JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم توفير بروتوكول مفصل لاستخدام تقنية CRISPR / Cas9 لتحقيق ضربة مستهدفة عالية الكفاءة للتركيبات الكبيرة متعددة السيسترونيك في الخلايا التائية البشرية الأولية عبر مسار إصلاح الحمض النووي النهائي بوساطة التماثل (HMEJ). تحافظ الخلايا التائية المصممة باستخدام بروتوكول cGMP القابل للتكيف على تمدد الخلايا الممتاز والسمية الخلوية وإنتاج السيتوكين.

Abstract

تعتمد العديد من العلاجات الخلوية المعتمدة الحالية على نواقل الفيروسات العكسية أو القهقرية لهندسة الخلايا التائية للتعبير عن مستقبل مستضد خيمري (CAR) أو مستقبلات الخلايا التائية الخارجية (TCR) لاستهداف مستضد معين مرتبط بالورم. يؤدي الاعتماد على النواقل الفيروسية لإنتاج الخلايا التائية العلاجية إلى زيادة كبيرة في الجدول الزمني والتكلفة وتعقيد التصنيع مع الحد من ترجمة العلاجات الجديدة ، لا سيما في البيئة الأكاديمية. يتم تقديم عملية للهندسة غير الفيروسية الفعالة للخلايا التائية باستخدام CRISPR / Cas9 والانضمام النهائي بوساطة التماثل لتحقيق تكامل مستهدف لشحنات الحمض النووي الكبيرة متعددة السيسترونيك. حقق هذا النهج ترددات تكامل مماثلة لتلك الموجودة في النواقل الفيروسية مع إنتاج خلايا تائية عالية الأداء قادرة على فعالية قوية مضادة للورم في المختبر وفي الجسم الحي. والجدير بالذكر أن هذه الطريقة قابلة للتكيف بسرعة مع ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (cGMP) والتوسع السريري ، مما يوفر خيارا على المدى القريب لتصنيع الخلايا التائية العلاجية لاستخدامها في التجارب السريرية.

Introduction

الخلايا التائية هي عنصر رئيسي في الجهاز المناعي التكيفي ، وتمتلك قدرة محللة خلوية مباشرة ، والقدرة على تعديل الاستجابة المناعية من خلال إنتاج السيتوكينات ، وترخيص الخلايا البائية والخلايا التغصنية ، وإنشاء الذاكرة المناعية1. يلعبون أدوارا حاسمة في نمو المناعة ، والتوازن والمراقبة ، والحماية من مسببات الأمراض ، والوقاية والدفاع من السرطان ، وكذلك الحساسية والمناعةالذاتية 1. تمتلك الخلايا التائية تنوعا هائلا من مستقبلات الخلايا التائية (TCRs) التي يتم إنشاؤها من خلال إعادة تركيب V (D) J ، مما يسمح للخلايا التائية بالتعرف على مجموعة واسعة من المستضدات وتكوين استجابات مناعية فعالة ضد مسببات الأمراضالمختلفة 1،2. يمكن تصنيف الخلايا التائية بشكل عام إلى فئتين ، الخلايا التائية CD4 ، والمعروفة أيضا باسم الخلايا التائية المساعدة ، والتي تساعد بشكل أساسي الخلايا المناعية الأخرى ، مثل الخلايا البائية ، في تنسيق الاستجابة المناعية ، وخلايا CD8 T ، أو الخلايا التائية السامة للخلايا ، التي تقتل الخلايا المصابة أو السرطانية مباشرة من خلال التعرف على مستضدات معينة موجودة على أسطحها1.

أدى تطوير مستقبلات المستضد الخيمرية (CAR) إلى زيادة هائلة في الاهتمام بهندسة الجينوم للخلايا التائية للعلاجات المناعية. CARs عبارة عن بروتينات مصممة هندسيا تدمج مجالات ربط المستضد المشتقة من الأجسام المضادة مع مجالات إشارات الخلايا التائية ، مما يسمح للخلايا التائية بتحديد واستهداف الخلايا التي تعبر عن الحاتمة المحددة التي يتعرف عليها جزء الجسم المضاد من CAR3. تم استخدام هذه المستقبلات لمجموعة متنوعة من العلاجات المناعية ، بما في ذلك الأمراض المعدية والمناعة الذاتية ، ولكن التكنولوجيا هي الأكثر تقدما للعلاجات المناعية للسرطان.

حققت خلايا CAR-T نجاحا كبيرا في علاج سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية ، لكنها أظهرت فعالية محدودة في علاج الأورام الصلبة4،5. وقد أدى ذلك إلى موجة من التطوير الإضافي سعيا لتحسين فعالية خلايا CAR-T لمؤشرات الورم الصلبة. تم تطوير طرق متعددة ، بما في ذلك تدريع السيتوكين ، والضربة القاضية لجينات نقطة التفتيش ، والمستقبلات السلبية المهيمنة ، ومستقبلات الكيموكينات ، والتعبير عن CARs متعددة في خلية واحدة ، وتعديل CAR لتعزيز الإشارات داخل الخلايا ، والتكامل في مواقع محددة مسبقا ، على سبيل المثال ، موضع TRAC ، لاستغلال الآليات التنظيمية للمضيف لمنع الإرهاق6،7،8. تتطلب العديد من هذه الأساليب إما حمولة وراثية أكبر و / أو تكاملا محددا للموقع. تشمل الأساليب البديلة أيضا استخدام TCRs المعدلة وراثيا للسماح للخلايا التائية باستهداف المستضدات الحديثة داخل الخلايا9،10. ومع ذلك ، فإن هذا له عيب كبير يتمثل في مطالبة TCR بخصوصية لكل من حاتمة المستضد الجديد وجزيء HLA ، مما يقيد استخدام المنتج العلاجي النهائي للمرضى الذين يعبرون عن HLA المماثل. علاوة على ذلك ، تعمل العديد من الأورام على تغيير أو تقليل تعبير HLA استجابة للعلاج المناعي ، مما يقلل بشكل كبير من فعالية الخلايا التائية التي تعبر عن TCRs المعدلة وراثيا11.

