진 유전자 변형 T 세포를 생성하기 위한 비용 효율적이고 확장 가능하며 안전한 대안을 제공합니다. 대형 다중 유전자 카세트를 정밀하게 통합할 수 있는 능력은 암, 전염병 및 자가면역 질환을 포함한 광범위한 질병을 치료하기 위해 면역 세포를 엔지니어링할 수 있는 새로운 가능성을 열어줍니다. 또한 HMEJ 방법과 임상 등급 제조 공정의 호환성은 실제 치료 환경에서 실용적 적용 가능성을 보장하여 가까운 장래에 보다 접근하기 쉽고 효율적인 세포 기반 치료를 위한 길을 닦습니다.

B.R.W. 및 B.S.M.은 이 원고의 작업을 지원하기 위해 Intima Biosciences가 자금을 지원하는 Sponsored Research Agreements의 주요 연구자입니다. 이 원고에 요약된 방법과 접근 방식을 다루는 특허가 제출되었습니다.

B.R.W.는 Office of Discovery and Translation, NIH 보조금 R21CA237789, R21AI163731, P01CA254849, P50CA136393, U54CA268069, R01AI146009, DOD 보조금 HT9425-24-1-1005, HT9425-24-1-1002, HT9425-24-1-0231 보조금, Children's Cancer Research Fund, Fanconi Anemia Research Fund 및 Randy Shaver Cancer and Community Fund의 자금 지원을 인정합니다. B.S.M.은 Office of Discovery and Translation, NIH 보조금 R01AI146009, R01AI161017, P01CA254849, P50CA136393, U24OD026641, U54CA232561, P30CA077598, U54 CA268069, DOD 보조금 HT9425-24-1-1005, HT9425-24-1-1002, HT9425-24-1-0231 및 소아암 연구 기금, 판코니 빈혈 연구 기금 및 랜디 셰이버 암 및 지역사회 기금의 자금 지원을 인정합니다.