通过同源介导的末端连接靶向整合大 DNA 模板对原代人 T 细胞进行非病毒工程改造

本文提供了使用 CRISPR/Cas9 技术 通过 同源介导的末端连接 （HMEJ） DNA 修复途径在原代人 T 细胞中实现大型多顺反子构建体的高效靶向敲入的详细方案。使用这种 cGMP 适应性方案设计的 T 细胞可保持出色的细胞扩增、细胞毒性和细胞因子产生。

目前许多过继细胞疗法依靠慢病毒或逆转录病毒载体来改造 T 细胞，使其表达嵌合抗原受体 （CAR） 或外源性 T 细胞受体 （TCR），以靶向特定的肿瘤相关抗原。依赖病毒载体生产治疗性 T 细胞显著增加了生产的时间、成本和复杂性，同时限制了新疗法的转化，尤其是在学术环境中。提出了一种使用 CRISPR/Cas9 和同源介导的末端连接对 T 细胞进行高效非病毒工程以实现大型多顺反子 DNA 货物的靶向整合的过程。这种方法已经实现了与病毒载体相当的整合频率，同时产生了能够在 体外 和 体内发挥有效抗肿瘤功效的高功能 T 细胞。值得注意的是，该方法可迅速适应当前的良好生产规范 （cGMP） 和临床放大，为生产用于临床试验的治疗性 T 细胞提供了近期选择。

T 细胞是适应性免疫系统的关键组成部分，具有直接溶细胞能力、通过产生细胞因子调节免疫反应的能力、B 细胞和树突状细胞的许可以及免疫记忆的建立¹。它们在免疫发育、体内平衡和监视、保护免受病原体侵害、预防和防御癌症以及过敏和自身免疫方面发挥着关键作用¹。T 细胞具有通过 V（D）J 重组产生的大量 T 细胞受体 （TCR），使 T 细胞能够识别大量抗原并针对各种病原体产生有效的免疫反应 ^1,2。T 细胞通常可分为两类，CD4 T 细胞，也称为辅助性 T 细胞，主要协助其他免疫细胞（如 B 细胞）协调免疫反应，以及 CD8 T 细胞或细胞毒性 T 细胞，通过识别其表面呈递的特定抗原直接杀死感染细胞或癌细胞¹。

嵌合抗原受体 （CAR） 的开发导致人们对用于免疫治疗的 T 细胞基因组工程的兴趣大幅增加。CAR 是工程化蛋白，可将抗体衍生的抗原结合结构域与 T 细胞信号转导结构域合并，使 T 细胞能够识别和靶向表达 CAR 抗体部分识别的特异性表位的细胞³。这些受体已用于多种免疫疗法，包括传染病和自身免疫，但该技术在癌症免疫疗法中最为先进。

CAR-T 细胞在治疗白血病和淋巴瘤方面非常成功，但在治疗实体瘤方面的疗效有限 ^4,5。这导致了一波进一步的发展浪潮，旨在提高 CAR-T 细胞对实体瘤适应症的有效性。已经开发了多种方法，包括细胞因子装甲、检查点基因敲除、显性负受体、趋化因子受体、在一个细胞中表达多个 CAR、修饰 CAR 以增强细胞内信号传导，以及整合到预定基因座（例如 TRAC 基因座）中，以利用宿主调节机制来防止耗竭 ^6,7,8.其中许多方法需要更大的遗传货物和/或特定位点的整合。替代方法还包括使用转基因 TCR 使 T 细胞靶向细胞内新抗原 ^9,10。然而，这有一个明显的缺点，即要求 TCR 对新抗原表位和 HLA 分子都具有特异性，从而限制了最终治疗产品的使用于表达同源 HLA 的患者。此外，许多肿瘤在免疫治疗后会改变或减少 HLA 表达，大大降低了表达转基因 TCR 的 T 细胞的有效性¹¹。