يتم تصنيع معظم علاجات الخلايا CAR-T أو TCR-T في التجارب السريرية باستخدام نواقل الفيروسات القهقرية ، مثل فيروس العدسات أو فيروس جاما ريترو ، مما يحقق تردد تكامل عال مع البضائع ذات الحجم المعتدل. ومع ذلك ، تعاني النواقل الفيروسية من جداول زمنية طويلة للتصنيع بسبب متطلبات ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (cGMP) وملفات تعريف التكامل غير المحددة التي تخلق خطر الطفرات الإدراجية12،13. علاوة على ذلك ، قد يكون من الصعب إنتاج فيروس قهقري معدل وراثيا عند عيارات عالية إذا تجاوزت الشحنة 5 كيلو بايت14. لا تتكامل النواقل الأخرى ، مثل تلك المشتقة من الفيروس المؤتلف المرتبط بالغدة (rAAV) ، بشكل طبيعي ولكن يمكنها نقل قالب المتبرع بالحمض النووي إلى النواة ويمكن استخدامها مع CRISPR / Cas9 لتسهيل هندسة الجينوم بوساطة إعادة التركيب التقليدية الموجهة بالتماثل (HDR). ومع ذلك ، فإن هذه الفيروسات لها أيضا تدفقات عمل إنتاج طويلة ومعقدة ومحدودة بحجم الحمولة (<4.7 كيلو بايت) والحاجة إلى تضمين أذرع تماثل طويلة (500-1000 نقطة أساس) 15،16،17،18.

تم الإبلاغ عن هندسة الجينوم غير الفيروسية باستخدام الينقولات أو مزيج من النوكليازات المستهدفة وقالب متبرع بالحمض النووي في الخلايا الليمفاوية البشريةالأولية 8،19،20. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب محدودة بسبب الاستجابة السامة لجزيئات الحمض النووي العارية في السيتوبلازم بعد التعرف عليها بواسطة مستشعرات الحمض النووي السيتوبلازمي المعبر عنها في الخلايا الليمفاوية21. بذلت محاولات لاستخدام مثبطات الجزيئات الصغيرة لمسارات استشعار الحمض النووي هذه أثناء التعدي ، لكن تكرار هذه المسارات قد يعقد استخدامها في بروتوكولات cGMP22. والجدير بالذكر أن نواقل الينقولات ، مثل Sleeping Beauty و PiggyBac و Tc Buster ، تسمح بتكامل شحنة وراثية كبيرة ذات كفاءات عالية ، ولكن لها ملف تعريف تكامل غير محدد23،24. يعد تكامل الجينات المعدلة وراثيا غير الفيروسي المستهدف باستخدام قوالب الحمض النووي البلازميد أو الخطي أو أحادي الشريطة بالاشتراك مع نوكلياز مستهدف ل HDR بديلا جذابا ، ولكنه كان محدودا بسبب ضعف الكفاءة ، خاصة مع الشحنات الجينية الكبيرة بشكل متزايد ، مع أقل من 10٪ من الكفاءة التي تم الإبلاغ عنها عند استخدام البضائع التي تزيد عن 1.5 كيلو بايت8،19.

هنا ، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لإدخال الانضمام النهائي غير الفيروسي بوساطة التماثل (HMEJ) لحمولات الحمض النووي الكبيرة في الخلايا التائية البشرية الأولية ، كما هو موضح في ويبر وجونسون وآخرون.25. يستخدم HMEJ أذرع تماثل قصيرة 48 نقطة أساس محاطة بمواقع مستهدفة Cas9 gRNA للسماح بالتكامل المستهدف عالي الفعالية لشحنات الحمض النووي الكبيرة عند مقارنتها ب HDR التقليدية. تتمثل إحدى طرق تقليل السمية الخلوية للحمض النووي البلازميد في الخلايا التائية الأولية في استخدام البلازميدات ذات العمود الفقري المصغر ، مثل الدوائر الصغيرة أو البلازميداتالنانوية 25. الدوائر الصغيرة هي نواقل بلازميد مصغرة يتم إنتاجها عن طريق استئصال أصل النسخ المتماثل وجين مقاومة المضادات الحيوية من خلال إعادة التركيب بعد تضخيم البلازميد. لقد ثبت أنها تحسن الهندسة غير الفيروسية للخلايا التائية وتقلل من سمية الخلايا23،24. تحتوي البلازميدات النانوية أيضا على حجم إجمالي منخفض يتم إنجازه من خلال استخدام الحد الأدنى من أصل النسخ المتماثل وعلامة اختيار غير تقليدية26. من خلال تجربتنا ، توفر منصات ناقلات الدوائر الصغيرة والنانوبلازميد تحسنا مماثلا في الكفاءة وتقليل السمية مقارنة بالبلازميدات التقليدية25.

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا يجمع بين التحسين الزمني لتوصيل الكاشف وتكوين الكاشف بالإضافة إلى استخدام HMEJ و CRISPR / Cas9 لتحقيق فعالية عالية وهندسة الجينوم الخاصة بالموقع للخلايا التائية البشرية الأولية ذات قوالب الحمض النووي متعددة السترونيك كبيرة (>6.3 كيلو بايت) للاستخدام في العلاجات المناعية ومجموعة متنوعة من التطبيقات الأخرى25. نحقق تكاملا أعلى مع أذرع التماثل HMEJ و 48 نقطة أساس مقارنة ب HR التقليدي باستخدام أذرع تماثل 1 كيلو بايت ، خاصة مع الشحنات الجينية >1.5 كيلو بايت25،27. الأهم من ذلك ، أن الخلايا التائية التي تم تصميمها من خلال إصلاح HMEJ تحتفظ بتوسع الخلايا الممتاز ، والسمية الخلوية ، وإنتاج السيتوكين ، مع الاحتفاظ بالنمط الظاهريغير المستنفد 25. هذا البروتوكول قابل للتكيف بسهولة مع معايير cGMP وقابل للتطوير لأرقام الخلايا ذات الصلة سريريا ، مما يتيح الانتقال السريع إلى الاستخدام المستقبلي في مجموعة متنوعة من التجارب السريرية25.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب مع احتياطات عالمية لمسببات الأمراض المنقولة بالدم ، باستخدام تقنية معقمة / معقمة ، ومعدات الحماية الشخصية ، ومعدات السلامة البيولوجية المناسبة من المستوى 2 (BSL2). تمت الموافقة على جميع التجارب الموضحة هنا من قبل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (IBC) في جامعة مينيسوتا. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. تحضير مكملات غذائية للخلية التائية كاملة الوسائط (TCM).
    1. أعد تكوين IL-2 البشري المؤتلف بتركيز 12000 وحدة دولية / مل عن طريق إضافة حمض الأسيتيك المعقم بالترشيح 100 ملي مولار وخلطه جيدا عن طريق سحب العينات. بعد ذلك، قم بتخفيفه إلى تركيز 6000 وحدة دولية / مل باستخدام ألبومين مصل الأبقار المعقم بالفلتر بنسبة 0.2٪ (BSA) في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS) واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات لعمل محلول تخزين ممتد.
    2. يعاد تكوين IL-7 البشري المؤتلف بتركيز 200 نانوغرام / ميكرولتر بالماء المعقم ويخلط جيدا عن طريق سحب العينات. بعد ذلك، قم بتخفيفه إلى تركيز 100 نانوغرام/ميكرولتر مع معقم بالفلتر 0.2٪ BSA في PBS واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات لعمل محلول تخزين ممتد.
    3. يعاد تكوين IL-15 البشري المؤتلف بتركيز 200 نانوغرام / ميكرولتر بالماء المعقم ويخلط جيدا عن طريق سحب العينات. بعد ذلك، قم بتخفيفه إلى تركيز 100 نانوغرام/ميكرولتر مع معقم بالفلتر 0.2٪ BSA في PBS واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات لعمل محلول تخزين ممتد.
      ملاحظة: احتفظ بكل سيتوكين في حصص صغيرة عند -20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر وتجنب دورات التجميد / الذوبان المتكررة.
  2. تحضير وسائط الطب الصيني التقليدي.
    1. تحضير الوسائط القاعدية عن طريق إضافة مكمل توسعة الخلايا التائية بنسبة 2.6٪ واستبدال مصل الخلايا المناعية بنسبة 2.5٪ إلى الوسط القاعدي لتوسيع الخلايا التائية. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل.
      1. تحضير الطب الصيني التقليدي عن طريق إضافة 1٪ L-Glutamine ، و 1٪ Penicillin / Streptomycin ، و 10 ملي من N-Acetyl-L-cysteine ، و 300 وحدة دولية / مل IL-2 البشري المؤتلف ، و 5 نانوغرام / مل IL-7 البشري المؤتلف ، و 5 نانوغرام / مل IL-15 البشري المؤتلف إلى الوسائط القاعدية.
      2. قم بتعقيم الطب الصيني التقليدي عن طريق تمرير الوسائط عبر مرشح 0.22 ميكرومتر في زجاجة وسائط معقمة.
      3. حافظ على الطب الصيني التقليدي عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  3. إعداد وسائط الاسترداد.
    1. تحضير الوسائط القاعدية عن طريق إضافة مكمل تمدد الخلايا التائية بنسبة 2.6٪ ، واستبدال مصل الخلايا المناعية بنسبة 2.5٪ إلى الوسط القاعدي لتوسيع الخلايا التائية.
      1. تحضير وسائط الاسترداد عن طريق إضافة 1٪ L-Glutamine ، و 10 ملي من N-Acetyl-L-cysteine ، و 300 وحدة دولية / مل IL-2 البشري المؤتلف ، و 5 نانوغرام / مل IL-7 البشري المؤتلف ، و 5 نانوغرام / مل IL-15 البشري المؤتلف إلى الوسائط القاعدية و 1 ميكروغرام / مل DNase.
        ملاحظة: لا تضيف البنسلين / الستربتومايسين إلى وسائط الاسترداد ، حيث يمكن أن يقلل من استعادة الخلايا بعد التثقيب الكهربائي.
      2. قم بتعقيم وسائط الاسترداد عن طريق تمرير الوسائط عبر مرشح 0.22 ميكرومتر في زجاجة وسائط معقمة.
      3. احتفظ بوسائط الاسترداد عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.