临床试验中的大多数 CAR-T 或 TCR-T 细胞疗法都是使用逆转录病毒载体（如慢病毒或 γ 逆转录病毒）制造的，与中等大小的货物实现了高整合频率。然而，由于当前的良好生产规范 （cGMP） 要求和非特异性整合谱，病毒载体的生产时间较长，这会产生插入诱变的风险^12,13。此外，如果货物超过 5 kb¹⁴，则可能难以生产高滴度的转基因逆转录病毒。其他载体，例如源自重组腺相关病毒 （rAAV） 的载体，不能自然整合，但可以将 DNA 供体模板穿梭到细胞核，并且可以与 CRISPR/Cas9 结合使用，以促进传统的同源定向重组 （HDR） 介导的基因组工程。然而，这些病毒也具有漫长而复杂的生产工作流程，并且受到货物大小 （<4.7 kb） 和需要包含长同源臂 （500-1000 bp） 的限制15,16,17,18。

在原代人淋巴细胞中，使用转座子或靶向核酸酶和 DNA 供体模板的组合进行非病毒基因组工程已有报道 ^8,19,20。然而，这些方法受到淋巴细胞中表达的细胞质 DNA 传感器识别后对细胞质中裸 DNA 分子的毒性反应的限制²¹。已经尝试在转染过程中使用这些 DNA 感应通路的小分子抑制剂，但这些通路的冗余可能会使它们在 cGMP 方案中的使用复杂化²²。值得注意的是，转座子载体，如 Sleeping Beauty、PiggyBac 和 Tc Buster，允许高效整合大型遗传货物，但具有非特异性整合特征^23,24。使用质粒、线性或单链 DNA 模板与 HDR 靶向核酸酶相结合的非病毒靶向转基因整合是一种有吸引力的替代方案，但受到效率低的限制，尤其是在遗传货物越来越大的情况下，当使用超过 1.5 kb 的货物时，据报道效率低于 10% ^8,19。

在这里，我们提出了在原代人 T 细胞中插入大 DNA 有效载荷的非病毒、同源介导的末端连接 （HMEJ） 的分步方案，如 Webber、Johnson 等人所述。²⁵. 与传统 HDR 相比，HMEJ 利用 48 bp 短同源臂，两侧是 Cas9 gRNA 靶位点，可实现大 DNA 货物的高效靶向整合。降低原代 T 细胞中质粒 DNA 细胞毒性的一种方法是使用骨架最小的质粒，例如小圆圈或纳米质粒²⁵。小圆圈是通过质粒扩增后通过重组切除复制起点和抗生素抗性基因而产生的小型化质粒载体;它们已被证明可以改善 T 细胞的非病毒工程并降低细胞毒性^23,24。纳米质粒还通过使用最小的复制起点和非传统选择标记来实现整体尺寸减小²⁶。根据我们的经验，与传统质粒相比，minicircle 和纳米质粒载体平台在效率和毒性降低方面具有相当的改进²⁵。

在这里，我们提出了一个详细的方案，该方案协同试剂递送和试剂组成的时间优化，以及使用 HMEJ 和 CRISPR/Cas9 实现原代人类 T 细胞的高效、位点特异性基因组工程，具有大 （>6.3 kb） 的多顺反子 DNA 模板，用于免疫疗法和各种其他应用²⁵.与使用 1 kb 同源臂的传统 HR 相比，我们与 HMEJ 和 48 bp 同源臂实现了更高的整合度，特别是与遗传货物 >1.5 kb^25,27。重要的是，通过 HMEJ 修复改造的 T 细胞保留了出色的细胞扩增、细胞毒性和细胞因子产生，同时保留了未耗竭的表型²⁵。该方案易于适应 cGMP 标准，并可扩展到临床相关的细胞数量，从而能够快速过渡到未来在各种临床试验中使用²⁵。

所有实验均采用针对血源性病原体的通用预防措施、无菌/无菌技术、个人防护设备和适当的生物安全 2 级 （BSL2） 设备。此处描述的所有实验均已获得明尼苏达大学机构生物安全委员会 （IBC） 的批准。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 培养基制备