2. اختيار الموقع وتصميم القالب

  1. تحديد الموقع الجينومي المستهدف للضربة القاضية.
    ملاحظة: يمكن استخدام موقع الملاذ الآمن، مثل AAVS1، إذا كان الحد الأدنى من التأثير على الخلية المستهدفة مطلوبا. يمكن استخدام الموقع المستهدف الذي يعطل التعبير الجيني لضرب الجين المستهدف في وقت واحد وضرب بناء الاهتمام في خطوة واحدة. يمكن استخدام الموقع المستهدف والمتبرع المصمم للتكامل في الإطار مع جين داخلي لإنشاء اندماج جيني أو بالاشتراك مع تسلسل تخطي الريبوسومي 2A لوضع البناء تحت التحكم النسخي لمحفز داخلي (الشكل 1).
  2. صمم قالب الشحنة بحيث يكون كاسيت التعبير محاطا بأذرع تماثل 48 نقطة أساس تتطابق مع موقع التكامل وتحيط بها مواقع مستهدفة gRNA الخطية.
    ملاحظة: يمكن أن يكون الحمض النووي الريبي الخطي البلازميد عبارة عن gRNA28 عالمي (UgRNA) (GGGAGGCGUUCGGGCCACAG) مصمم لاستهداف تسلسل (GGGAGGCGTTCGGGCCACAG) غير موجود في الجينوم البشري أو الفئران25 ، أو تسلسل gRNA المستهدف الجيني ، بحيث يمكن ل gRNA واحد أن يقطع في موقع الضربة الجينومية وأيضا خطية قالب الشحنة (الشكل 1). يمكن استخدام البلازميدات النانوية أو الدوائر الصغيرة كناقلات لقالب الشحن. يمكن استخدام البلازميدات القياسية بدلا من البلازميدات النانوية أو الدوائر الصغيرة لبعض الخطوط المحولة ، ولكنها ستؤدي إلى تقليل تمدد الخلايا في الخلايا الأولية الأكثر حساسية مثل الخلايا التائية.

3. عزل الخلايا التائية وتنشيطها

  1. احصل على الخلايا التائية من بائع تجاري أو عزل الخلايا التائية من PBMCs باستخدام الفرز المناعيالمغناطيسي 18.
  2. حدد عدد الخلايا التائية اللازمة للتجربة ثم قم بإذابة الخلايا التائية وغسلها وإعادة تعليقها بتركيز 1 × 106 خلايا لكل مل في الطب الصيني التقليدي. أضف 1 مل من هذا المزيج إلى آبار طبق 24 بئرا.
    1. دوامة حبات تنشيط الخلية التائية لتعليق الخرزات وإضافة الخرز بنسبة 2: 1 الخرز: خلية لكل بئر. احتضان هذه الخلايا لمدة 36 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 قبل البدء في هندسة الخلايا التائية.
      ملاحظة: سيقلل وقت الحضانة الذي يقل عن 36 ساعة أو أكثر من 36 ساعة بعد التنشيط من كفاءة الخلايا التائية ، وقابليتها للبقاء ، وتوسيع الخلايا بعد الهندسة25.

4. هندسة الخلايا التائية

  1. تحديد الشروط التجريبية المطلوبة لإكمال التجربة ، بما في ذلك الضوابط التجريبية.
    ملاحظة: من المهم تضمين حالة البلازميد فقط كعنصر تحكم في التعبير العرضي. يمكن أيضا استخدام حالة التثقيب الكهربائي مع الموقع المستهدف المعدل كيميائيا gRNA28 و / أو Cas9 mRNA في حالة عدم وجود متبرع بالبلازميد كعنصر تحكم سلبي.
  2. تحضير لوحة الانتعاش.
    1. لكل حالة تجريبية ، بما في ذلك الضوابط التجريبية ، أضف 300 ميكرولتر من وسائط الاسترداد إلى بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا وقم بتسخين اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 .
      ملاحظة: انظر الجدول 1 للاطلاع على أرقام الخلايا البديلة وحجم الاسترداد والشروط.
  3. تحضير الخلايا التائية.
    1. احصد خليط حبة تنشيط الخلايا التائية / الخلايا التائية المحفز ، وعد الخلايا القابلة للحياة ، وأعد تعليق حبات تنشيط الخلايا التائية / الخلايا التائية بتركيز 1-5 × 106 خلايا / مل في وسائط الطب الصيني التقليدي في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
    2. ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق في مغناطيس (انظر جدول المواد) واتركه يحتضن لمدة 3 دقائق.
      ملاحظة: إزالة الخرزة مطلوبة إذا تم استخدام حبات تنشيط الخلايا التائية لتنشيط الخلايا التائية. قد لا تكون إزالة الخرزة ضرورية إذا تم استخدام طريقة بديلة للتنشيط.
    3. بعد الحضانة ودون إزالتها من المغناطيس ، انقل الوسائط والخلايا التائية إلى أنبوب جديد. يحتوي هذا الأنبوب على خلايا تائية محفزة مع إزالة حبات تنشيط الخلايا التائية. أعد عد الخلايا التائية وضعها في أنابيب مخروطية سعة 14 مل أو 50 مل. قم بتعبئة الأنبوب ب 1× PBS واحتفظ بالخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى تصبح جاهزة لأجهزة الطرد المركزي.
  4. تحضير مزيج الخلايا التائية.
    1. حدد كمية Master Mix Buffer (82٪ محلول خلية أولية و 18٪ مكمل) المطلوبة بضرب عدد ظروف التثقيب الكهربائي بالإضافة إلى واحد (ن + 1). (على سبيل المثال ، 6 ظروف للتثقيب الكهربائي مخطط لها + 1 = 7. 7 × 18 ميكرولتر لكل شرط = 126 ميكرولتر من المخزن المؤقت الرئيسي للخلط).
      ملاحظة: هذه الأحجام خاصة بنظام التثقيب الكهربائي رباعي الأبعاد المستخدم في هذه الدراسة (انظر جدول المواد). تتطلب أنظمة التثقيب الكهربائي الأخرى أحجام وتركيزات مختلفة. حجم محلول الخلية الأولية = الحجم الإجمالي للمخزن المؤقت الرئيسي المطلوب × 0.82 وحجم الملحق = الحجم الإجمالي للمخزن المؤقت الرئيسي للمزيج الرئيسي المطلوب × 0.18. (على سبيل المثال 0.82 × 126 ميكرولتر = 103.32 ميكرولتر من محلول الخلية الأولية و 0.18 × 126 ميكرولتر = 22.68 ميكرولتر).
    2. امزج محلول الخلية الأولية والمكملات معا لعمل Master Mix Buffer.
    3. خلايا الطرد المركزي T في 1x PBS لمدة 10 دقائق عند 200 × جم (في درجة حرارة الغرفة) وتستنشق المادة الطافية.
    4. أعد تعليق الخلايا التائية في المخزن المؤقت للمزيج الرئيسي بتركيز 1 × 106 خلايا لكل 18 ميكرولتر من المخزن المؤقت للمزيج الرئيسي.
  5. تحضير الكواشف.
    1. باستخدام تركيزات محاليل المخزون ، حدد حجم بلازميد HMEJ ، والموقع المستهدف gRNA ، وخط البلازميد gRNA (UgRNA) ، و Cas9 mRNA اللازم لتحقيق الكتلة المشار إليها لكل تثقيب كهربائي (الجدول 2).
    2. أضف الكواشف إلى بئر من 96 بئرا على الجليد لكل حالة.
  6. تحضير مزيج التثقيب الكهربائي.
    1. أضف 18 ميكرولتر من خلية T Mix إلى كل بئر من لوحة 96 جيدا حسب الحاجة.
    2. أضف Master Mix Buffer إضافيا حسب الحاجة لضمان أن تكون جميع ظروف التثقيب الكهربائي بحجم إجمالي نهائي يبلغ 22 ميكرولتر.
      ملاحظة: يتضمن الحجم البالغ 22 ميكرولتر حجما زائدا بنسبة 10٪ لحساب الفقد المحتمل في سحب العينات.
  7. إجراء التثقيب الكهربائي.
    1. قم بتشغيل الجهاز وتحميل البرنامج.
    2. حدد عدد الكوفيتات المطلوبة وافتح العدد المطلوب من الكوفيت. ضع علامة على أحد طرفي الكوفيت والغطاء وقم بإزالة الغطاء من الكوفيت.
      ملاحظة: يوجد 16 بئرا لكل كوفيت لتفاعلات 20 ميكرولتر.
    3. قم بإخراج 20 ميكرولتر من مزيج التثقيب الكهربائي برفق من آبار لوحة البئر 96 لأعلى ولأسفل 1-2 مرات وقم بتحميلها في كوفيت.
    4. قم بتلخيص الكوفيت باستخدام العلامة الموضحة في الخطوة 4.7.2 لتجنب وضع الغطاء للخلف. اضغط على الكوفيت 3-5 مرات لإزالة فقاعات الهواء المحتملة ، ثم ضع الجهاز وقم بتزويد الكوفيت بالكهرباء.
    5. قم بإزالة الكوفيت برفق من الجهاز ، وضعه في الغطاء ، واترك الخلايا ترتاح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    6. بعد الباقي ، اسحب 80 ميكرولتر من وسائط الاسترداد الدافئة من لوحة الاسترداد وأضفها إلى كل عينة (أضف إلى جانب الكوفيت ، وليس مباشرة إلى الخلايا) ، وقم بلطف شديد لأعلى ولأسفل مرة واحدة ، وانقل الحجم الإجمالي البالغ 100 ميكرولتر مرة أخرى إلى لوحة الاسترداد.
      ملاحظة: الخلايا هشة للغاية بعد التثقيب الكهربائي. التعامل اللطيف مهم للغاية.
    7. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة.
    8. أضف الطب الصيني التقليدي لتخفيف الخلايا إلى تركيز 1 × 106 خلايا / مل. استبدل نصف الوسائط في اليوم التالي ثم كل 3-4 أيام بالطب الصيني التقليدي بتركيزات 2× من السيتوكين طوال مدة التجربة.
    9. بعد التخفيف إلى 1 × 106 خلايا / مل ، أعد تحفيز الخلايا عن طريق إضافة حبات تنشيط الخلايا التائية بنسبة 0.5: 1 حبات: خلية لكل بئر.
      ملاحظة: قد تتوسع الخلايا بسرعة. قد يلزم إجراء تغييرات نصف الوسائط ، وقد تحتاج الخلايا إلى نقلها إلى آبار أكبر.
    10. في اليوم 3 ، قم بإزالة حبات تنشيط الخلايا التائية.
    11. بعد مدة النمو المرغوبة ، احصد الخلايا.
      ملاحظة: إذا كانت هناك آبار غير مستخدمة في الكوفيت ، فيمكن تمييز الآبار المستخدمة ، ويمكن وضع الكوفيت بأكملها في شكل مخروطي سعة 50 مل وتخزينها عند 4 درجات مئوية للاستخدام في المستقبل.