1. 为 T 细胞完全培养基 （TCM） 准备补充剂。
   1. 通过添加过滤灭菌的 100 mM 乙酸，将重组人 IL-2 重构至浓度为 12000 IU/mL，并通过移液充分混合。然后，用过滤灭菌的 0.2% 牛血清白蛋白 （BSA） 在 1x 磷酸盐缓冲盐水 （1x PBS） 中进一步稀释至 6000 IU/mL 的浓度，并通过移液充分混合，制成延长储存溶液。
   2. 用无菌水将重组人 IL-7 重构至浓度为 200 ng/μL，并通过移液充分混合。然后，用过滤灭菌的 0.2% BSA PBS 溶液进一步稀释至 100 ng/μL 浓度，并通过移液充分混合，制成延长储存溶液。
   3. 用无菌水将重组人 IL-15 重构至浓度为 200 ng/μL，并通过移液充分混合。然后，用过滤灭菌的 0.2% BSA PBS 溶液进一步稀释至 100 ng/μL 浓度，并通过移液充分混合，制成延长储存溶液。
      注：将每种细胞因子分成小份，在 -20 °C 至 -80 °C 下保存长达六个月，并避免重复冻融循环。
2. 准备 TCM 培养基。
   1. 向 T 细胞扩增基础培养基中加入 2.6% T 细胞扩增添加剂和 2.5% 免疫细胞血清替代物，制备基础培养基。有关详细信息 ，请参阅材料表 。
      1. 通过向基础培养基中添加 1% L-谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素、10 mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、300 IU/mL 重组人 IL-2、5 ng/mL 重组人 IL-7 和 5 ng/mL 重组人 IL-15 来制备中药。
      2. 通过将培养基通过 0.22 μm 过滤器进入无菌培养基瓶中来对 TCM 进行灭菌。
      3. 将 TCM 保持在 4 °C 长达 2 周。
3. 准备恢复介质。
   1. 通过在 T 细胞扩增基础培养基中加入 2.6% T 细胞扩增添加剂和 2.5% 免疫细胞血清替代物来制备基础培养基。
      1. 向基础培养基中加入 1% L-谷氨酰胺、10 mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、300 IU/mL 重组人 IL-2、5 ng/mL 重组人 IL-7、5 ng/mL 重组人 IL-15 和 1 μg/mL DNase 来制备回收培养基。
         注：请勿将青霉素/链霉素添加到 Recovery 培养基中，因为它会降低电穿孔后细胞的回收率。
      2. 将培养基通过 0.22 μm 过滤器放入灭菌培养基瓶中，对 Recovery 培养基进行消毒。
      3. 将 Recovery 培养基在 4 °C 下保存长达 2 周。

2. 敲入式站点选择和模板设计

1. 确定敲入的基因组靶标位置。
   注：如果希望对目标单元的影响最小，则可以使用安全港位置，例如 AAVS1。破坏基因表达的靶位点可用于在单个步骤中同时敲除靶基因和敲入目标构建体。旨在与内源基因整合的靶位点和供体可用于创建基因融合，或与 2A 核糖体跳跃序列结合使用，以将构建体置于内源性启动子的转录控制下（图 1）。
2. 设计货物模板，使表达盒的两侧是与整合位点匹配的 48 bp 同源臂，两侧是线性化 gRNA 靶位点。
   注意：质粒线性化 gRNA 可以是通用 gRNA²⁸ （UgRNA） （GGGAGGCGUUCGGGCCACAG），旨在靶向人类或小鼠基因组²⁵ 中未发现的序列 （GGGAGGCGTTCGGGCCACAG），或基因组靶 gRNA 序列，使得单个 gRNA 可以在基因组敲入位点切割，并且还可以线性化货物模板（图 1).纳米质粒或小圆圈都可以用作 cargo 模板的载体。对于某些转化的细胞系，标准质粒可以代替纳米质粒或小圆圈，但会导致更敏感的原代细胞（如 T 细胞）的敲入和细胞扩增减少。