النتائج

هنا ، تم دمج قالب متعدد السترونيك كبير (>6.3 كيلو بايت) يسمى "الدائرة الصغيرة العملاقة" في موضع TRAC في الخلايا التائية البشرية الأولية باستخدام تحرير CRISPR / Cas9. gRNA الخاص ب TRAC (TCTCTCAGCTGGTACACGGC) ، و UgRNA ، و HMEJ nanoplasmid (الشكل 2 أ) مع حالة تفتقر إلى gRNA الخاص ب TRAC ، و gRNA العالمي ، و Cas9 mRNA المستخدمة كعنصر تحكم سلبي. العينات التي تتضمن بناء Giant Minicircle ، و gRNA الخاص ب TRAC ، و gRNA العالمي ، و Cas9 mRNA كان لها متوسط معدل ضربة 23.35٪ عند قياس تعبير GFP (23.5٪ ± 5.247) ، بينما لم تظهر وحدة التحكم السلبية أي تعبير GFP (الشكل 2 ب). لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في توسيع الطية (الشكل 2 ج) والجدوى (الشكل 2 د) بين الظروف التجريبية. تظهر هذه النتائج ضربة عالية الكفاءة لقالب كبير جدا مع الحفاظ على بقاء الخلية الممتازة وتوسيع الخلية.

figure-results-1048
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لتصميم بناء HMEJ. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-1435
الشكل 2: توصيف الخلايا التائية المثقلة بالكهرباء باستخدام بنية الدائرة الصغيرة العملاقة. (أ) تمثيل تخطيطي لبناء الدائرة الصغيرة العملاقة ، وهو قالب كبير (>6.3 كيلو بايت) متعدد السيسترونيك يشفر CAR و RQR8 المضاد للميزوثيلين تحت مروج TRAC مع رابط GSG ، و CAR مضاد ل CD19 ، وكتم صوت DHFR و eGFP تحت مروج MND. (ب) نسبة تعبير RQR8 ، (ج) توسيع الطية ، و (د) صلاحية الخلايا التائية بعد تسعة أيام من التثقيب الكهربائي باستخدام بنية الدائرة الصغيرة العملاقة وكواشف CRISPR-Cas9 ، مقارنة بالتحكم السلبي الكهربائي مع الدائرة الصغيرة العملاقة التي تفتقر إلى كواشف CRISPR-Cas9. (*** ص < 0.001). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حجم اللوحةحجم كوفيتالخلايا / البئرحجم وسائط الاستردادحجم 1x TCM ث / NACإجمالي الحجم النهائي
طبق 24 بئر22/22 ميكرولتر1-3 س 106300 ميكرولتر680 ميكرولتر1 مل
6 آبار لوحة100/110 ميكرولتر4-20 س 1061 مل2.9 مل4 مل
24 بئر لوحة G-Rex20-110 ميكرولتر1-20 س 106400 ميكرولتر5.6 مل6 مل

الجدول 1: تركيزات الخلايا للكوفيت وألواح الاسترداد.

حجم كوفيتقالب البلازميدالموقع المستهدف gRNAالخطية البلازميد gRNACas9 mRNA
20 ميكرولتر1-2 ميكروغرام (1 ميكروغرام)1-3 ميكروغرام (1 ميكروجرام)1-3 ميكروغرام (1 ميكروجرام)1-3 ميكروغرام (1.5 ميكروغرام)
100 ميكرولتر5-10 ميكروغرام (5 ميكروغرام)5-15 ميكروغرام (5 ميكروغرام)5-15 ميكروغرام (5 ميكروغرام)5-15 ميكروغرام (5 ميكروغرام)

الجدول 2: كمية كواشف CRISPR / Cas9 وقالب الحمض النووي المطلوب.

Discussion

مع استمرار تطور العلاج بالخلايا بالتبني (ACT) ، هناك طلب متزايد على طرق فعالة وغير فيروسية لهندسة الخلايا المناعية دون التكلفة العالية والتعقيد المرتبطين بالنواقل القائمة على الفيروسات. يتمثل الهدف الرئيسي في هذا المجال في تحقيق التكامل الخاص بالموقع ، مما يحسن اتساق وسلامة ووظيفة المنتجات الخلوية الهندسية. في حين أظهرت الدراسات الحديثة تكاملا ناجحا غير فيروسي للتركيبات الجينية الصغيرة ، مثل جينات المراسل وتسلسلات CAR أو TCRالمفردة 29 ، هناك حاجة لتوسيع هذه الطرق لتشمل أشرطة تعبير أكبر ومتعددة الجينات. هذه الكاسيت الأكبر ضرورية لتعزيز وظيفة الخلايا المناعية ، مثل إضافة مستقبلات الكيموكين أو تدريع السيتوكين ، أو تحسين الخصوصية (على سبيل المثال ، أنظمة البوابة المنطقية) ، أو زيادة السلامة باستخدام مفاتيح القفل تحقيقا لهذه الغاية ، سعينا إلى تطوير مقاربات غير فيروسية قادرة على التكامل الفعال في موقع خاص بالبضائع الجينيةالأكبر 25.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في جميع أنحاء البروتوكول. مطلوب نانوبلازميد أو دائرة صغيرة عالية الجودة ونظيفة لتقليل السمية. في هذه الدراسة ، كان أداء البلازميدات المحضرة تجاريا أفضل. تعد فترة 36 ساعة بين تنشيط الخلايا التائية والتثقيب الكهربائي أمرا بالغ الأهمية أيضا للحصول على نتائج مثالية. من المهم أيضا تقليل التعامل مع الخلايا ومعالجتها مباشرة بعد التثقيب الكهربائي أثناء تعافي الخلايا. من المهم أيضا إعادة إضافة حبات تنشيط الخلايا التائية الجديدة إلى الثقافة بعد التثقيب الكهربائي لتحقيق أفضل تردد تكامل ممكن للشحنة وتوسيع الخلية.

يستخدم البروتوكول ، كما هو موضح هنا ، نظام التثقيب الكهربائي المتاح تجاريا (انظر جدول المواد). قد تكون أنظمة التثقيب الكهربائي الأخرى مناسبة أيضا ، ولكنها ستتطلب على الأرجح تحسين ظروف التثقيب الكهربائي الخاصة بالجهاز وربما التعامل مع خلايا ما بعد التثقيب الكهربائي.

هناك العديد من القيود على الهندسة بوساطة HMEJ للخلايا التائية البشرية. يمكن أن يعمل البروتوكول مع البلازميد ، لكن النتائج المثلى تتطلب استخدام البلازميدات النانوية أو الدوائر الصغيرة لتسليم البضائع ، والتي ليس من السهل تصنيعها مثل البلازميدات القياسية. علاوة على ذلك ، على الرغم من إثبات التكامل الناجح لشريط كاسيت كبير جدا متعدد السيسترونيك ، فمن المحتمل أن يكون هناك حد أعلى للشحن حيث سيبدأ تردد تكامل الجينات في الانخفاض.

تقدم هذه الدراسة HMEJ كطريقة قوية وفعالة لهندسة الجينوم غير الفيروسي لإنتاج الخلايا التائية المهندسة ، لا سيما في سياق العلاج المناعي للسرطان. من خلال التغلب على قيود النواقل الفيروسية التقليدية ، يوفر هذا النهج بديلا فعالا من حيث التكلفة وقابلا للتطوير وأكثر أمانا لتوليد الخلايا التائية المعدلة وراثيا مع وظائف محسنة. تفتح القدرة على دمج أشرطة الكاسيت الكبيرة متعددة الجينات بدقة إمكانيات جديدة لهندسة الخلايا المناعية لعلاج مجموعة واسعة من الأمراض ، بما في ذلك السرطانات والأمراض المعدية واضطرابات المناعة الذاتية. علاوة على ذلك ، فإن توافق طريقة HMEJ مع عمليات التصنيع السريرية يضمن قابليتها للتطبيق العملي في الإعدادات العلاجية في العالم الحقيقي ، مما يمهد الطريق لعلاجات قائمة على الخلايا يمكن الوصول إليها وكفاءة في المستقبل القريب.

Disclosures

B.R.W. و B.S.M. هما الباحثان الرئيسيان في اتفاقيات البحث التي ترعاها Intima Biosciences لدعم العمل في هذه المخطوطة. تم إيداع براءات اختراع تغطي الأساليب والأساليب الموضحة في هذه المخطوطة.