3. T 细胞分离和活化

1. 从商业供应商处获取 T 细胞，或使用免疫磁性分选从 PBMC 中分离 T 细胞¹⁸。
2. 确定实验所需的 T 细胞数量，然后在 TCM 中以 1 ×^{10 6} 个细胞/mL 的浓度解冻、洗涤和重悬 T 细胞。将 1 mL 这种混合物添加到 24 孔板的孔中。
   1. 涡旋 T 细胞活化珠以重悬珠子，并以 2：1 珠子：细胞的比例向每个孔中加入珠子。在开始 T 细胞工程之前，将这些细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 培养箱中孵育 36 小时。
      注：活化后孵育时间小于或大于 36 小时会降低 T 细胞敲入效率、活力和工程后细胞扩增²⁵。

4. T 细胞工程

1. 确定完成实验所需的实验条件，包括实验对照。
   注意：重要的是包括仅质粒条件作为游离型表达的对照。在没有质粒供体的情况下，具有化学修饰的靶位点 gRNA²⁸ 和/或 Cas9 mRNA 的电穿孔条件也可用作阴性对照。
2. 准备恢复板。
   1. 对于每种实验条件，包括实验对照，将 300 μL 回收培养基添加到 24 孔组织培养板的孔中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 培养箱中加热板。
      注：有关替代细胞数量、回收量和条件，请参见 表 1 。
3. 准备 T 细胞。
   1. 收获刺激的 T 细胞/T 细胞活化珠混合物，计数活细胞，并在 1.5 mL 微量离心管中以 1-5 ×^{10 6} 个细胞/mL 的浓度在 TCM 培养基中重悬 T 细胞/T 细胞活化珠。
   2. 将微量离心管放入磁铁中（参见 材料表）并孵育 3 分钟。
      注：如果使用 T 细胞活化珠激活 T 细胞，则需要去除磁珠。如果使用其他活化方法，则可能不需要去除磁珠。
   3. 孵育后，无需从磁力架上取下，将培养基和 T 细胞转移到新试管中。该管包含去除了 T 细胞活化珠的刺激 T 细胞。重新计数 T 细胞并将它们放入 14 mL 或 50 mL 锥形管中。用 1× PBS 加满管子，并将细胞保存在 37 °C 和 5% CO₂ 培养箱中，直到准备离心。
4. 准备 T 细胞混合物。
   1. 通过将电穿孔条件的数量乘以 1 （n + 1） 来确定所需的预混缓冲液（82% 原代细胞溶液和 18% 添加剂）的量。（例如，计划了 6 个电穿孔条件 + 1 = 7。7 × 18 μL 每个条件 = 126 μL 预混液缓冲液）。
      注：这些体积特定于本研究中使用的 4D 电穿孔系统（参见 材料表）。其他电穿孔系统需要不同的体积和浓度。原代细胞溶液的体积 = 所需预混缓冲液的总体积 × 0.82，添加剂体积 = 所需预混缓冲液的总体积 x 0.18。（例如，0.82 × 126 μL = 103.32 μL 原代细胞溶液和 0.18 × 126 μL = 22.68 μL）。
   2. 将原代细胞溶液和添加剂混合在一起，制成预混缓冲液。
   3. 将 T 细胞在 1x PBS 中以 200 × g （室温）离心 10 分钟，然后吸出上清液。
   4. 在预混缓冲液中重悬 T 细胞，浓度为每 18 μL 预混缓冲液 1 × 10⁶ 个细胞。
5. 准备试剂。
   1. 使用储备溶液的浓度，确定每次电穿孔达到指定质量所需的 HMEJ 质粒、靶位点 gRNA、质粒线性化 gRNA （UgRNA） 和 Cas9 mRNA 的体积（表 2）。
   2. 对于每种情况，将试剂添加到冰上 96 孔板的孔中。
6. 制备电穿孔混合物。
   1. 根据需要向 96 孔板的每个孔中加入 18 μL T 细胞混合物。
   2. 根据需要添加额外的预混液缓冲液，以确保所有电穿孔条件的最终总体积为 22 μL。
      注：22 μL 体积包括 10% 的超量体积，以解决潜在的移液损失。
7. 进行电穿孔。
   1. 打开设备并加载程序。
   2. 确定所需的比色皿数量并打开所需数量的比色皿。在比色皿和盖子的一端做标记，然后从比色皿上取下盖子。
      注：每个比色皿有 16 个孔，可用于 20 μL 反应。
   3. 从 96 孔板的孔中轻轻吸取 20 μL 电穿孔混合物 1-2 次，然后装入比色皿。
   4. 使用步骤 4.7.2 中的标记重新盖上比色皿，以避免将盖子向后打开。轻敲比色皿 3-5 次以去除潜在的气泡，然后放置设备并电穿孔比色皿。
   5. 轻轻地从设备中取出比色皿，将其放入罩中，让细胞在室温下静置 15 分钟。
   6. 其余部分后，从回收板中取出 80 μL 加热的回收培养基并添加到每个样品中（添加到比色皿的侧面，而不是直接添加到细胞中），非常轻柔地上下移液一次，然后将总体积的 100 μL 转移回回收板。
      注：细胞在电穿孔后非常脆弱。轻柔的处理至关重要。
   7. 将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 30 分钟。
   8. 加入 TCM 将细胞稀释至 1 × 10⁶ 个细胞/mL 的浓度。在实验期间，第二天更换一半的培养基，然后每 3-4 天更换一次细胞因子浓度为 2× 的 TCM。
   9. 稀释至 1 ×^{10 6} 个细胞/mL 后，以 0.5：1 珠子：细胞的比例向每个孔中加入 T 细胞活化珠，以重新刺激细胞。
      注意：细胞可能正在迅速扩增。可能需要更换一半培养基，并且可能需要将细胞移至更大的孔中。
   10. 第 3 天，去除 T 细胞活化珠。
   11. 在所需的生长持续时间后，收获细胞。
       注意：如果比色皿中有未使用的孔，则可以标记用过的孔，并将整个比色皿放入 50 mL 锥形瓶中并储存在 4 °C 以备将来使用。

在这里，使用 CRISPR/Cas9 编辑将称为“巨型迷你圆”构建体的大 （>6.3 kb） 多顺反子模板整合到原代人类 T 细胞的 TRAC 基因座中;TRAC 特异性 gRNA （TCTCTCAGCTGGTACACGGC）、UgRNA 和 HMEJ 纳米质粒（图 2A），缺乏 TRAC 特异性 gRNA、通用 gRNA 和 Cas9 mRNA 用作阴性对照。包括巨型小圆圈构建体、 TRAC 特异性 gRNA、通用 gRNA 和 Cas9 mRNA 的样品在测量 GFP 表达时的平均敲入率为 23.35%（23.5% ± 5.247），而阴性对照显示没有 GFP 表达（图 2B）。实验条件之间的倍数扩展（图 2C）和活力（图 2D）没有显着差异。这些结果表明，非常大的模板可以高效敲入，同时保持出色的细胞活力和细胞扩增。

图 1：HMEJ 结构设计示意图。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：使用巨型小圆圈构建体电穿孔的 T 细胞的表征。 （A） 巨型迷你圆圈构建体的示意图，一个大 （>6.3 kb） 多顺反子模板，在 TRAC 启动子下编码抗间皮素 CAR 和 RQR8，带有 GSG 接头、抗 CD19 CAR 和 DHFR mutein 和 eGFP。（B） 与使用缺乏 CRISPR-Cas9 试剂的巨型迷你圈电穿孔的阴性对照相比，使用巨型小圆圈构建体和 CRISPR-Cas9 试剂电穿孔 9 天后 T 细胞的 RQR8 表达百分比、（C） 倍数扩增和 （D） 活力。（***p < 0.001）。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1：比色皿和回收板的细胞浓度。

表 2：所需的 CRISPR/Cas9 试剂和 DNA 模板量。

随着过继细胞疗法 （ACT） 的不断发展，对高效、非病毒方法来改造免疫细胞的需求越来越大，而不会出现与基于病毒的载体相关的高成本和复杂性。该领域的一个关键目标是实现特定于站点的集成，从而提高工程蜂窝产品的一致性、安全性和功能。虽然最近的研究表明小基因构建体（如报告基因和单个 CAR 或 TCR 序列）的成功非病毒整合²⁹，但有必要将这些方法扩展到更大的多基因表达盒。这些较大的细胞盒对于增强免疫细胞功能（例如添加趋化因子受体或细胞因子装甲）、提高特异性（例如逻辑门系统）或通过终止开关提高安全性是必需的。为此，我们寻求开发能够对更大的遗传货物进行有效位点特异性整合的非病毒方法²⁵。

整个协议有几个关键步骤。需要高质量、干净的纳米质粒或小圆圈以尽量减少毒性。在这项研究中，市售质粒表现最佳。T 细胞活化和电穿孔之间的 36 小时时间对于理想结果也至关重要。在细胞恢复期间，在电穿孔后立即尽量减少细胞处理和作也很重要。在电穿孔后，将新的 T 细胞活化珠重新添加到培养物中，以实现最佳的货物整合频率和细胞扩增也很重要。

如此处所述的协议使用市售的电穿孔系统（参见 材料表）。其他电穿孔系统也可能适用，但它们可能需要优化特定于设备的电穿孔条件，并且可能需要电穿孔后细胞处理。

HMEJ 介导的人类 T 细胞工程有几个局限性。该方案可以与质粒一起使用，但最佳结果需要使用纳米质粒或小圆圈进行货物递送，它们不像标准质粒那样容易制造。此外，尽管证明了非常大的多顺反子盒的成功整合，但可能存在一个货物上限，基因整合频率将开始下降。

本研究将 HMEJ 描述为一种强大而高效的非病毒基因组工程方法，用于生产工程化 T 细胞，尤其是在癌症免疫治疗的背景下。通过克服传统病毒载体的局限性，这种方法为生成具有增强功能的转基因 T 细胞提供了一种经济高效、可扩展且更安全的替代方案。精确整合大型多基因盒的能力为工程免疫细胞治疗多种疾病（包括癌症、传染病和自身免疫性疾病）开辟了新的可能性。此外，HMEJ 方法与临床级制造工艺的兼容性确保了其在现实世界治疗环境中的实际适用性，为在不久的将来更可及和更高效的基于细胞的疗法铺平了道路。

B.R.W. 和 B.S.M. 是由 Intima Biosciences 资助的赞助研究协议的首席研究员，以支持本手稿中的工作。已申请专利，涵盖本手稿中概述的方法和途径。

B.R.W. 感谢来自发现和翻译办公室、NIH 赠款 R21CA237789、R21AI163731、P01CA254849、P50CA136393、U54CA268069、R01AI146009、DOD 赠款 HT9425-24-1-1005、HT9425-24-1-1002、HT9425-24-1-0231 以及儿童癌症研究基金、范可尼贫血研究基金和 Randy Shaver 癌症和社区基金。BSM 感谢来自发现和翻译办公室、NIH 赠款 R01AI146009、R01AI161017、P01CA254849、P50CA136393、U24OD026641、U54CA232561、P30CA077598、U54 CA268069、DOD 赠款 HT9425-24-1-1005、HT9425-24-1-1002、HT9425-24-1-0231 以及儿童癌症研究基金、范可尼贫血研究基金和 Randy Shaver 癌症和社区基金。