Acknowledgements

تعترف BW بالتمويل المقدم من مكتب الاكتشاف والترجمة ، ومنح المعاهد الوطنية للصحة R21CA237789 ، R21AI163731 ، P01CA254849 ، P50CA136393 ، U54CA268069 ، R01AI146009 ، وزارة الدفاع تمنح HT9425-24-1-1005 ، HT9425-24-1-1002 ، HT9425-24-1-0231 ، وصندوق أبحاث سرطان الأطفال ، وصندوق أبحاث فقر الدم Fanconi ، وصندوق راندي شيفر للسرطان والمجتمع. تعترف BSM بالتمويل المقدم من مكتب الاكتشاف والترجمة ، ومنح المعاهد الوطنية للصحة R01AI146009 و R01AI161017 و P01CA254849 و P50CA136393 و U24OD026641 و U54CA232561 و P30CA077598 و U54 CA268069 ، ومنح وزارة الدفاع HT9425-24-1-1005 ، و HT9425-24-1-1002 ، و HT9425-24-1-0231 ، وصندوق أبحاث سرطان الأطفال ، وصندوق أبحاث فقر الدم Fanconi ، وصندوق راندي شيفر للسرطان والمجتمع.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic AcidMillipore SigmaA6283
1x DPBS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14190144
2.5% CTS Immune Cell Serum ReplacementThermo Fisher ScientificA2596101
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofactor X Kit LLonzaV4XP-3024
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofactor X Kit SLonzaV4XP-3032
Bovine Serum AlbuminThermo Fisher Scientific15561020
Chemically Modified Guide RNAsIntegrated DNA TechnologiesnaCustom design
CleanCap Cas9 mRNATrilinkL-7206
CTS OpTmizer T cell Expansion Media SFM +OpTmizer T cell Expansion SupplementThermo Fisher ScientificA1048501
DNase IStem Cell Technologies07900
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 Thermo Fisher Scientific11141D
DynaMag-2Thermo Fisher Scientific12321D
Human IL15PeproTech200-15
Human IL2PeproTech200-02 
Human IL7PeproTech200-07
L-GlutamineThermo Scientific 25030081
Lonza 4D nucelofector CoreLonzaAAF-1003B
Lonza 4D nucelofector X UnitLonzaAAF-1003X
MinicircleSystem BiosciencesMN910A-1Custom design
N-Acetyl-L-cysteineMiliporeSigmaA9165
NanoplasmidAldevronnaCustom design
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15-140-122

References

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
  2. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature reviews. Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).
  3. Dotti, G., Gottschalk, S., Savoldo, B., Brenner, M. K. Design and development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing T cells. Immunol Rev. 257 (1), 107-126 (2014).
  4. DeRenzo, C., Gottschalk, S. Genetic modification strategies to enhance CAR T cell persistence for patients with solid tumors. Front Immunol. 10, 218 (2019).
  5. Liu, X., et al. A chimeric switch-receptor targeting PD1 augments the efficacy of second-generation CAR T cells in advanced solid tumors. Cancer Res. 76 (6), 1578-1590 (2016).
  6. Yeku, O. O., Purdon, T. J., Koneru, M., Spriggs, D., Brentjens, R. J. Armored CAR T cells enhance anti-tumor efficacy and overcome the tumor microenvironment. Sci Rep. 7 (1), 10541 (2017).
  7. Schober, K., et al. Orthotopic replacement of T-cell receptor α- and β-chains with preservation of near-physiological T-cell function. Nat Biomed Eng. 3 (12), 974-984 (2019).
  8. Roth, T. L., et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nature. 559 (7714), 405-409 (2018).
  9. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunol Rev. 290 (1), 127-147 (2019).
  10. Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science (New York, N.Y.). 348 (6230), 62-68 (2015).
  11. Campoli, M., Ferrone, S. HLA antigen and NK cell activating ligand expression in malignant cells: a story of loss or acquisition. Semin Immunopathol. 33 (4), 321-334 (2011).
  12. Walther, W., Stein, U. Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human diseases. Drugs. 60 (2), 249-271 (2000).
  13. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 53 (2021).
  14. Kumar, M., Keller, B., Makalou, N., Sutton, R. E. Systematic determination of the packaging limit of lentiviral vectors. Hum Gene Ther. 12 (15), 1893-1905 (2001).
  15. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu Rev Virol. 1 (1), 427-451 (2014).
  16. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature reviews. Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).
  17. Pomeroy, E. J., et al. a genetically engineered primary human natural killer cell platform for cancer immunotherapy. Mol Ther. 28 (1), 52-63 (2020).
  18. Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Sci Rep. 8 (1), 12144 (2018).
  19. Nguyen, D. N., et al. Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency. Nat Biotechnol. 38 (1), 44-49 (2020).
  20. Lock, D., et al. Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells. J Immunother Cancer. 10 (9), e005189 (2022).
  21. Semenova, N., et al. Multiple cytosolic DNA sensors bind plasmid DNA after transfection. Nucleic Acids Res. 47 (19), 10235-10246 (2019).
  22. Wimberger, S., et al. Simultaneous inhibition of DNA-PK and Polϴ improves integration efficiency and precision of genome editing. Nat Comm. 14 (1), 4761 (2023).
  23. Monjezi, R., et al. Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors. Leukemia. 31 (1), 186-194 (2017).
  24. Kay, M. A., He, C. -. Y., Chen, Z. -. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nat Biotechnol. 28 (12), 1287-1289 (2010).
  25. Webber, B. R., et al. Cas9-induced targeted integration of large DNA payloads in primary human T cells via homology-mediated end-joining DNA repair. Nat Biomed Eng. 8, 1553-1570 (2024).
  26. Williams, J. A., Paez, P. A. Improving cell and gene therapy safety and performance using next-generation Nanoplasmid vectors. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 494-503 (2023).
  27. Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. eLife. 9, 53968 (2020).
  28. Hendel, A., et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 33 (9), 985-989 (2015).
  29. Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR T cells. Front Immunol. 13, 867013 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved